陳文迪，張詩琪，王亞楠，李詠賢，劉 穎，徐宏偉*

(1.青島大學醫(yī)學部 臨床檢驗技術專業(yè)，山東 青島 266071；2.青島大學醫(yī)學部 基礎醫(yī)學院細胞與分子生物學實驗室，山東 青島 266071)

抑郁癥是一種常見的精神障礙性疾病，我國的發(fā)病率約為4%[1]。該病患者具有極強的自殺傾向，給個人、家庭及社會均帶來巨大壓力和沉重負擔[2]。因此，對抑郁癥的深入研究成為人們關注的焦點之一[3]。被動游泳可誘發(fā)小鼠抑郁樣行為[4]，與酒精戒斷、慢性不可預知輕度應激(CUMS)等誘導抑郁樣行為的建模原理及方式不同，該模型屬于“行為絕望”抑郁模型，對實驗動物造成的損傷更為溫和，與人類慢性、低水平應激源導致抑郁癥的機理更為接近，因此成為抑郁癥發(fā)病機理及藥物防治理想的研究工具和實驗手段[5-6]。研究顯示，對于被動游泳小鼠，水溫及持續(xù)時間等環(huán)境因素的改變對其抑郁樣行為的形成產(chǎn)生重要影響[7]；水質的不同也成為相關動物實驗影響因素之一[8]。近年來的動物實驗及人群研究均表明，“腸道微生物群-大腦軸”已作為一種潛在的腦功能失調病理生理機制參與自閉癥、抑郁癥、焦慮癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展[9-10]。因此，本研究擬通過在不同條件下的被進行游泳運動獲得抑郁樣小鼠模型；同時，采用16S rDNA高通量測序技術及實時熒光定量PCR(FQ-PCR)技術對小鼠腸道菌群進行系統(tǒng)的分子生態(tài)學分析，觀察抑郁樣行為小鼠腸道菌群結構及組成的特征性改變，并進一步探討抑郁樣行為嚴重程度與腸道菌群組成的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級6周齡雄性C57BL/6J小鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(SCXK(京)2016-0006)，體質量約20 g，遺傳背景明確。小鼠飼養(yǎng)于青島大學附屬醫(yī)院實驗動物中心(SYXK(魯)2015-0003)，各組小鼠自由進食和飲水，鼠房環(huán)境保持溫度(22±2)℃，相對濕度50%～60%，12 h光照/黑暗交替。本研究獲得青島大學實驗動物倫理委員會的批準(2018 審字第 02)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.1.2 主要試劑與儀器 蔗糖購自國藥集團化學試劑有限公司(分析純)；脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis，ATCC 25285)及嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，ATCC 11073)標準菌株凍干粉購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，4 ℃保存。糞便基因組DNA提取試劑盒、細菌基因組提取試劑盒及實時熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測試劑盒均購自QIAgen；Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0購自TaKaRa；淡水取自新鮮自來水；海水取自青島沿岸近海海域，經(jīng)4層濾紙過濾去除水中漂浮物。將自來水及經(jīng)過濾處理的海水行0.22 μm濾膜過濾，作為小鼠游泳實驗用水。玻璃泳槽(70 cm×50 cm×50 cm)；紫外微量分光光度計(NanoDrop 2000，美國Thermo)；PCR擴增儀(T100，美國Bio-Rad)；電泳儀(DYY-6C，北京六一儀器廠)；凝膠成像分析系統(tǒng)(UVP，美國)；實時熒光定量PCR儀(Realplex4，德國Eppendorf)。16S rDNA高通量測序分析委托上海銳翌生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與分組 35只6周齡雄性C57BL/6J小鼠，適應性喂養(yǎng)2周后，按體質量隨機分為7組(n=5)，包括正常對照組(A組)、室溫(22±2)℃淡水15 min組(B組)、室溫淡水5 min組(C組)、室溫海水15 min組(D組)、室溫海水5 min組(E組)、低溫(8±2)℃淡水5 min組(F組)及低溫海水5 min組(G組)。每日18：00時按以下方法對小鼠實施游泳運動：A組不游泳；B組于室溫淡水中游泳15 min；C組于室溫淡水中游泳5 min；D組于室溫海水中游泳15 min；E組于室溫海水中游泳5 min；F組于低溫淡水中游泳5 min；G組于低溫海水中游泳5 min。實驗期間，用玻璃棒驅趕小鼠在玻璃泳槽中不停歇地游泳。實驗結束后撈出小鼠并將其拭干(海水游泳小鼠采用淡水噴淋后拭干)，放回飼養(yǎng)籠中。每周更換新鮮自來水及海水。實驗持續(xù)16周，每周記錄小鼠體質量變化。于16周末留取小鼠糞便，-80 ℃凍存，用于腸道菌群分子生態(tài)學檢測；同時對各組小鼠進行行為學測試。

