胡萌，翟昌明，張冬，卓永祥，李丹，田廣俊

廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院，廣東 珠海 519015

肝硬化是各種慢性肝病的重要階段，其中乙型肝炎肝硬化是我國(guó)當(dāng)前最主要的肝硬化疾病，是導(dǎo)致肝癌、肝移植等終末期肝病的重要危險(xiǎn)因素[1]。腸道菌群是由細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、古細(xì)菌等組成的多樣化生態(tài)系統(tǒng)，它們相互共生并寄生于人體，對(duì)維持機(jī)體正常生理狀態(tài)起到重要作用[2]。眾多研究表明，腸道菌群與肝臟通過(guò)腸-肝軸相互聯(lián)系，乙型肝炎肝硬化患者腸道菌群發(fā)生變化，其菌群種類、比例與肝臟免疫及炎癥息息相關(guān)[3-4]。

濕熱首見于《素問(wèn)·生氣通天論》，后世醫(yī)家對(duì)濕熱的病因病機(jī)及治法進(jìn)行了完善和豐富。濕熱二邪相互裹挾，重滯黏膩，病勢(shì)纏綿難解，濕熱證候在我國(guó)嶺南地區(qū)較常見，多與肝、膽、脾、胃、三焦關(guān)系密切[5]。雖然腸道菌群與肝硬化進(jìn)展密切相關(guān)，但目前關(guān)于代償期乙型肝炎肝硬化濕熱證患者與其他證候患者糞便微生物群比較研究的報(bào)道較少。本研究初步分析了乙型肝炎肝硬化不同中醫(yī)證候腸道菌群的變化特征，以期進(jìn)一步揭示肝硬化濕熱證的生物學(xué)基礎(chǔ)及與腸道菌群的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年1—12月廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院肝病科門診和住院收治的代償期乙型肝炎肝硬化濕熱證患者33例、非濕熱證患者49例及對(duì)照組24例為研究對(duì)象。濕熱證組男20例，女13例；年齡(43.40±7.26)歲。非濕熱證組男30例，女19例；年齡(41.55±8.86)歲。對(duì)照組男15例，女9例；年齡(40.52±7.84)歲。3組患者基線資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。研究符合醫(yī)學(xué)倫理要求并通過(guò)廣東省中醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(BF2019-078-01)，所有入選者均對(duì)研究知情同意。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合《慢性乙型肝炎防治指南》[6]和《肝硬化診治指南》[7]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[8]和《肝硬化中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)》[9]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。主癥：①口干苦或口臭；②脅脹或痛；③大便黏滯穢臭或大便不爽。次癥：①納呆；②胃脘脹悶；③倦怠乏力；④皮膚鞏膜黃染。舌脈：舌質(zhì)紅、苔黃膩、脈弦數(shù)或弦滑數(shù)。證型確定：具備主癥2項(xiàng)和次證1或2項(xiàng)，參考舌脈象。

1.3 病例納入標(biāo)準(zhǔn)年齡30～50歲；符合乙型肝炎肝硬化的中醫(yī)、西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；近1個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)抗生素、微生態(tài)調(diào)節(jié)劑等影響腸道微生態(tài)的藥物；簽署研究知情同意書。

1.4 病例排除標(biāo)準(zhǔn)近1個(gè)月內(nèi)有使用過(guò)抗生素、微生態(tài)調(diào)節(jié)劑等影響腸道微生態(tài)的藥物；近1個(gè)月內(nèi)全身有除乙肝病毒之外的其他病毒、細(xì)菌、真菌感染；近1個(gè)月內(nèi)有腹瀉等腸道疾病的發(fā)生；合并炎癥性腸病、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病者；飲食習(xí)慣特殊者，例如素食者；合并甲型、丙型、丁型、戊型等類型肝炎及其他嗜肝病毒感染；合并自身免疫性肝病、血吸蟲性肝病、肝豆?fàn)詈俗冃缘绕渌愿尾。婚L(zhǎng)期服用明確肝毒性藥物或酒精攝入量每周>140 g；合并心、肺、腎、血液系統(tǒng)及胃腸道嚴(yán)重原發(fā)病或精神??；患者或患者家屬不同意接受研究隨訪。

1.5 病例剔除標(biāo)準(zhǔn)凡在入組后發(fā)現(xiàn)不符合試驗(yàn)方案者；入組后發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重疾病者。

1.6 研究方法

1.6.1 16S rDNA測(cè)序方法 參照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行測(cè)序：收集研究對(duì)象檢查當(dāng)日晨起的大便，凍存于-80 ℃ 冰箱，待樣品收集完成后，低溫(0 ℃)運(yùn)送至上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行糞便DNA的提取及16Sr DNA檢測(cè)。采用CTAB或SDS方法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，并對(duì)DNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物和高保真DNA聚合酶對(duì)選定的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收，膠回收采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)。參照電泳初步定量結(jié)果，對(duì)PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。使用NEBNext?UltraTMDNALibraryPrepKit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫(kù)通過(guò)AgilentBioanalyzer2100和Qubit進(jìn)行質(zhì)檢，文庫(kù)質(zhì)檢合格后采用IlluminaMiseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。

