張強，張敏，黃志榮，王高，胡中立，章智華

江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬洪都中醫(yī)院，江西 南昌 330006

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是于老年人群中高發(fā)的慢性疾病之一，退行性病理改變是KOA 的發(fā)病基礎(chǔ)，膝關(guān)節(jié)腫痛、彈響以及坐立走行膝關(guān)節(jié)都活動不便為患者的一般癥狀表現(xiàn)，KOA 病情嚴重會發(fā)展成膝關(guān)節(jié)的嚴重障礙甚至是畸變，嚴重影響患者身心健康、自理能力以及加重家庭負擔(dān)［1-3］。臨床認為，肥胖所致膝關(guān)節(jié)壓力過大及磨損、膝骨外傷以及機體過勞都是導(dǎo)致KOA 疾病的主要原因［4］。如今，人口肥胖率升高，KOA 患病率也升高，所以，加強KOA 的防治措施，對于患者以及社會都有著十分積極的意義［5］。而目前醫(yī)學(xué)界對于該病診斷治療尚且沒有特異性和有效率都較高的辦法，通過減輕關(guān)節(jié)磨損緩解病情是臨床的主要應(yīng)對措施［6］。為了提高患者的治療體驗及效果，無創(chuàng)生化指標(biāo)來測評KOA 病情以及預(yù)后逐漸成為學(xué)術(shù)界爭相研究的一大熱點［7］。相關(guān)研究顯示，角蛋白（AKA）、核周因子（APF）以及瓜氨酸（anti-CCP）抗體等三種特異性自身抗體在KOA 患者空腹血中的表達較正常人出現(xiàn)異常，而臨床研究表明KOA疾病的發(fā)生發(fā)展與淋巴細胞凋亡出現(xiàn)異常存在關(guān)系［8］。因此本研究旨在研究AKA、APF 以及anti-CCP 抗體等三種特異性自身抗體對KOA 細胞凋亡影響,為KOA 患者提供診斷和治療思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2018年3 月至2019年10 月期間江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬洪都中醫(yī)院收治的82 例KOA 患者為研究組，招募82 例健康志愿者為對照組。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，詳見表1。參試者及近親屬簽署了試驗知情同意書，本研究符合醫(yī)學(xué)倫理原則要求。

表1 研究組和對照組一般資料比較

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）研究組患者符合KOA 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）對照組無關(guān)節(jié)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并腫瘤；（2）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及除KOA 以外的其他關(guān)節(jié)性疾?。唬?）免疫系統(tǒng)及其他內(nèi)科疾病患者；（4）精神病患者。

1.3 KOA 嚴重程度分組標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)Kellgren-Law-rence（K-L）標(biāo)準(zhǔn)分級，膝關(guān)節(jié)檢測正常為0 級；膝關(guān)節(jié)有微小骨質(zhì)增生現(xiàn)象為Ⅰ級；膝關(guān)節(jié)間隙窄，輕度骨贅為Ⅱ級；膝關(guān)節(jié)骨贅變多骨質(zhì)硬化為Ⅲ級；膝關(guān)節(jié)骨贅大量增多、骨質(zhì)嚴重硬化畸變，伴隨關(guān)節(jié)的不同程度脫位為Ⅳ級。將KOA 患者分為KOA 輕、中、重度三個亞組，0～Ⅰ級為輕度組；Ⅱ級為中度組；Ⅲ～Ⅳ級為重度組。

1.4 檢測特異性自身抗體

IIF 法:抽取患者清晨空腹靜脈血，離心分離取上清，經(jīng)過稀釋后若所測抗體呈陽性，繼續(xù)稀釋，直到測定最終稀釋度，測定過程按IIF 試劑盒說明嚴格操作。ELISA 法：首先對各組血清進行稀釋，全程反應(yīng)60 min，待反應(yīng)結(jié)束后讀取吸光度值，采用直線回歸計算樣本濃度，陽性標(biāo)準(zhǔn)為100 U/mL及以上，試劑盒均來自北京博爾邁生物科技有限公司，過程按相應(yīng)的試劑盒操作說明書。

