趙夕琛，靳育靜，孫曉薇，李代清，朱鐵虹

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝科,天津300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院代謝病科,天津300134）

人胰島淀粉樣多肽（hIAPP）是胰島β細(xì)胞分泌的淀粉樣物質(zhì)，也稱為人胰淀素[1-3]。已有研究表明，hIAPP聚集過(guò)程的中間產(chǎn)物對(duì)胰島細(xì)胞具有毒性作用，且為2型糖尿病患者胰島細(xì)胞功能異常及凋亡的主要原因之一[4-7]，而臨床上尚缺乏能有效抑制hIAPP聚集的藥物。最近研究表明，利拉魯肽可以減少阿爾茲海默病模型鼠腦內(nèi)的Aβ淀粉樣蛋白沉積與相關(guān)炎癥反應(yīng)，改善鼠的記憶功能[8-9]。Aβ與hIAPP具有相似的二級(jí)折疊結(jié)構(gòu)與致病機(jī)制。因此本研究主要探討利拉魯肽是否可以通過(guò)抑制hIAPP聚集并減少hIAPP相關(guān)的胰島細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 250～300 g雄性Wistar大鼠購(gòu)自中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物級(jí)別為SpF級(jí)。

1.2 主要試劑 膠原酶（Ⅴ型）、hIAPP購(gòu)自Sigma公司；Annexin-V/PI熒光染色試劑盒購(gòu)自萬(wàn)類生物有限公司；利拉魯肽注射液由諾和諾德公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 硫磺素T實(shí)驗(yàn) 新鮮配置硫磺素T、hIAPP的母液，分別為1 mmol/L與100μmol/L。在黑色96孔酶標(biāo)板中，每孔中加入相應(yīng)體積的母液和PBS緩沖液構(gòu)建100μL反應(yīng)體系：硫磺素T終濃度為10μmol/L，hIAPP終濃度為5μmol/L，單獨(dú)或聯(lián)合相應(yīng)濃度利拉魯肽（500 nmol/L和5μmol/L）共同孵育。酶標(biāo)板中的體系液按照上述比例配置完畢后，置于全波長(zhǎng)掃描多功能讀數(shù)儀上，37℃孵育。每5 min搖10 s，靜置10 s后讀數(shù)，記錄在440 nm激發(fā)波長(zhǎng)和485 nm發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度。每組設(shè)立4個(gè)復(fù)孔，本底孔為未加藥物僅含硫磺素T的檢測(cè)液，各組最終熒光強(qiáng)度為實(shí)測(cè)熒光數(shù)值與本底孔熒光數(shù)值的差值。

1.3.2 磷鎢酸負(fù)染滴染法電鏡實(shí)驗(yàn) 于EP管中分別配置3組體系：20μmol hIAPP（人胰淀素）、20μmol hIAPP和2μmol利拉魯肽、20μmol hIAPP和20μmol利拉魯肽。將反應(yīng)液室溫過(guò)夜后，在37℃溫箱中孵育2 h后，取20μL待檢測(cè)的孵育樣品滴在200目-碳包銅網(wǎng)上，靜置3 min，用濾紙從銅網(wǎng)周邊小心吸干未吸收的樣品，再用200μL 1%磷鎢酸溶液染色3 min，之后用濾紙吸干銅網(wǎng)周邊多余染液，室溫晾干或白熾燈下烤干后利用透射電子顯微鏡（Hitachi-HT7700）在180 KV加速電壓下檢測(cè)各組胰淀素淀粉樣纖維形成情況。