1.6.2 腸道菌群測(cè)序結(jié)果分析 參照文獻(xiàn)[11]，根據(jù)得到的原始測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)低質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾后，進(jìn)行組裝和再過(guò)濾，進(jìn)行OTU聚類，并與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，進(jìn)行物種注釋；基于OTU和注釋結(jié)果進(jìn)行樣品Alpha多樣性、Beta多樣性、腸道菌群構(gòu)成差異性分析等一系列的綜合性分析及處理。

2 結(jié)果

2.1 各組患者OTU聚類和物種注釋結(jié)果分析對(duì)照組、非濕熱證組、濕熱證組的腸道菌群物種豐富程度不同，OTU種類分別為45 174種、67 511種和 59 314 種，特有OTU種類分別為187 575種、34 621種和30 179種。代償期乙型肝炎肝硬化患者OTU種類多于對(duì)照組，獨(dú)有OTU種類也增多；濕熱證組較非濕熱證組的OTU種類以及每組間的獨(dú)有OTU種類減少，見圖1。

2.2 各組患者Alpha多樣性分析Alpha多樣性是對(duì)單個(gè)樣本中物種多樣性分析，結(jié)果顯示，濕熱組與非濕熱組Good-coverage指數(shù)較對(duì)照組升高，且濕熱組與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明三組間腸道菌群的群落豐富度、菌群多樣性有一定差異，見圖2。

注：A：對(duì)照組；B：非濕熱證組；C：濕熱證組圖1 各組患者OTU聚類Venn圖

注：A：對(duì)照組；B：非濕熱證組；C：濕熱證組圖2 各組患者Alpha多樣性分析

2.3 各組患者Beta多樣性分析Beta多樣性分析映樣本群落組成的相似性。主坐標(biāo)分析(Principal Co-ordinates Analysis，PCoA)結(jié)果顯示，對(duì)照組及非濕熱證組組間樣本坐標(biāo)出現(xiàn)聚攏，表明二組內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)相似，而濕熱證組菌群結(jié)構(gòu)差異性大，與其他兩組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明濕熱證在一定程度上改變了代償期乙型肝炎肝硬化患者的腸道菌群，見圖3。

2.4 腸道菌群構(gòu)成及差異性分析

2.4.1 各組患者腸道菌群在門水平的物種組成豐度分析 在門水平中，檢測(cè)出主要菌門9個(gè)，分別為：厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)。其中，放線菌門相對(duì)豐度值在對(duì)照組、非濕熱證組、濕熱證組三組間逐漸增高，且濕熱證組與其他比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；濕熱證組綠菌門相對(duì)非濕熱證組豐度值明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；濕熱證組酸桿菌門相對(duì)其他兩組豐度值均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

注：A：對(duì)照組；B：非濕熱證組；C：濕熱證組圖3 各組患者Beta多樣性分析

注：A：對(duì)照組；B：非濕熱證組；C：濕熱證組圖4 各組患者腸道菌群在門水平的物種組成豐度分析

2.4.2 各組患者腸道菌群在屬水平的物種組成豐度分析 在屬水平中，共檢測(cè)出差異性菌屬9種，分別為擬桿菌屬(Bacteroides)、巨單胞菌屬(Megamonas)、Faecalibacterium、Escherichia-Shigella、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、Subdoligranulum、Blautia、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、羅斯氏菌屬(Roseburia)、Agathobacter。其中，濕熱證組巨單胞菌屬相對(duì)其他兩組豐度值均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雙歧桿菌屬相對(duì)豐度值在健康對(duì)照、非濕熱證、濕熱證3組間逐漸增高，且濕熱證組與其他兩組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；濕熱證組乳酸桿菌屬相對(duì)其他兩組豐度值增多，且非濕熱組與濕熱組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

2.4.3 各組患者腸道菌群LefSe分析 LefSe(LDA Effect Size)是一種用于發(fā)現(xiàn)高維生物標(biāo)識(shí)和揭示基因組特征的算法，能根據(jù)分類學(xué)組成對(duì)樣本按照不同的分組條件進(jìn)行線型判別分析，以便找出對(duì)樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種。該分析結(jié)果提示，濕熱證組的差異性菌群主要分布在乳桿菌目(Lactobacillales)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、Alistipes、Rikenellaceae。非濕熱組組的差異性菌群主要分布在普雷沃菌科(Prevotellaceae)、韋榮氏球菌屬(Veillonella)、巴恩斯氏菌屬(Barnesiella)、Lachnoclostridium。見圖6。

