史麗，郁春艷，李巖，許現(xiàn)輝，楊棟林，沈洋洋，鄧為民

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，國(guó)家教育部免疫微環(huán)境與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070；2.協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司，天津300384；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院，天津300020）

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是成體干細(xì)胞的一種，具有自我更新、高度增殖和多向性分化潛能[1-2]。研究表明MSCs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、糖尿病等疾病的治療中應(yīng)用前景廣闊[3-10]。目前，骨髓被認(rèn)為是MSCs的經(jīng)典來(lái)源，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenehymal stem cells，HUCMSCs）因具有數(shù)量豐富、繁殖力強(qiáng)、安全可靠、免疫原性低、治療疾病種類多、取材方便等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是替代骨髓源MSCs的理想選擇[11-13]。然而在臍帶采集過程中，臍帶污染的風(fēng)險(xiǎn)較高，因此如何控制臍帶污染成為HUCMSCs應(yīng)用中一個(gè)亟待解決的問題。本研究對(duì)臍帶間充質(zhì)公共庫(kù)386份微生物培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行鑒定和藥敏分析，選擇敏感性較高的抗生素加入培養(yǎng)基中，觀察其對(duì)HUCMSCs生長(zhǎng)、增殖和多向誘導(dǎo)分化的影響，為臍帶采集液中抗生素的合理添加提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株來(lái)源為386份臍帶采集液微生物培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本。天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院采集的1 562份臍帶，放入臍帶采集液中保存，送至臍帶間充質(zhì)公共庫(kù)；HUCMSCs由臍帶間充質(zhì)公共庫(kù)提供。

1.2 儀器 BacT/Alert 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀（法國(guó)梅里埃公司）；ATB微生物鑒定及藥敏分析儀（法國(guó)梅里埃公司）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo）；超凈工作臺(tái)（北京冠鵬凈化設(shè)備有限公司）；OLYMPUS倒置顯微鏡X70（日本OLYMPUS公司）；MultiskanTM FC型酶標(biāo)儀（Thermo）；Fj-2008全自動(dòng)免疫計(jì)數(shù)儀（西安262廠）。

1.3 試劑與藥品 BacT/Alert系統(tǒng)專用需氧厭氧瓶（法國(guó)梅里埃公司）；血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、沙保羅瓊脂培養(yǎng)基（天津金正公司）；API系統(tǒng)的細(xì)菌鑒定卡與藥敏試驗(yàn)卡（法國(guó)梅里埃公司）；細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM∶F12=1∶1）（GIBCO公司）；青霉素（GIBCO公司）；兩性霉素B（GIBCO公司）；頭孢西丁、臺(tái)盼藍(lán)、地塞米松、吲哚美辛、油紅O、β-磷酸甘油、2-磷酸-L-抗壞血酸和胰島素（Sigma公司）。

1.4 方法

1.4.1 微生物鑒定和藥敏 臍帶采集后放入臍帶采集液中保存，然后送至臍帶間充質(zhì)庫(kù)。注射器抽取12 mL臍帶采集液，需氧瓶、厭氧瓶各6 mL進(jìn)行微生物培養(yǎng)。凡系統(tǒng)報(bào)告為陽(yáng)性瓶時(shí)，應(yīng)從菜單擴(kuò)展功能項(xiàng)進(jìn)入觀察曲線狀態(tài)，并及時(shí)轉(zhuǎn)種血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、沙保羅瓊脂培養(yǎng)基，置恒溫孵箱35℃培養(yǎng)18~24 h。按照標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，將細(xì)菌或真菌制成菌懸液，接種于相應(yīng)的鑒定卡和藥敏卡，35℃溫箱培養(yǎng)18~24 h，其中ATB STAPH藥敏卡需培養(yǎng)48 h，讀取結(jié)果。