1.2.2 糖水偏愛實驗 于實驗第0周和第16周末分別進行糖水偏愛實驗。本研究參照文獻[11]報道的糖水偏愛實驗方法并做了部分改進。為了消除小鼠對蔗糖溶液的恐懼，在正式實驗開始之前，為每只小鼠提供2瓶0.8%(質量分數(shù))的蔗糖溶液，持續(xù)飲用24 h。隨后，隨機將其中一瓶蔗糖溶液替換為自來水，繼續(xù)飲用24 h。禁食禁水24 h后，進行糖水偏愛實驗，即向每只小鼠分別提供1瓶0.8%(質量分數(shù))的蔗糖溶液和1瓶自來水自由飲用12 h，并分別記錄其初始瓶質量及第12小時末瓶質量。期間，于飲用第0.5小時和第6小時交換一次水瓶位置，以消除小鼠因位置偏好對實驗結果的影響。

小鼠糖水偏愛度(%)=

1.2.3 強迫游泳實驗 于實驗第16周末進行強迫游泳實驗。早7：00時將小鼠引入行為學檢測實驗室，以適應其安靜且視野較暗的環(huán)境，2 h后開始強迫游泳實驗，并在3 h內(nèi)完成。將小鼠置于25 cm(高)×10 cm(直徑)的圓柱形泳槽中，水深10 cm，水溫(22±2)℃。實驗持續(xù)6 min，記錄最后4 min“不動”時間，即小鼠停止掙扎，僅靠四肢的輕微運動保持頭部漂浮在水面以上的時間。本研究采用 SMART v3.0 軟件，將小鼠“不動”的判定標準設置為運動速度小于 0.6 cm2/s，每隔 0.5 s記錄一次。每次實驗前，更換新鮮自來水，消除其對實驗結果的影響。實驗結束后撈出小鼠并將其拭干，放回飼養(yǎng)籠中。

1.2.4 糞便腸道菌群16S rDNA 高通量測序 稱取小鼠糞便樣品200 mg，采用糞便基因組DNA提取試劑盒獲得腸道菌群基因組DNA，通過NanoDrop 2000紫外微量分光光度計和1% 瓊脂糖凝膠電泳對其進行濃度及純度質量檢測。以質檢合格的基因組DNA為模板，使用通用引物341F(5′-CCTACGGGRSGCAG CAG-3′)和806R(5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′)，對其16S rDNA V3～V4區(qū)域進行PCR擴增，最終獲得425 bp左右擴增片段。采用2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，切膠回收，并進行質檢和定量。隨后，通過Illumina Hiseq PE250平臺對PCR產(chǎn)物進行多重測序，獲得250×2 bp雙端序列。采用PANDAseq軟件組裝原始序列，并按照以下質量控制標準進行過濾：原始序列長度在220～500 bp之間；最小平均質量值為20(Q20)，最大含N堿基數(shù)為3。使用Usearch軟件將上述優(yōu)化序列中具有97%以上相似度的核苷酸序列進行聚類和嵌合體過濾，得到用于物種分類的操作分類單元(OTUs)。所有樣本隨機抽樣至均勻深度后，提取各OTUs代表序列，通過RDP數(shù)據(jù)庫進行比對，從而在門、綱、目、科、屬水平對每個OTU進行物種歸類和豐度分析，最小置信閾值為0.8；采用QIIME軟件進行PCoA菌群多樣性分析；采用LEfSe方法篩選具有顯著差異(LDA>2)的關鍵物種。

