張 雷，段廣超，吳智輝

（商丘市第一人民醫(yī)院脊柱外科，河南商丘 476100）

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是一種間質(zhì)瘤，通常發(fā)生于兒童和年輕人［1-3］。發(fā)病原因較為復(fù)雜，受遺傳、表觀遺傳和生物學(xué)因素的影響［4］。OS患者的生存率僅為 15%～30%［5］。MicroRNA （miRNA）是非編碼的內(nèi)源性RNA，在基因組中具有高度的保守性［6］。已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA的失調(diào)會(huì)參與影響OS和OS衍生細(xì)胞的進(jìn)程［7］。miRNA（miR）-494已在多種類型的腫瘤中進(jìn)行了研究，包括非小細(xì)胞肺癌、肝癌、膽管癌、胃癌和胰腺癌［8，9］。但是，miR-494的調(diào)節(jié)作用在不同腫瘤類型中具有不同作用。miR-494的異位表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)OS細(xì)胞中G1/S期的停滯［10］。而先前研究表明細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）在G1/S期中發(fā)揮重要作用［11］，故本研究探討了miR-494的表達(dá)情況對(duì)于OS的影響并進(jìn)一步探究miR-494與CDK6在OS中的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63、U2OS細(xì)胞株購自中國(guó)科學(xué)院（中國(guó)上海）細(xì)胞庫典藏中心。杜爾伯科改良伊戈?duì)枺―MEM）培養(yǎng)基、α-MEM、胰蛋白酶、胎牛血清等均購自四季青公司，基質(zhì)膠購自美國(guó)Sigma公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購自日本同仁化學(xué)公司，Transwell小室購自美國(guó)Corning公司，CDK6等抗體購自Abcam公司。

1.2 miR-494轉(zhuǎn)染

細(xì)胞分組：MG-63細(xì)胞所使用的培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清及100 U/ml青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)（37℃，5% CO2）。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)的細(xì)胞使用胰酶進(jìn)行消化處理，然后分別接種于2個(gè)6孔板中，然后根據(jù)說明書分別將miRNA模擬物及miRNA對(duì)照鏈轉(zhuǎn)染于MG-63細(xì)胞中。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 RT-PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-494的表達(dá)情況。于細(xì)胞轉(zhuǎn)染12、18以及24 h后，提取對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的總RNA，采用銳博公司試劑盒檢測(cè)miR-494的表達(dá)水平，平行重復(fù)3次。

1.3.2 CCK-8 檢測(cè)［12］

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24 h后，將MG-63細(xì)胞接種到96孔板中，設(shè)置空白對(duì)照組，每組設(shè)置4個(gè)重復(fù)組，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。檢測(cè)步驟如下：首先去除培養(yǎng)基，然后每孔加入10μl的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后震蕩混勻后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光光度值（450 nm波長(zhǎng)），比較各組細(xì)胞增殖速度。

1.3.3 Transwell檢測(cè)［13］

在孔中加入100μl的培養(yǎng)基，孵育10 min，使聚碳酸酯膜親水。轉(zhuǎn)染24 h后，使用胰蛋白酶消化，采用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)以及重懸細(xì)胞，孔中各加入100μl的細(xì)胞懸浮液，下室中每孔加入500μl的有血清的培養(yǎng)基。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。之后，用多聚甲醛固定15 min，然后棄掉甲醛，放置晾干后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，使用純凈水沖洗數(shù)次，晾干。于顯微鏡下（×200）選取10個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)算。采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞重懸，在新的6孔板中進(jìn)行增殖，等到細(xì)胞融合率達(dá)到75%左右時(shí)，使用槍頭劃?rùn)M線。之后使用1XPBS清洗3次去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在劃痕結(jié)束的0、12 h時(shí)進(jìn)行拍照，采用Image J軟件進(jìn)行測(cè)量距離，計(jì)算細(xì)胞的12 h的遷移情況。

1.3.4 Western blot檢測(cè)

首先提取細(xì)胞總蛋白，然后采用SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，待條帶分離明顯，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)，將蛋白膠電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。電壓80 V，電轉(zhuǎn)120 min后采用牛血清蛋白封閉1 h，過夜孵育一抗，之后使用TBST洗膜5次，之后孵育2抗1 h，再次TBST洗膜5次，然后使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影。曝光掃描條帶，并采用Image J分析灰度值。進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-494檢測(cè)

miR-494的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見表1，隨時(shí)間推移，兩組miR-494的表達(dá)均顯著增加（P<0.05），轉(zhuǎn)染后12、18以及24 h時(shí)，轉(zhuǎn)染組的miR-494表達(dá)情況均高于對(duì)照組（P<0.05）。

2.2 細(xì)胞增殖CCK-8檢測(cè)

CCK-8檢測(cè)MG-63細(xì)胞增殖情況見表1，隨時(shí)間推移，兩組細(xì)胞增殖均顯著增加（P<0.05），24、48以及72 h時(shí)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖水平均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。

2.3 Transwell侵襲和遷移能力比較

侵襲和遷移能力Transwell檢測(cè)結(jié)果見表1，圖1。轉(zhuǎn)染組在視野下的平均細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞跨膜數(shù)量以及細(xì)胞遷移率均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。在兩種細(xì)胞株中，均表現(xiàn)為轉(zhuǎn)染組的侵襲和遷移能力弱于對(duì)照組。