1.4.2 HUCMSCs形態(tài)、生長(zhǎng)和增殖情況 根據(jù)細(xì)菌及真菌的鑒定和藥敏結(jié)果選擇頭孢西丁、青霉素、兩性霉素B。隨機(jī)選取10份標(biāo)本觀察加入的抗生素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖是否有影響。將已培養(yǎng)2~3 d生長(zhǎng)旺盛的HUCMSCs，用0.25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液（D培養(yǎng)液）將其稀釋成1×104/mL，加入24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，置于37℃的5%二氧化碳培養(yǎng)箱中24 h后，吸出培養(yǎng)液。分組處理如表1。倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞培養(yǎng)4 d后的形態(tài)。再更換培養(yǎng)液第0、1、3、5、7天臺(tái)盼藍(lán)染色作活體計(jì)數(shù)，10份標(biāo)本取均值繪制HUCMSCs的生長(zhǎng)曲線。

1.4.3 HUCMSCs體外向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化 按1.4.2 分5組，取第3代HUCMSCs，按每孔1×104/mL細(xì)胞濃度接種于6孔板中，按表1分組加入抗生素。待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)分別更換為加入成脂誘導(dǎo)液（1μmol/L地塞米松+100μmol/L吲哚美辛+10 mg/L胰島素+0.5 mmol/L1-甲基-3-異丁基黃嘌呤）的D培養(yǎng)液。每3 d或4 d換液1次，連續(xù)誘導(dǎo)3周，去除含誘導(dǎo)液的D培養(yǎng)液，PBS洗滌液洗滌2次，用多聚甲醛固定，油紅O染色。另設(shè)一空白對(duì)照孔為a組，也按每孔1×104/mL細(xì)胞濃度接種于6孔板中，只加D培養(yǎng)液，不加誘導(dǎo)液，油紅O染色。加入異丙醇作用10 min，洗脫細(xì)胞內(nèi)的脂滴，轉(zhuǎn)移到96孔板，酶標(biāo)儀490 nm處讀取OD值。

1.4.4 HUCMSCs向骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化 按1.4.2分5組，取第3代HUCMSCs，按每孔1×104/mL細(xì)胞濃度接種于6孔板中，用D培養(yǎng)液培養(yǎng)，按表1分組加入抗生素。待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)分別更換為加入成骨誘導(dǎo)液（0.1μmol/L地塞米松+10 mmol/Lβ-磷酸甘油+50μmol/L 2-磷酸-L-抗壞血酸）的D培養(yǎng)液。每3 d或4 d換液一次，連續(xù)誘導(dǎo)4周，其他處理同步驟1.4.3，茜素紅染色。另設(shè)一空白對(duì)照孔為a組，也按每孔1×104/mL細(xì)胞濃度接種于6孔板中，只加D培養(yǎng)液，不加誘導(dǎo)液，茜素紅染色。

收集成骨誘導(dǎo)分化4周后的細(xì)胞培養(yǎng)基，采用放射免疫法檢測(cè)各組培養(yǎng)基中骨鈣素含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 污染菌分布和藥敏 微生物培養(yǎng)陽(yáng)性的386份臍帶采集液，共檢出細(xì)菌及真菌438株。其中革蘭陰性菌193株（44.1%），主要為大腸埃希菌；革蘭陽(yáng)性菌210株（48.0%），主要為腸球菌，其次是葡萄球菌和鏈球菌；真菌35株（8.0%），主要為白假絲酵母菌。轉(zhuǎn)種后檢出的主要污染菌分布見圖1。其中，4例轉(zhuǎn)種未生長(zhǎng)判定為假陽(yáng)性。56例轉(zhuǎn)種發(fā)現(xiàn)有兩種微生物污染，其中剖腹產(chǎn)10份，順產(chǎn)46份。未發(fā)現(xiàn)2種以上微生物污染的情況。臍帶采集液主要檢出菌對(duì)3種抗生素的敏感率見表2。

表2 臍帶采集液主要檢出菌對(duì)抗生素的敏感率Tab 2 Sensitivity rate of main bacteria detected in umbilical cord collection fluid to antibiotics

2.2 HUCMSCs形態(tài) 各組細(xì)胞培養(yǎng)4 d后的形態(tài)顯示：試驗(yàn)組c組、d組、e組和f組細(xì)胞形態(tài)良好，為梭形和多角形，渦旋狀排列生長(zhǎng)，并可見圓形分裂細(xì)胞，表明細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞折光性強(qiáng)，與對(duì)照b組相似（圖2）。各組進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線（圖3），各組加抗生素分別與不加抗生素對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.57）。結(jié)果表明頭孢西丁、青霉素、兩性霉素B和頭孢西丁+青霉素+兩性霉素B對(duì)HUCMSCs生長(zhǎng)和增殖無(wú)顯著影響。