1.3.3 大鼠胰島分離與培養(yǎng) 10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉Wistar大鼠，以75%乙醇消毒皮膚，無(wú)菌剖腹，從膽總管進(jìn)針，逆行緩慢注入4℃預(yù)冷的膠原酶p（0.8 g/L）8～10 mL，使胰腺充分膨脹。剪心放血處死大鼠，剝離出胰腺組織，快速將完整胰腺放入含有3 mL 4℃預(yù)冷膠原酶p的50 mL離心試管中。37℃水浴消化10~15 min，振蕩使其呈細(xì)砂狀，加入4℃含10%新生牛血清（FBS）的Hanks液約30 mL，終止消化，冰浴5 min待靜置分層后小心吸棄上層液體，再次加入40~50 mL冰Hanks液，重復(fù)2次。于體視鏡下手工挑取形狀規(guī)則的圓形或橢圓形的胰島細(xì)胞團(tuán)。最后將分離純化好的胰島細(xì)胞團(tuán)加入含有100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素、10%胎牛血清、10 mmol/L Hepes、11.1 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)液中，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 采用臺(tái)盼藍(lán)以染色鑒定胰島的活性 在96孔板中將0.4%的臺(tái)盼藍(lán)溶液與含有胰島細(xì)胞的培養(yǎng)基1∶9混合，10 min內(nèi)鏡下觀察細(xì)胞死亡情況。細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色，而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。死亡細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。

1.3.5 細(xì)胞分組 將獲取的胰島簡(jiǎn)單隨機(jī)化分為3組，每組15個(gè)胰島：空白對(duì)照組（NC）；胰淀素組（10μmol/L hIAPP）；胰淀素+利拉魯肽組（10μmo/L hIAPP+100 nmol/L Lira）。

1.3.6 Annexin-V/PI熒光染色法檢測(cè)胰島細(xì)胞的凋亡 按照試劑說(shuō)明，配好Annexin-V/PI凋亡染色液（250μL Binding buffer，5～10μL Annexin V-FITC，10μL propidium Iodide），加入到干預(yù)12 h后的胰島中，室溫避光孵育15 min，隨即進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。正?；罴?xì)胞無(wú)著色，細(xì)胞的早期凋亡呈綠色熒光，細(xì)胞晚期凋亡與壞死紅色熒光。用Imageproplus7.0軟件分析計(jì)算細(xì)胞凋亡的比率。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 胰島細(xì)胞處理完成后，Trizol法提取胰島的RNA，根據(jù)Thermo First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第1鏈。然后采用熒光法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所用試劑盒為生工Sybr-Green qPCR Master Mix（2×）。按照說(shuō)明書完成體系后瞬時(shí)離心，放入羅氏LightCycler96熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果采用2-△△CT相對(duì)定量比較，以β-actin為內(nèi)參照基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[10]，見表1

表1 PCR中基因引物序列Tab 1 Primer sequencesof genesin the PCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組以上組間比較采用單因素方差分析LSD法檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利拉魯肽對(duì)hIAPP聚集的影響

2.1.1 硫磺素T實(shí)驗(yàn)結(jié)果 5μmol/L胰淀素單獨(dú)孵育時(shí)，熒光于1.6 h左右開始上升，并逐漸增加，3.4 h后平穩(wěn)。動(dòng)力學(xué)曲線呈“S”型。5μmol/L胰淀素與500 nmol/L的利拉魯肽（濃度比10:1）共同孵育后，熒光信號(hào)直到2.5 h后才開始上升，出現(xiàn)延遲。5μmol/L胰淀素與5μmol/L利拉魯肽（濃度比1:1）孵育后，幾乎檢測(cè)不到胰淀素的聚集信號(hào)。胰淀素的聚集信號(hào)減弱，未見明顯上升（圖1）。

圖1 硫磺素T染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 1 Reswltsof thioflavin T assays

2.1.2 透射電鏡結(jié)果 20μmol hIAPP單獨(dú)孵育可見大量纖維狀聚集物質(zhì)，表明其聚集性良好（圖2A）；但是20μmol hIAPP和2μmol利拉魯肽（濃度比10∶1）共同孵育后纖維數(shù)量明顯減少，并且聚集物形態(tài)較模糊且短?。▓D2B）；20μmol hIAPP和20μmol利拉魯肽（濃度比1∶1）共同孵育后，無(wú)法找到hIAPP所聚集的纖維裝結(jié)構(gòu)（圖2C）。