1.2.5 糞便中擬桿菌及乳桿菌定量分析 ①引物設計與合成：參照Bernhard 等[12]報道的方法及脆弱擬桿菌和嗜酸乳桿菌 16S rDNA基因序列設計擬桿菌屬及乳桿菌屬特異性16S rDNA 片段PCR引物，并通過NCBI BLAST 基因庫對引物序列特異性進行比對評價。各菌屬16S rDNA PCR擴增片段特異性引物序列、產(chǎn)物長度及退火溫度見表1。引物合成委托上海生工生物工程有限公司完成。②標準菌株基因組DNA提?。悍謩e準確稱取脆弱擬桿菌及嗜酸乳桿菌標準品50 mg，采用細菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，嚴格按照說明書操作，-20 ℃保存。③標準曲線制作：以上述脆弱擬桿菌及嗜酸乳桿菌標準菌株基因組DNA為模板，進行常規(guī)PCR反應，獲得16S rDNA PCR片段擴增產(chǎn)物。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，最佳退火溫度30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。以PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳(電壓80 V，電泳40 min)。將目的條帶切膠、回收、純化后，以紫外微量分光光度計測定其濃度，并換算為各標準品1 μL拷貝數(shù)的對數(shù)。將純化的脆弱擬桿菌及嗜酸乳桿菌標準品16S rDNA PCR片段擴增產(chǎn)物做10倍系列稀釋，使成為l×109～1×102拷貝/μL。以此為模板，在SYBR Green熒光染料的作用下，對各標準品進行實時熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測。反應條件：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性10 s，最佳退火溫度20 s，72 ℃延伸30 s，共50個循環(huán)。實驗同時以ddH2O代替DNA模板作為陰性對照，標準品均設2個平行復孔。反應結束后，根據(jù)讀取的熒光數(shù)據(jù)，由系統(tǒng)軟件Eppendorf Mastercycler ep realplex自動分析各標準品初始循環(huán)數(shù)(Ct值)，以此作為縱坐標，以各標準品初始拷貝數(shù)的對數(shù)作為橫坐標，生成標準曲線。④大鼠腸道菌群中擬桿菌屬及乳桿菌屬定量檢測：調整上述各組大鼠腸道菌群基因組DNA濃度為50～80 ng/μL，以此為模板，進行擬桿菌屬及乳桿菌屬16S rDNA實時熒光定量PCR反應。實驗以標準品及ddH2O代替DNA模板作為陽性和陰性對照，每個樣品均設2個平行復孔。獲得Ct值后，通過上述標準曲線計算各樣品擬桿菌屬及乳桿菌屬拷貝數(shù)。反應體系和反應條件與標準曲線制作相同。

表1 各菌屬16S rDNA PCR擴增片段特異性引物序列及退火溫度

2 結果與分析

2.1 游泳運動對小鼠體質量的影響

結果顯示，第1周至第8周，各組小鼠體質量均呈不同程度上升趨勢；第8周開始至第16周，各模型組體質量均較正常對照組逐漸下降。D組小鼠的體質量下降最為明顯，第16周末達到(20.5±1.6)g，較正常對照組(23.9±2.3)g下降了14.2百分點，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組小鼠體質量變化

2.2 游泳運動對小鼠行為學的影響

2.2.1 糖水偏好實驗 結果顯示，游泳運動之前，各組小鼠糖水偏愛度沒有顯著性差異(P>0.05)。游泳運動16周后，各模型組小鼠糖水偏愛度普遍降低，與正常對照組(A組，(80.4±8.3)%)比較，分別下降了6.3百分點(B組)、9.3百分點(C組)、20.1百分點(D組)、12.4百分點(E組)、9.4百分點(F組)及11.7百分點(G組)。其中D、F、G組糖水偏愛度與正常對照組比較，均具有顯著性差異，尤其是D組小鼠糖水偏愛度降低幅度最大，且較F組具有顯著性差異(P<0.05)，見圖2。

2.2.2 強迫游泳實驗 結果顯示，模型組小鼠不動時間分別較正常對照組(117.2±35.3)s延長了8.7百分點(B組)、14.6百分點(C組)、50.5百分點(D組)、24.7百分點(E組)、21.8百分點(F組)及27.4百分點(G組)。其中，D、E、F、G組不動時間與正常對照組比較具有顯著性差異，且D組小鼠在各模型組中不動時間最長(P<0.05)，見圖3。