圖2 各組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)4 d后的形態(tài)（40×）Fig 2 Morphology of HUCMSCsin each group after 4 daysof culture（40×）

圖3 各組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖情況的比較Fig 3 Comparison of theproliferation of HUCMSCsin each group

2.3 HUCMSCs向脂肪細(xì)胞分化 顯微鏡下可見細(xì)胞胞漿中充滿明亮橙紅色油滴。試驗(yàn)組b組、c組、d組、e組和f組與對(duì)照組a組無(wú)明顯差別（圖4）。酶標(biāo)儀定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴，加抗生素各組分別與不加抗生素對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.89）。

圖4 各組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化潛能Fig 4 Theadipogenic differentiation ability of HUCMSCsin each group

2.4 HUCMSCs向骨分化 顯微鏡下可見紅色骨結(jié)節(jié)。試驗(yàn)組b組、c組、d組、e組和f組與對(duì)照組a組無(wú)明顯差別（圖5）。檢測(cè)各組培養(yǎng)基中骨鈣素含量，各組加抗生素分別與不加抗生素對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.71）。

圖5 各組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化潛能Fig 5 Theosteogenic differentiation ability of HUCMSCsin each group

3 討論

本研究通過對(duì)386份臍帶采集標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，共檢出細(xì)菌及真菌438株。其中革蘭陰性菌193株（44.1%），主要為大腸埃希菌；革蘭陽(yáng)性菌210株（48.0%），主要為腸球菌，其次是葡萄球菌和鏈球菌；真菌35株（8.0%），主要為白假絲酵母菌。

細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)常出現(xiàn)污染現(xiàn)象，常在培養(yǎng)基中加青霉素和鏈霉素預(yù)防污染[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌對(duì)頭孢西丁的敏感率為90.3%，腸球菌、葡萄球菌、鏈球菌對(duì)青霉素的敏感率分別為93.1%、19.7%、92.9%，真菌對(duì)兩性霉素B的敏感率為100%。因此，保存臍帶的采集液中加入頭孢西丁、青霉素和兩性霉素B，可有效減少臍帶污染。

HUCMSCs的生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞形態(tài)均反映頭孢西丁、青霉素、兩性霉素B和三者混合使用（終濃度均為16 mg/L）對(duì)HUCMSCs生長(zhǎng)和增殖無(wú)影響，也不影響HUCMSCs經(jīng)誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞分化和向骨細(xì)胞的分化。頭孢西丁的藥理機(jī)制是通過與一個(gè)或多個(gè)青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）結(jié)合，抑制細(xì)菌分裂活躍的細(xì)胞的細(xì)胞壁生物合成，從而起抗菌作用。青霉素所含的青霉烷能使細(xì)菌細(xì)胞壁的合成發(fā)生障礙，導(dǎo)致細(xì)菌溶解死亡。兩性霉素B為多烯類抗真菌抗生素，通過影響細(xì)胞膜通透性發(fā)揮抑制真菌生長(zhǎng)的作用。人體細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜，頭孢西丁、青霉素均作用于細(xì)胞壁，故不損害人體細(xì)胞。本研究結(jié)果提示16 mg/L頭孢西丁和青霉素對(duì)HUCMSCs形態(tài)、生長(zhǎng)、增殖和誘導(dǎo)分化無(wú)影響；16 mg/L兩性霉素B既能抑制真菌生長(zhǎng)，又對(duì)HUCMSCs形態(tài)、生長(zhǎng)、增殖和誘導(dǎo)分化無(wú)影響。與黃文敬等[15]研究認(rèn)為兩性霉素B在劑量高于30 mg/L時(shí)才有細(xì)胞毒性結(jié)果一致。

綜上，本研究證實(shí)，保存臍帶的采集液中加入頭孢西丁、青霉素和兩性霉素B（終濃度均為16 mg/L），可有效減少臍帶采集細(xì)菌和真菌污染，很大程度上避免臍帶HUCMSCs因被污染而廢棄。本研究可為臍帶采集液中抗生素的合理添加提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為HUCMSCs的應(yīng)用提供保障。