2.2 胰島分離后的活性檢測(cè) 臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果如圖3所示：新分離的胰島細(xì)胞團(tuán)大小不一，呈圓形或卵圓形，大多數(shù)胰島細(xì)胞團(tuán)胞膜完整，折光性好。胰島分離過(guò)夜后，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示胰島細(xì)胞膜完整活力良好。

圖3 正常胰島與臺(tái)盼藍(lán)染色后細(xì)胞形態(tài)Fig 3 The natural islet and cell morphology after Trypan blue excluding test

2.3 不同干預(yù)組胰島細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的表達(dá)與分泌 熒光定量結(jié)果如圖4所示：與空白對(duì)照組相比，胰淀素組的白細(xì)胞介素（IL）-1、腫瘤壞死因子（TNF）、單核細(xì)胞趨化蛋白-2（CCL-2）基因的mRNA表達(dá)均增加，分別為3.65±0.14、2.41±0.29、3.65±0.44；利拉魯肽干預(yù)后IL-1、TNF、CCL-2基因的mRNA表達(dá)均下降，分別為1.44±0.12，1.36±0.18，1.33±0.17，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=429.68、48.79、153.39,P均＜0.05），見表2。

圖4 不同干預(yù)組炎癥相關(guān)基因IL-1、TNF、CCL-2 mRNA的表達(dá)Fig 4 ThemRNA expression of theinflammatory factors,including IL-1,TNF and CCL-2 in different group

2．4 同干預(yù)組胰島細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化 Annexin-V/PI熒光染色如圖5A所示，10μmol的hIAPP干預(yù)24 h后，胰島細(xì)胞凋亡增加了22.9倍（17.16%vs.0.75%）；利拉魯肽干預(yù)后凋亡顯著減少（3.33%vs.17.16%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=514.34，P＜0.05）。

RT-PCR結(jié)果如圖5B所示：與空白對(duì)照組相比，胰淀素組促凋亡基因Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量增加（1.21±0.05 vs.1.00±0.05），抗凋亡基因Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降（0.51±0.12 vs.1.00±0.09），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；與胰淀素組相比，利拉魯肽組Bax mRNA表達(dá)沒有減少（1.20±0.05 vs.1.21±0.05），抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)增加（0.78±0.08 vs.0.51±0.12），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見表2。

表2 各組胰島細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的變化（±s）Tab 2 Comparison of apoptosisrelated genesin each groups（±s）

表2 各組胰島細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的變化（±s）Tab 2 Comparison of apoptosisrelated genesin each groups（±s）

注：IL-1:白細(xì)胞介素-1；TNF:腫瘤壞死因子；CCL-2:單核細(xì)胞趨化蛋白-2；NC:空白對(duì)照組；hIAPP:胰淀素組；hIAPP+Lira：胰淀素+利拉魯肽組

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圖5 各組細(xì)胞凋亡情況Fig 5 Theapoptosisof each groups

3 討論

本研究結(jié)果提示hIAPP本身具有聚集性，并且與胰島細(xì)胞共同孵育時(shí)，促進(jìn)炎癥因子表達(dá)、細(xì)胞凋亡，以上均表明hIAPP對(duì)胰島細(xì)胞的毒性作用，與之前研究一致[3，11]。利拉魯肽可以濃度依賴性抑制hIAPP自我聚集，并且與hIAPP共同孵育胰島細(xì)胞時(shí)，炎癥與細(xì)胞凋亡減少，對(duì)胰島細(xì)胞具有一定保護(hù)作用。