2.3 游泳運動對小鼠腸道菌群分子生態(tài)學的影響

2.3.1 糞便腸道菌群16S rDNA 高通量測序 ①Alpha多樣性：采用Alpha多樣性指數(shù)對小鼠腸道菌群測序深度、豐度和均勻度進行評估。物種累計曲線及goods coverage指數(shù)用于反映菌群測序深度，Chao 指數(shù)用于反映菌群豐度；Shannon指數(shù)則用于反映菌群均勻度。結果顯示，物種累計曲線趨于平穩(wěn)，同時各組樣品goods coverage均超過99%，提示樣品中絕大部分物種均被檢測到，可用于后續(xù)分析。同時，各組間Chao指數(shù)及Shannon指數(shù)具有顯著性差異(P<0.05)，提示游泳運動使小鼠腸道菌群豐度及均勻度發(fā)生改變。見圖4Ⅰ～Ⅳ。②Beta多樣性：使用主坐標分析(Principal Coordinates Analysis，PCoA)展示各組樣品間結構和組成方面的多樣性差異。兩個樣品距離越近，則表示這兩個樣品的物種組成越相近，差異越小。結果顯示，模型組小鼠與正常對照組之間物種多樣性存在顯著差異(P=0.014)，同時Anosim相似性分析結果也顯示，各組間菌群組成明顯不同(R=0.332，P=0.001)，提示游泳運動對小鼠腸道菌群多樣性產(chǎn)生顯著影響。見圖4Ⅴ～Ⅵ。③物種組成分析：結果顯示，各模型組小鼠腸道菌群從門水平到屬水平的多個物種豐度較正常對照組具有顯著差異。其中，室溫海水游泳15 min小鼠(D組)腸道菌群的變化最為明顯。如：與正常對照組比較，D組小鼠腸道菌群中擬桿菌在門(Bacteroidetes)、綱(Bacteroidia)、目(Bacteroidales)、科(Bacteroidaceae)、屬(Bacteroides)水平的豐度分別增加了68.3百分點、67.5百分點、67.4百分點、34.9倍和14.2倍(P<0.05)。此外，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)及普雷沃氏菌屬(Prevotella)豐度分別較正常對照組增加了4.5倍和6.1倍。而D組厚壁菌門(Firmicutes)、梭狀芽胞桿菌綱(Clostridia)、梭狀芽胞桿菌目(Clostridiales)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)及乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度則較正常對照組分別顯著減少了50.5百分點、53.9百分點、54.0百分點、39.4百分點和61.8百分點(P<0.05)，見圖5Ⅰ～Ⅴ。LDA EffectSize(LEfSe)分析結果進一步顯示，模型組小鼠在門、綱、目、科、屬水平有多個物種豐度與正常對照組存在顯著差異(LDA>2)，提示游泳運動使小鼠腸道菌群結構和組成發(fā)生特征性改變。其中，室溫海水游泳15 min小鼠(D組)具有顯著差異的物種最多，從門水平到屬水平共有1個菌門、4個菌綱、4個菌目、7個菌科及10個菌屬在該組富集。見圖6。

圖4 各組小鼠腸道菌群Alpha及 Beta多樣性分析

圖5 各組小鼠腸道菌群物種組成分析

圖6 各組小鼠腸道菌群LEfSe分析圖

2.3.2 糞便中擬桿菌及乳桿菌實時熒光定量分析 根據(jù)擬桿菌標準菌株Ct值及初始拷貝數(shù)獲得擬桿菌屬標準曲線回歸方程為y=-4.007x+44.63(R2=0.998)；乳桿菌屬標準曲線回歸方程為y=-3.112x+40.21(R2=0.988)。與正常對照組比較，模型組糞便中擬桿菌含量呈不同程度升高，而乳桿菌含量均較正常對照組減少。其中，D組擬桿菌及乳桿菌含量均較正常對照組具有顯著性差異(P<0.01),見圖7。

圖7 各組小鼠腸道中擬桿菌屬及乳桿菌屬定量分析

3 討 論

糖水偏好實驗和強迫游泳實驗是目前評價實驗動物抑郁樣行為最常用的方法之一[13-14]。本研究結果顯示，對C57BL/6J小鼠實施被動游泳運動之前，各組小鼠體質量及糖水偏愛度均無明顯差別。但被動游泳16周后，各模型組小鼠體質量及糖水偏愛度均較正常對照組小鼠有不同程度降低，且強迫游泳實驗中不動時間均較正常對照組明顯延長，表明已成功建立小鼠抑郁樣行為模型[11，15]。

本研究通過不同水質、不同溫度及不同游泳時間，觀察被動游泳運動對小鼠抑郁樣行為的影響。結果發(fā)現(xiàn)，采用室溫海水進行游泳運動15 min的小鼠，其體質量及糖水偏愛度下降均最為明顯，不動時間也最長，提示上述環(huán)境條件可能更易誘發(fā)小鼠抑郁樣行為。這可能與海水含鹽量較高(約為30‰，為淡水含鹽量的10倍)，小鼠意外嗆入海水后受到的不良刺激較淡水更大有關；同時，小鼠互相撕咬造成皮膚破口，海水浸泡也可加重實驗動物不適感及氧化應激損傷[16]。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，進行被動游泳運動時間越長，越易誘發(fā)小鼠抑郁樣行為。更加值得關注的是，室溫游泳較低溫游泳更易誘發(fā)小鼠抑郁樣行為。其原因可能與適當?shù)暮浯碳ねㄟ^對神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調節(jié)，提高了機體的興奮性及適應能力有關；同時，寒冷刺激促使機體，尤其是腦組織血液循環(huán)量增大、紅細胞攜氧量提高[17]，也在一定程度上緩解了小鼠抑郁情緒的產(chǎn)生。

