朱志偉，譚亞娣，張喬馨，薛 闖,2

(1.大連理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.大連理工大學(xué) 寧波研究院，浙江 寧波 315016)

1 中鏈化學(xué)品

一般認(rèn)為，含6～12個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸為中鏈脂肪酸，相應(yīng)的衍生物被稱為中鏈化學(xué)品，廣泛用作生物燃料、材料單體、日用化學(xué)品和精細(xì)化學(xué)品[1]。中鏈脂肪酸可作為除草劑、抗菌劑和潤(rùn)滑劑的中間體；中鏈酮和中鏈烷基酯是香精香料，中鏈酯也可以用作車用生物燃料；中鏈醇可用作表面活性劑、塑化劑、生物燃料和醫(yī)藥中間體；中鏈烷烴是汽油和航空燃油的理想替代品；中鏈烯烴可用于生產(chǎn)表面活性劑、塑化劑和特種塑料；中鏈二元酸是生產(chǎn)聚酰胺塑料(尼龍)的單體；ω-羥基酸可用作聚合物單體?，F(xiàn)有中鏈化學(xué)品大多源自煤和石油化工原料，使用可再生原料合成中鏈化學(xué)品是實(shí)現(xiàn)其可持續(xù)綠色制造的必然選擇。小部分中鏈化學(xué)品可使用動(dòng)植物油脂為原料合成，例如椰油和棕櫚仁油含70%～80%的中鏈脂肪酸，其中主要組分為月桂酸(C12)；蓖麻油富含的蓖麻油酸(Ricinoleic acid，12-羥基油酸)經(jīng)裂解轉(zhuǎn)化后，可合成聚酰胺PA11的單體ω-氨基十一酸。然而植物油料來(lái)源的中鏈脂肪酸供應(yīng)受土地、水肥和天氣等因素的影響和限制，無(wú)法滿足產(chǎn)業(yè)鏈需求。而微生物發(fā)酵生產(chǎn)不受上述因素影響，使用代謝工程改造的微生物細(xì)胞工廠合成中鏈脂肪酸，以木質(zhì)纖維素為原料、或直接通過(guò)光合作用捕獲CO2和光能、或使用可再生電能進(jìn)行CO2轉(zhuǎn)化，將為中鏈化學(xué)品生產(chǎn)提供一條可持續(xù)的綠色合成路線，也有助于“碳達(dá)峰、碳中和”目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。過(guò)去5～10年內(nèi)，代謝工程、合成生物技術(shù)、過(guò)程工程等技術(shù)的融合，已經(jīng)催生了許多驚喜的成果，本文著重討論中鏈化學(xué)品合成的酶學(xué)基礎(chǔ)及細(xì)胞工廠改造策略，探討存在的主要問(wèn)題和挑戰(zhàn)，并提出后續(xù)工作的方向。

2 碳鏈延伸途徑

中鏈化學(xué)品的合成依賴碳鏈延伸途徑，絕大多數(shù)微生物其天然的碳鏈延伸途徑并不形成中鏈產(chǎn)物，因此細(xì)胞內(nèi)中鏈化合物的濃度很低。隨著對(duì)碳鏈延伸反應(yīng)機(jī)制的理解及研究不斷深入，現(xiàn)在可以操縱碳鏈延伸途徑合成中鏈羧酸，這些途徑包括脂肪酸合成途徑、逆β-氧化途徑、聚酮合成途徑、α-酮酸延伸途徑等。

2.1 脂肪酸合成途徑

除少數(shù)古細(xì)菌外，地球上的生物均使用攜帶?；牧字肿幼鳛榧?xì)胞膜的組分，且酰基碳鏈長(zhǎng)度一般為C16和C18。原核生物、真核生物線粒體和葉綠體使用II型脂肪酸合酶系統(tǒng)，每種酶活性由單個(gè)基因編碼。而I型脂肪酸合酶是多酶復(fù)合物，其亞基包含多個(gè)酶催化結(jié)構(gòu)域。動(dòng)物細(xì)胞的胞漿中存在二聚體、分子量約為540 kD的I型脂肪酸合酶；真菌和部分放線菌中存在分子量高達(dá)2.5 MD的另一種I型脂肪酸合酶。不同脂肪酸合酶系統(tǒng)催化的化學(xué)反應(yīng)高度類似(圖1a)，針對(duì)不同脂肪酸合酶系統(tǒng)，引入短鏈硫酯酶(Thioesterase)，或突變催化縮合反應(yīng)的酮酰合酶(Ketoacyl synthase)和參與產(chǎn)物釋放的丙二?；?棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(Malonyl/palmitoyl transferase)，可以調(diào)控脂肪酸產(chǎn)物鏈長(zhǎng)(圖1a)[2]。

2.2 逆β-氧化途徑

輔酶A(Coenzyme A，CoA)依賴的碳鏈延伸途徑與脂肪酸β-氧化途徑方向相反，常稱為逆β-氧化途徑。產(chǎn)溶劑梭菌利用逆β-氧化途徑合成丁醇，該途徑被改造后可以合成C≥6醇[3-4]。通過(guò)合成生物學(xué)手段和系統(tǒng)生物學(xué)分析，已確認(rèn)大腸埃希菌逆β-氧化途徑的核心組分，該途徑發(fā)生的關(guān)鍵是替換?；?CoA脫氫酶為反式-烯酰-CoA還原酶[4]，而硫解酶(Thiolase)的底物鏈長(zhǎng)特異性對(duì)實(shí)現(xiàn)多輪迭代逆β-氧化循環(huán)并合成C≥6產(chǎn)物起關(guān)鍵作用，另外硫酯酶(Thioesterase)也能顯著影響產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)(圖1b)[5]。逆β-氧化途徑不依賴ATP，且使用NADH為還原力，這些特征有助于提高產(chǎn)物得率。盡管真核微生物(如釀酒酵母)可采用類似途徑合成丁醇，但進(jìn)一步延長(zhǎng)碳鏈合成中鏈產(chǎn)物仍相當(dāng)困難[6]。

