張帥團(tuán)，邵俊紅，白俊艷，樊紅燈，陳夢柯，牛程煒，王龍威，李靜云，王新樂，王 亮

（1.汝州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 汝州 467500；2.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 洛陽 4710233；3.洛陽市瀍河回族區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 洛陽 471023）

熊貓是我國的國寶，是生物界的“活化石”，但是由于種種原因，熊貓的數(shù)量逐漸減少，其中繁殖率低是一個很重要的因素。所以，通過各種方法提高熊貓的繁殖率就顯得尤為重要，而熊貓基因組序列圖譜的繪制不失為解決這一問題的好辦法之一。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析了公共數(shù)據(jù)庫中熊貓EST序列，以期為熊貓基因組學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。雖然微衛(wèi)星具有多態(tài)性豐富、容易操作和自動化測序程度高等優(yōu)點(diǎn)，但是微衛(wèi)星的開發(fā)仍然是很難和很昂貴的，所以克服SSR開發(fā)費(fèi)用問題的方法之一是挖掘公共數(shù)據(jù)庫中大量有用序列。近年來隨著EST計(jì)劃在不同物種間的擴(kuò)展和研究內(nèi)容的深入，在很多生物中都積累了大量的EST，快速增長的EST數(shù)據(jù)為SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了豐富的來源。從ESTs開發(fā)SSR已經(jīng)有一些報(bào)道，如斑馬魚[1]、中國對蝦[2]、鯰魚[3]、火雞[4]和人[5]等。 本研究是從現(xiàn)有熊貓的EST數(shù)據(jù)庫中篩選包含SSR的序列，分析EST-SSR的分布情況，從而為熊貓的基因組研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 熊貓EST的來源

登陸美國國立生物信息中心 (NCBI)網(wǎng)站，從dbEST數(shù)據(jù)庫下載熊貓的EST(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)，共 709 條。

1.2 EST的拼接與聚類

利用EST—trimmer可去除“尾巴”和屏蔽載體序列。所以用在線軟件Cap3對EST進(jìn)行拼接和聚類。

1.3 EST-SSRs的預(yù)測

用SSRIT在線軟件進(jìn)行SSR預(yù)測，預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)為二至六核苷酸重復(fù)次數(shù)在4次或4次以上。

1.4 部分EST序列開放閱讀框的查找和理化性質(zhì)分析

在包含SSR的EST序列中，選取SSR重復(fù)次數(shù)大于等于5和部分重復(fù)次數(shù)為4的EST序列，利用DNASTAR軟件找到開放閱讀框，然后把開放閱讀框轉(zhuǎn)化為蛋白，針對轉(zhuǎn)化后的蛋白進(jìn)行氨基酸種類及分子量等分。

2 結(jié)果與分析

2.1 熊貓EST序列的預(yù)處理和拼接

對來自dbEST數(shù)據(jù)庫中共709條熊貓的EST經(jīng)過預(yù)處理后，獲得636條理想的EST序列和73條空序列。把636條理想的EST序列經(jīng)拼接后共得到573條uni—EST，平均長度為480 bp。其中contigs 46條，singlets 527條。

2.2 EST-SSR的篩選

用SSRIT在線軟件對573條uni—EST序列進(jìn)行SSR篩選分析，共檢測到150個SSR，出現(xiàn)頻率(SSR數(shù)目與uni—EST數(shù)目的比值)為26.17%，平均每1.79 kb就出現(xiàn)一個SSR。SSR的長度介于8～20 bp之間，平均長度為19.22 bp。不同重復(fù)基元SSR的分布見表1?？梢?，熊貓的EST—SSR以二核苷酸SSR為主，共有124條，占總數(shù)的82.67%。其余為三、四核苷酸SSR，分別為21條和5條，分別占總數(shù)的14.00%和3.33%。

表1 不同重復(fù)基元SSR的分布

150條SSR的重復(fù)次數(shù)分布情況見圖1。這些SSR中，核苷酸序列重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)為4次的有117條，重復(fù)5次的有19條，重復(fù)6次的有8條，重復(fù)7次的有1條，重復(fù)8次的有3條，重復(fù)9次的有2條?？傮w來看，熊貓SET-SSR的核苷酸序列重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)多為4次。

圖1 SSR的重復(fù)次數(shù)分布

2.3 熊貓EST-SSR的分布特點(diǎn)

熊貓二核苷酸SSR和四核苷酸SSR的分布見圖2。在二核苷酸SSR的重復(fù)基元中出現(xiàn)最多的是AG/CT和AT/AT，均占二核苷酸SSR的12.90%。其次是CA/TG(12.10%)、TA/TA(10.48%)、TC/GA(10.48%)、TG/CA(9.677%)、GA/TC(8.871%)、AC/GT(8.065%)、CT/AG(5.645%)和 GT/AC(5.645%)，最少的是 CG/CG 和 GC/GC，各比例不足二核苷酸SSR的2%。熊貓四核苷酸SSR 中 ，TTTC/GAA 出 現(xiàn) 2 次 ，ATAA/TTAT、TTCA/TGAA和TTTA/TAAA各出現(xiàn)了1次。