研究顯示，被動運動可引發(fā)腸道菌群的改變[18]，同時，近年來的大量研究也表明，腸道菌群與抑郁障礙密切相關[19]。因此，本研究進一步對被動游泳小鼠糞便中腸道菌群進行16S rDNA高通量測序和實時熒光定量PCR實驗，以觀察具有抑郁樣行為的小鼠腸道菌群結構和組成的特征性變化。

研究顯示，重度抑郁癥患者腸道菌群中厚壁菌門(Firmicutes)比例明顯降低，而擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)豐度則顯著升高，其所屬50多個物種的豐度均較對照組有顯著差異[20]。Aizawa等[21]對43例重度抑郁患者糞便樣本進行檢測后也發(fā)現(xiàn)，重度抑郁患者較健康人更易出現(xiàn)雙歧桿菌及乳桿菌等有益菌含量計數(shù)較低的個體。抑郁障礙動物模型中也同樣發(fā)現(xiàn)了腸道菌群紊亂現(xiàn)象。Jiang等[22]采用酒精戒斷的方式成功建立抑郁樣小鼠模型，在對其腸道菌群結構和組成進行系統(tǒng)分析后發(fā)現(xiàn)，具有抑郁樣行為的小鼠腸道中普氏菌屬(Prevotella)及擬桿菌屬(Bacterdies)等多個菌屬豐度與對照組相比均明顯不同。該研究進一步通過糞菌移植實驗將抑郁障礙小鼠腸道菌群移植給受體小鼠，發(fā)現(xiàn)它們表現(xiàn)出與供體小鼠一致的抑郁樣行為。Huang等[23]的研究則顯示，放線菌門(Actinobacteria)擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)豐度的改變可能是抑郁障礙及抗抑郁效果評價潛在的生物標志物。本研究16S rDNA高通量測序結果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腸道菌群的豐度和多樣性與正常對照組小鼠相比均發(fā)生了明顯變化，從菌門到菌屬水平也存在多個物種豐度的顯著改變。值得關注的是，室溫海水游泳15 min的小鼠擬桿菌門(Bacteroidetes)及其所屬的擬桿菌屬(Bacteroides)豐度明顯增加，而厚壁菌門(Firmicutes)及其所屬的乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度則普遍下降，同時，該組小鼠存在普氏菌屬(Prevotella)等多個條件致病菌在該組富集的現(xiàn)象；針對擬桿菌屬及乳桿菌屬所做的實時熒光定量PCR實驗也得到了與16S rDNA高通量測序較為一致的結果。研究認為，擬桿菌的過度增殖與神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂和抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關[10，24]。Liu 等[25]通過對100名受試者糞便腸道菌群高通量測序分析也發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者腸道菌群中存在大量擬桿菌及普氏菌。而乳桿菌作為一種益生菌，在調節(jié)腸道菌群結構[26]及抑郁癥防治等方面也起到良好的改善效果。Slykerman等[27]募集423名14～16周的妊娠婦女，采用鼠李糖乳桿菌進行孕期和產(chǎn)后干預，發(fā)現(xiàn)接受乳桿菌補充的產(chǎn)婦，其產(chǎn)后抑郁和焦慮得分明顯較低。以上這些研究均表明，腸道菌群結構和組成的變化，尤其是某些菌屬豐度的改變可能參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展并發(fā)揮關鍵作用。其作用機制可能是腸道菌群更易受到外界環(huán)境應激源的影響，導致菌群紊亂。腸道中有害菌的過度增殖及益生菌的缺失，使得腸道內(nèi)有害物質增多，從而影響腸道內(nèi)神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫及代謝系統(tǒng)，進一步對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響[28-29]，引發(fā)抑郁情緒。也有學者認為，對腦組織中環(huán)狀RNA-HIPK2表達的抑制作用及其對星形膠質細胞功能障礙的調節(jié)作用，可能是腸道菌群參與機體抑郁樣行為的另一重要途徑和作用方式[30]。但它們究竟如何實現(xiàn)對大腦生理、行為、情緒和認知的影響，其作用機制尚未完全闡明，有待進一步研究探索。

綜上所述，具有抑郁樣行為的小鼠，其腸道菌群組成發(fā)生特征性改變，并隨抑郁樣行為的嚴重程度有所變化，這為今后以腸道菌群為靶點進行抑郁癥防治研究提供參考。