1.5 檢測淋巴細胞凋亡率

抽取的各組靜脈血首先采用肝素抗凝血，然后分離T、B 淋巴細胞。將細胞于FCM 管低溫PBS 液洗滌、離心、棄上清，再加入緩沖液，血細胞分析儀進行細胞計數(shù)，再使用搖床混勻，PI 染料進行避光染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡，并記錄凋亡細胞占所有細胞的比率，具體數(shù)值以百分數(shù)形式表示。所涉及的儀器來自美國貝克曼公司。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各亞組分組情況及資料

如表2，根據(jù)K-L 分級標(biāo)準(zhǔn)將研究組KOA 患者 分 為KOA 輕 度 組27 例，KOA 中 度 組36 例，KOA 重度組19 例。四組在男女比例、年齡以及BMI 水平均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表2 各亞組分組情況及資料

2.2 各組特異性自身抗體的表達比較

如下圖1，通過對比對照組和研究組KOA 患者血清中特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP的表達：研究組中三者的表達較對照組顯著上調(diào)（P<0.05）。不同嚴重程度分組比較：與輕度組比較，中、重度組患者血清中AKA、APF、anti-CCP 的相對表達顯著升高（P<0.05）。，見表3。

表3 對照組及KOA病情不同嚴重程度亞組中的表達比較（）

表3 對照組及KOA病情不同嚴重程度亞組中的表達比較（）

注：a表示與對照組比較，P<0.05；b表示與KOA輕度組比較，P<0.05；c表示與KOA中度組比較，P<0.05。

圖1 對照組及研究組血清中特異性自身抗體的表達

2.3 各組T、B 淋巴細胞凋亡率結(jié)果比較

與對照組比較，KOA 輕度組患者的T、B 淋巴細胞凋亡率較對照組有降低的趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；KOA 中、重度組患者T、B 淋巴細胞凋亡率較輕度組顯著降低（P<0.05），見圖2和表4。

圖2 T、B淋巴細胞凋亡流式細胞圖

表4 對照組及KOA病情不同嚴重程度亞組淋巴細胞凋亡率比較（%，）

表4 對照組及KOA病情不同嚴重程度亞組淋巴細胞凋亡率比較（%，）

注：a表示與對照組比較，P<0.05；b表示與KOA輕度組比較，P<0.05；c表示與KOA中度組比較，P<0.05。

2.4 特異性自身抗體對KOA 的診斷價值

如表5、圖3 所示，ROC 曲線分析的結(jié)果顯示：特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 對KOA均具有良好的診斷價值。

表5 特異性自身抗體與KOA病情程度ROC曲線分析結(jié)果

圖3 特異性自身抗體與KOA病情程度ROC曲線分析

2.5 影響因素分析

logistic 回歸分析結(jié)果：血清特異性自身抗體AKA、APF、anti-CCP 均是影響KOA 患者病情程度的獨立危險因素（P<0.05）。，見表6。

表6 影響KOA病情的Logistic回歸分析

2.6 特異性自身抗體與淋巴細胞凋亡率的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示：特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 與淋巴細胞凋亡率均呈負相關(guān)（R<0，P<0.05）。其中AKA 與B、T 淋巴細胞負相關(guān)（R=-0.633，-0.498，P<0.05）；APF 與B、T 淋巴細胞負相關(guān)（R=-0.478，-0.654，P<0.05）；anti-CCP 與B、T 淋巴細胞負相關(guān)（R=-0.553，-0.378，P<0.05）。見圖4。