圖2 二核苷酸和四核苷酸重復(fù)中不同重復(fù)基元SSR的分布

熊貓三核苷酸SSR的分布見圖3。在熊貓三核苷酸SSR中，AAC/GTT占14.29%，其次 CTC/GAG、CTG/CAG、GAT/ATC和 TTA/TAA均占三核苷酸 SSR的9.524%，最少的為AGA/TCT、ATA/TAT、ATT/AAT、CAA/TTG、CAG/CTG、CAT/ATG、GAG/CTC、GCA/TGC、TCA/TGA和TCT/ACA，均占4.7614%。

圖3 三核苷酸重復(fù)中不同重復(fù)基元SSR的分布

2.4 部分EST序列開放閱讀框翻譯蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

在包含SSR的150個EST序列中，選取SSR的重復(fù)次數(shù)大于等于5和部分等于4的共58條EST先進(jìn)行開放閱讀框查找，發(fā)現(xiàn)在這些EST中除6條外，其余52條均能查找到其各自的開放閱讀框。然后將這52條EST的開放閱讀框翻譯成蛋白，針對其蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)有4條蛋白沒有螺旋結(jié)構(gòu)，4條蛋白沒有折疊結(jié)構(gòu)，7條蛋白沒有無規(guī)則卷曲，17條沒有環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)，其余未列出的均有螺旋、折疊、無規(guī)則卷曲和環(huán)區(qū)。

gi|242267036|翻譯蛋白的二級結(jié)構(gòu)，其中第1～12個氨基酸為螺旋（A），第13～22個氨基酸為環(huán)區(qū)（T），第23～52個氨基酸為折疊（B），第53個氨基酸為環(huán)區(qū)（T），第 54～55個氨基酸為無規(guī)則卷曲（C），第 56～67為折疊（B），第 68個氨基酸為環(huán)區(qū)（T），第69個氨基酸為螺旋（A），第 70個氨基酸為環(huán)區(qū)（T），第 71～73為折疊（B）?？傆?jì)是73個氨基酸，其中包括終止密碼子的氨基酸。其中螺旋（A）總計(jì)13個氨基酸，折疊（B）總計(jì)45個氨基酸，環(huán)區(qū)（T）總計(jì)13個氨基酸，無規(guī)則卷曲（C）總計(jì)2個氨基酸。其他蛋白也都有相似的二級結(jié)構(gòu)，只是其氨基酸分布不同而已。采用Alpha Regions預(yù)測了gi|242267036|的 螺旋區(qū)域并給出了各種氨基酸的排列順序，如下：

3 討論

本研究從NCBIdbEST數(shù)據(jù)庫下載熊貓的EST，并對其進(jìn)行處理和SSR篩選，共發(fā)現(xiàn)150個SSR，出現(xiàn)頻率為26.17%。這與許多其他物種ESTs數(shù)據(jù)庫中篩選的微衛(wèi)星序列比例相比較高，如梅花鹿SSR的出現(xiàn)頻率為15.54%[6]，山羊SSR出現(xiàn)的頻率為6.73%[7]，綿羊皮膚中SSR的出現(xiàn)頻率為6.3%[8]，這可能是由于物種不同的原因所致，也可能是SSR篩選時重復(fù)次數(shù)設(shè)置不同所致。此外，在對熊貓的EST序列進(jìn)行分析時，發(fā)現(xiàn)SSR的重復(fù)基元以二核苷酸最多，共有124個，占總SSR的82.67%，這與大多數(shù)動物的EST-SSR以二核苷酸為主的規(guī)律一致。在這些二核苷酸重復(fù)基元中出現(xiàn)最多的是AG/CT和AT/AT，均占二核苷酸SSR的12.90%，平均每15kb就出現(xiàn)一次。而在人和綿羊的基因組中AC／GT是分布頻率最高的SSR，在人的基因組中平均每30 kb就可能出現(xiàn)AC／GT的SSR標(biāo)記，綿羊平均為65kb出現(xiàn)一次，豬每隔30～50 kb出現(xiàn)一次[9,10]。除二核苷酸以外，熊貓的EST序列中還包含三、四核苷酸重復(fù)基元，其中在三核苷酸中AAC/GTT出現(xiàn)的最多，占三核苷酸SSR的14.29%，這與許多植物的情況有所不同。例如，在柑橘中AAG／CTT是最豐富的三核苷酸SSR的重復(fù)基元[11]，在狗尾草中最豐富的三核苷酸SSR的重復(fù)基元是CAG／TCT[12]。在四核苷酸中TTTC/GAAA出現(xiàn)相對較多，富含A／T，這與其他動物如鯰魚、斑馬魚和牛的結(jié)果相似[13]，即四、五、六核苷酸SSR都以富含A／T的重復(fù)基元為主要基序。本研究明確了熊貓基因組中EST-SSR的分布特征，熊貓EST-SSR不但基元類型豐富、密度大，而且多態(tài)性潛能較高，說明大規(guī)模開發(fā)EST-SSR的可能性較大。利用熊貓表達(dá)序列標(biāo)簽建立微衛(wèi)星標(biāo)記，將對進(jìn)一步開發(fā)熊貓衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量、標(biāo)記輔助選擇、遺傳多樣性評價、構(gòu)建遺傳圖譜以及與其他物種基因組的比較研究都有重要意義。