圖1 miR-494抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力 1a～1d:侵襲實(shí)驗(yàn)中，顯微鏡下觀察到MG-63細(xì)胞以及U2OS細(xì)胞的圖像1e～1h:遷移實(shí)驗(yàn)中，顯微鏡下觀察到MG-63細(xì)胞以及U2OS細(xì)胞的圖像

2.4 miR-494調(diào)控CDK-6的表達(dá)情況

使用RT-PCR對(duì)CDK6的mRNA進(jìn)行定量比較，使用Western blot方法對(duì)CDK6進(jìn)行檢測(cè)比較，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染組中，CDK6的mRNA以及蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，詳情見表1、圖2。在兩種細(xì)胞株中，CDK6的mRNA水平均低于對(duì)照組。

表1 兩組細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

表1 兩組細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

images/BZ_61_205_2061_889_2630.pngimages/BZ_61_889_2061_1173_2630.pngimages/BZ_61_1107_2061_1459_2630.pngimages/BZ_61_1459_2061_1913_2630.pngimages/BZ_61_1913_2061_2275_2630.pngimages/BZ_61_205_2693_889_2756.pngimages/BZ_61_889_2693_1107_2756.pngimages/BZ_61_1107_2693_1459_2756.pngimages/BZ_61_1459_2693_1913_2756.pngimages/BZ_61_1913_2693_2275_2756.pngimages/BZ_61_205_2819_889_2882.pngimages/BZ_61_889_2819_1107_2882.pngimages/BZ_61_1107_2819_1459_2882.pngimages/BZ_61_1459_2819_1913_2882.pngimages/BZ_61_1913_2819_2275_2882.png48.15±10.4490.29±14.02images/BZ_61_205_2944_889_3007.pngimages/BZ_61_889_2944_1107_3007.png<0.001images/BZ_61_1107_2944_1459_3007.pngimages/BZ_61_1459_2944_1913_3007.pngimages/BZ_61_1913_2944_2275_3007.pngimages/BZ_61_205_3070_889_3133.png細(xì)胞侵襲遷移能力檢測(cè)細(xì)胞跨膜數(shù)（個(gè)）CDK-6 mRNA檢測(cè)（相對(duì)值）U2OS mRNAimages/BZ_61_889_3070_1107_3133.pngimages/BZ_61_1107_3070_1459_3133.png0.28±0.06images/BZ_61_1459_3070_1913_3133.png1.11±0.21images/BZ_61_1913_3070_2275_3133.png<0.001

圖2 CDK6表達(dá)情況 2a:CDK6在mRNA水平上表達(dá)情況 2b:Western blot檢測(cè)CDK6在蛋白水平上表達(dá)情況

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，miR-494具有雙重生物學(xué)功能：在某些特定腫瘤中高表達(dá)，又是某些腫瘤的抑癌藥物［5］。據(jù)報(bào)道，miR-494在幾種實(shí)體瘤中表達(dá)上調(diào)，包括肝細(xì)胞癌、急性粒細(xì)胞白血病、支氣管癌變、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和結(jié)直腸癌［14］。通過靶向MCC及PTEN發(fā)揮致癌作用［15］。同時(shí)，miR-494在許多實(shí)體瘤中表達(dá)均下調(diào)，包括胰腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌和膽管癌［16］，并通過靶向IGF1R，Sirt1，C-myc，CXCR4及Bim等發(fā)揮腫瘤抑制作用［17］。然而，miR-494在骨肉瘤細(xì)胞中的生物學(xué)作用及其潛在機(jī)制仍不清楚。本研究采用兩種常用的骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果表明過表達(dá)miR-494能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。為了進(jìn)一步探討miR-494對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，本研究進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)以及劃痕實(shí)驗(yàn)，在兩種骨肉瘤細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染組的侵襲能力明顯低于對(duì)照組，這表明過表達(dá)miR-494能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，能夠抑制骨肉瘤的侵襲擴(kuò)散。

眾所周知，miRNA通過抑制其靶基因發(fā)揮生物學(xué)活性。CDK6在細(xì)胞周期進(jìn)程中至關(guān)重要，并且抑制CDK6將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖不受控制［18］。CDK6在幾種類型的癌癥中發(fā)現(xiàn)與疾病的進(jìn)展具有相關(guān)性，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和淋巴樣惡性腫瘤［19］。CDK6在OS組織中明顯上調(diào)，在不同惡性組織中進(jìn)行了進(jìn)一步研究表明［20］，CDK6的表達(dá)與腫瘤表型（轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移）具有相關(guān)性，在轉(zhuǎn)移性腫瘤中CDK6的表達(dá)升高。本研究中，過表達(dá)miR-494的骨肉瘤細(xì)胞的CDK6的表達(dá)降低，這可能提示miR-494與CDK6的表達(dá)存在相關(guān)性，進(jìn)一步分析，miR-494可能靶向調(diào)節(jié)CDK6的表達(dá)，當(dāng)miR-494過表達(dá)時(shí)，抑制了CDK6的表達(dá)水平。miR-494在OS中的作用可能由CDK6介導(dǎo)發(fā)揮作用。但是，確切的調(diào)控機(jī)理目前尚不清楚。

本研究確定了miR-494是OS細(xì)胞中的一種腫瘤抑制物miRNA，miR-494能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力和侵襲、遷移能力，其機(jī)制與調(diào)控靶基因CDK6有關(guān)，具體調(diào)控機(jī)理仍需進(jìn)一步研究探索。