圖4 特異性自身抗體與淋巴細胞凋亡率的相關(guān)性分析

3 討論

KOA 又被稱作膝關(guān)節(jié)增生性關(guān)節(jié)炎，該病不但發(fā)病率高，且預(yù)后效果不佳病情遷延難愈，因此該病的臨床關(guān)注度高［9］。對該病治療會根據(jù)患者病情的輕重程度針對性進行，對于病情較輕患者，康復(fù)鍛煉以維持膝關(guān)節(jié)能力；對于病情較重者，采用向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物治療；而對于膝關(guān)節(jié)以及產(chǎn)生嚴重畸變，關(guān)節(jié)基本功能喪失則需要進行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)及相關(guān)手術(shù)治療，而且痊愈的可能性很低［10］。因此，尋找在疾病早期準(zhǔn)確檢測治療的方法十分重要［11］。醫(yī)學(xué)研究表示：外來抗原使機體自身產(chǎn)生免疫抵抗，該抗原將HLA-DR 分子呈遞給吞噬細胞加工，從而激活機體的T 淋巴細胞，導(dǎo)致KOA。特異性自身抗體是指抗自身抗原的一類免疫球蛋白［12］。相關(guān)臨床問診和病歷分析AKA、APF、anti-CCP 與KOA 患者關(guān)節(jié)壓痛數(shù)以及晨僵時間等疾病相關(guān)指標(biāo)有關(guān)，說明其與KOA 病情程度和活動性相關(guān)，而臨床研究表明KOA 疾病的發(fā)生發(fā)展與淋巴細胞凋亡出現(xiàn)異常存在關(guān)系［13-15］。機體淋巴細胞的凋亡關(guān)系到機體免疫系統(tǒng)的正常運轉(zhuǎn)以及能否發(fā)揮正常生物學(xué)作用［16］，因此探究KOA 患者特異性自身抗體的表達對機體淋巴細胞凋亡的影響有著十分重要的臨床意義。

本研究通過IIF 法聯(lián)合ELISA 法測定AKA、APF、anti-CCP 等特異性自身抗體在KOA 不同病情患者中的表達，分析KOA 特異性自身抗體與T、B 淋巴細胞凋亡率的相關(guān)性。KOA 患者中AKA、APF、anti-CCP 表達較健康者顯著上調(diào)（P<0.05）。與KOA 輕度組比較，KOA 中度患者血清中三種特異性自身抗體表達顯著升高（P<0.05），KOA 重度患者極顯著升高（P<0.05）。結(jié)果提示：特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 的相對表達隨著KOA 患者病情嚴重程度的加重呈梯度依賴性上升。KOA 中度組患者較KOA 輕度患者的T、B 淋巴細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），KOA 重度組患者極顯著降低（P<0.05）。推測KOA 患者的病情程度加重與機體淋巴細胞的正常凋亡受到阻滯存在相關(guān)。ROC 診斷曲線結(jié)果表明，特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 對于KOA 均具有良好的診斷價值。Logistic 分析顯示：血清特異性自身抗體AKA、APF、anti-CCP 均是影響KOA 患者病情程度的獨立危險因素（P<0.05）。相關(guān)性分析的結(jié)果表明，特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 與T、B淋巴細胞凋亡率均呈負相關(guān)。其中AKA 與B、T 淋巴細胞負相關(guān)；APF 與B、T 淋巴細胞負相關(guān)；anti-CCP 與B、T 淋巴細胞負相關(guān)。KOA 患者血清特異性自身抗體的表達越高，淋巴細胞的凋亡率就越低。本研究對于結(jié)果的論述進行了多層次的對比以及相關(guān)數(shù)據(jù)的處理。然而，依然存在其不足之處：由于試驗時間的關(guān)系，納入的患者樣本容量不夠大，可能會對研究結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。后續(xù)研究可擴充樣本繼續(xù)分析。

綜上所述，KOA 患者血清特異性自身抗體的表達越高，淋巴細胞的凋亡率越低，血清特異性抗體水平與KOA 的發(fā)生密切相關(guān)，參與了KOA 的發(fā)病過程，反映了KOA 病情輕重及關(guān)節(jié)損傷程度，所以KOA 患者血清特異性表達對于KOA 的疾病診斷及病情提示都有一定的臨床價值。