與糖尿病類似，阿爾茲海默病的是一種蛋白沉積性疾病，其主要構(gòu)成成分為Aβ多肽，導(dǎo)致靶器官的損害。最近，在阿爾茲海默病的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)：利拉魯肽的早期干預(yù)可以減少Aβ寡聚體水平，減少阿爾茲海默病模型鼠腦內(nèi)斑塊樣沉積，從而改善鼠的記憶功能[12]。Park等[13]以人胰島為體外模型發(fā)現(xiàn)，胰高血糖素樣肽（GLP）-1類藥物可以使胰島淀粉樣寡聚體及蛋白的沉積減少。利拉魯肽是否可以直接通過(guò)抑制多肽的自我聚集或改變其動(dòng)力學(xué)曲線，減少寡聚體的數(shù)量或其纖維形成尚不清楚。本研究采用硫磺素T熒光實(shí)驗(yàn)觀察hIAPP的聚集動(dòng)力學(xué)，該聚集性試驗(yàn)參照IAPP相關(guān)分子抑制實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)比例[14-15]，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用利拉魯肽常用細(xì)胞學(xué)濃度[16-17]，發(fā)現(xiàn)胰淀素與利拉魯肽以10:1分子濃度共同孵育時(shí)，胰淀素聚集過(guò)程延緩，提高利拉魯肽濃度（1:1）后，胰淀素未出現(xiàn)明顯聚集，動(dòng)力學(xué)曲線由S型變?yōu)橹本€型。并且進(jìn)一步透射電鏡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示了利拉魯肽可以濃度依賴性抑制hIAPP自我聚集的作用：利拉魯肽與人胰淀素共同孵育后纖維數(shù)量明顯減少。提示利拉魯肽抑制了hIAPP的聚集。研究顯示艾塞那肽不能抑制胰淀素聚集[18]，利拉魯肽與其不同的是分子中獨(dú)特的疏水作用脂肪酸側(cè)鏈[19]，或許使其具有抑制胰淀素聚集潛能。進(jìn)一步的分子結(jié)構(gòu)相互作用的研究將有助于胰淀素自我折疊過(guò)程的理解以及抗聚集類藥物的研發(fā)。

本課題組既往研究顯示：hIAPP造成的胰島細(xì)胞凋亡與炎癥損傷有關(guān),IL-1信號(hào)通路在其中發(fā)揮了重要作用[11]。利拉魯肽可以減少阿爾茲海默病的β-淀粉樣斑塊相關(guān)的炎癥損傷[8-9]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在利拉魯肽與hIAPP共同孵育時(shí)，IL-1、TNFα、CCL-2炎癥因子表達(dá)下降。既往細(xì)胞學(xué)、動(dòng)物學(xué)及臨床試驗(yàn)也表明利拉魯肽具有一定抗炎作用。利拉魯肽可以與GLP-1受體結(jié)合，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)PKA通路減少炎癥因子的表達(dá)，從而起到細(xì)胞保護(hù)作用[20]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)在體外相對(duì)獨(dú)立環(huán)境下，利拉魯肽可以直接抑制胰淀素的聚集，因此減少hIAPP聚集過(guò)程的毒性產(chǎn)物也許是利拉魯肽發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的重要原因之一。

本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)hIAPP孵育后，胰島細(xì)胞凋亡比率增加，Bax mRNA表達(dá)增加，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)下降。提示胰淀素導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。hIAPP可改變細(xì)胞膜的通透性，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及激活降鈣素受體等影響胰島細(xì)胞的功能及存活[4、21-22]。利拉魯肽孵育后，除炎癥因子表達(dá)下降外，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡比率減少。hIAPP相關(guān)的細(xì)胞損傷作用與其聚集性密切相關(guān)，利拉魯肽是否直接通過(guò)抑制其聚集發(fā)揮作用或間接通過(guò)抗炎等機(jī)制保護(hù)胰島細(xì)胞尚需要更深入研究。

總之，hIAPP可以造成胰島細(xì)胞炎癥損傷，增加胰島細(xì)胞凋亡，利拉魯肽可直接抑制胰淀素聚集，并減少IL-1、TNFα、CCL-2炎癥因子表達(dá)，增加Bcl-2抗凋亡基因，發(fā)揮胰島細(xì)胞保護(hù)作用，為利拉魯肽與淀粉樣沉積物間的關(guān)系提供基礎(chǔ)研究證據(jù)及新思路。