注：A：對(duì)照組；B：非濕熱證組；C：濕熱證組圖5 各組患者腸道菌群在屬水平的物種組成豐度分析

注：A：對(duì)照組；B：非濕熱證組；C：濕熱證組圖6 各組患者腸道菌群LefSe分析

3 討論

健康的腸道菌群和完整的腸道屏障對(duì)保持腸-肝軸的動(dòng)態(tài)平衡具有非常關(guān)鍵的作用[12]。研究表明，肝硬化患者常存在不同程度的腸道菌群失調(diào)和免疫狀態(tài)紊亂，其能促使細(xì)菌產(chǎn)物激活免疫系統(tǒng)并加重肝臟炎癥反應(yīng)，且與肝功能狀態(tài)、Child-Pugh分級(jí)密切相關(guān)，可誘導(dǎo)和促進(jìn)乙肝肝硬化并發(fā)癥的產(chǎn)生[13-15]。同時(shí)，內(nèi)毒素、脂肪酸和膽汁酸等與腸道菌群的相互作用和影響也會(huì)加重腸黏膜損傷，破壞腸道微生態(tài)平衡和屏障功能[16-18]。因此，乙肝肝硬化的發(fā)生發(fā)展往往與腸道菌群結(jié)構(gòu)改變相互促進(jìn)、互為因果。

中醫(yī)學(xué)理論強(qiáng)調(diào)陰陽(yáng)交感、對(duì)立制約、互根互用和消長(zhǎng)平衡，注重五行相生、相克，這恰好與腸道菌群各種微生物之間彼此制約，互相依存而形成動(dòng)態(tài)的生態(tài)平衡非常相似[5]。中醫(yī)以“整體觀念”和“辨證論治”為核心，以證候反映當(dāng)前階段疾病本質(zhì)(狀態(tài))。從臨床表現(xiàn)看，肝硬化濕熱證患者常見脘腹脹滿，乏力納呆，口干苦，肛門灼熱，大便黏膩不爽，或見泄瀉、里急后重等，其與腸道菌群紊亂引起的消化道癥狀存在高度的一致性。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝脾氣機(jī)不暢，運(yùn)化失常，水濕痰飲內(nèi)生，郁久則易釀生濕熱，而濕熱作為病理產(chǎn)物，蘊(yùn)蒸肝膽或中焦，致使腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，條件致病菌異常增殖，腸道菌群代謝功能紊亂，并通過(guò)炎癥反應(yīng)介導(dǎo)加速肝臟損傷，大量臨床基礎(chǔ)研究亦證實(shí)，炎癥是濕熱證的重要病理物質(zhì)基礎(chǔ)[19-21]。

本研究通過(guò)對(duì)乙型肝炎肝硬化不同中醫(yī)證候患者及對(duì)照組的腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，濕熱證組腸道菌群與非濕熱證組和對(duì)照組比較，無(wú)論是菌群多樣性還是物種豐富程度，均有一定程度變化。濕熱證與代償期乙型肝炎肝硬化患者的某些腸道菌群的豐度變化相關(guān)，主要表現(xiàn)為濕熱證組放線菌門、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬相對(duì)豐度值增高，綠菌門、酸桿菌門、巨單胞菌屬相對(duì)其他兩組豐度值均明顯減少。放線菌門因其菌落呈放射狀而得名，為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，主要能促使土壤中的動(dòng)物和植物遺骸腐爛。有研究表明，放線菌門在高脂肪和動(dòng)物蛋白飲食患者腸道菌群中豐度增加，且與功能性胃腸病的發(fā)病有一定相關(guān)性[22]。雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬均為人體內(nèi)的益生菌，具有抗感染、調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)、殺滅病原體等功效。巨單胞菌屬為丁酸鹽產(chǎn)鹽菌，能夠發(fā)酵各種碳水化合物，是腸道能量來(lái)源的提供者，并能保護(hù)腸道黏膜，提高腸道免疫等。有研究顯示，巨單胞菌在病毒性肝炎、原發(fā)性肝癌患者的糞便菌群中均會(huì)出現(xiàn)豐度值的減少，提示其與“腸-肝軸”調(diào)控具有一定相關(guān)性[23]。綠菌門是一類進(jìn)行不產(chǎn)氧光合作用的細(xì)菌，有研究顯示其會(huì)在肝臟損傷修復(fù)時(shí)被大量消耗[24]。目前，關(guān)于酸桿菌門的研究較少，但有報(bào)道發(fā)現(xiàn)其在肺纖維化、肝纖維化患者的腸道菌群中出現(xiàn)豐度值降低[25-26]。

綜上所述，代償期乙型肝炎肝硬化患者存在腸道菌群失調(diào)，濕熱證腸道菌群物種豐富程度及多樣性與非濕熱證及健康對(duì)照人群存在明顯差異。本研究從腸道菌群角度初步揭示代償期乙型肝炎肝硬化濕熱證中醫(yī)證候的生物學(xué)基礎(chǔ)，為闡明濕熱與腸道菌群之間的關(guān)系提供了客觀依據(jù)，同時(shí)為中醫(yī)藥有效干預(yù)肝硬化濕熱證腸道菌群失調(diào)提供了新靶點(diǎn)和新思路。另外，基于中醫(yī)證候研究的復(fù)雜性及多態(tài)性，本研究?jī)H對(duì)濕熱證患者與其他人群的腸道菌群分布特征進(jìn)行了差異性分析，對(duì)非濕熱證中的常見證如肝郁脾虛、肝腎陰虛等尚未分層對(duì)比，同時(shí)亦缺乏對(duì)證候、理化檢查及腸道菌群之間相互關(guān)系的深入系統(tǒng)分析，因此還需在后續(xù)研究中進(jìn)一步充實(shí)與完善。