圖1 中鏈化學(xué)品合成相關(guān)的碳鏈延伸途徑

2.3 聚酮合成途徑

聚酮合成途徑與脂肪酸合成途徑類似，但聚酮合成途徑可使用的起始單元和延伸單元更加多樣，如丙酰-CoA、甲基丙二酰-CoA等；此外聚酮合成途徑往往缺乏酮酰還原、脫水或烯酰還原等步驟，最終產(chǎn)物骨架上保留了羰基、羥基或烯基基團(tuán)，再加上環(huán)化和后續(xù)修飾，聚酮產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)非常多樣[7]。通過(guò)改造聚酮合酶，可以合成中鏈化學(xué)品(圖1c)。Keasling課題組利用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素Borrelidin合成相關(guān)的延伸模塊1，替換其酮酰還原結(jié)構(gòu)域和脫水酶結(jié)構(gòu)域，并表達(dá)合適的硫酯酶，獲得雜合的聚酮合酶可催化琥珀酰-CoA和丙二酸-CoA合成己二酸[8]。而對(duì)LipPks1聚酮合酶進(jìn)行多輪的結(jié)構(gòu)域替換與突變，可以合成多種酮類化合物(C6和C7乙基酮，C5和C6甲基酮)[9]。也有研究表達(dá)聚酮合酶SgcE與硫酯酶SgcE10來(lái)合成C15的直鏈烯烴[10]，而改變硫酯酶SgcE10的特異性，將可能獲得中鏈烯烴。目前，相當(dāng)多的研究聚焦于次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)的聚酮合酶的發(fā)現(xiàn)與表征，改造與重設(shè)計(jì)聚酮合酶的研究尚不多，主要原因是聚酮合成機(jī)制較復(fù)雜，理性改造的難度較大。

2.4 α-酮酸延伸

該碳鏈延伸途徑(圖1d)與氨基酸合成有關(guān)，天然α-酮酸延伸途徑通常只催化一輪反應(yīng)，使底物增加一個(gè)亞甲基[11]。由于異丙基蘋果酸合酶(Isopropylmalate synthase)的底物混雜性，該酶可使用氨基酸代謝產(chǎn)生的C6支鏈α-酮酸為底物，經(jīng)一輪延伸反應(yīng)，合成C7產(chǎn)物[12]。而通過(guò)蛋白質(zhì)工程擴(kuò)大其底物結(jié)合口袋，可使延伸循環(huán)次數(shù)增加，進(jìn)而合成C6-8直鏈醇[13]。α-酮酸延伸使用乙酰-CoA為延伸單元，但每輪反應(yīng)只增加一個(gè)碳原子，另一個(gè)碳原子經(jīng)脫羧反應(yīng)損失，因此該途徑的碳原子利用效率不高，從而限制其應(yīng)用。

2.5 其他途徑

異戊烯合成途徑使用C5單元，其中以香葉基焦磷酸為中間體，可形成10碳支鏈產(chǎn)物，例如香葉醇。另外脂肪酸β-氧化途徑可對(duì)高碳鏈底物進(jìn)行裁剪，但該途徑依賴于長(zhǎng)鏈脂肪酸，原子經(jīng)濟(jì)性較差。

3 鏈長(zhǎng)控制

利用不同的碳鏈延伸途徑，并且調(diào)控產(chǎn)物鏈長(zhǎng)，是合成中鏈產(chǎn)物的關(guān)鍵。與產(chǎn)物鏈長(zhǎng)控制相關(guān)的酶包括硫酯酶、酮酰合酶、硫解酶和?；D(zhuǎn)移酶。

3.1 硫酯酶

酰基-?；d體蛋白(Acyl Carrier Protein，ACP)硫酯酶催化水解?；cACP的磷酸泛酰巰基乙胺之間的硫酯鍵，釋放出游離脂肪酸，使ACP再生并用于下一輪脂肪酸合成，而?；?ACP硫酯酶的鏈長(zhǎng)特異性決定脂肪酸產(chǎn)物鏈長(zhǎng)。從加州月桂(Umbellulariacalifornica)中找到的中鏈?；?ACP硫酯酶BTE，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥積累大量C12脂肪酸[14]，且高產(chǎn)C12脂肪酸的轉(zhuǎn)基因油菜已商業(yè)化種植[15]。在缺失脂肪酸降解途徑(敲除fadD或fadE基因)的大腸埃希菌中表達(dá)?；?ACP硫酯酶BTE，可使該細(xì)菌大量分泌C12脂肪酸，表明通過(guò)硫酯酶調(diào)控脂肪酸鏈長(zhǎng)具有可行性[16]。使用木質(zhì)纖維素作為底物，以大腸埃希菌等微生物為底盤合成脂肪酸及其衍生燃料化學(xué)品(如脂肪酸乙酯、脂肪醇等)，是生物燃料綠色制造的重要路線[17-18]，且通過(guò)表達(dá)中短鏈硫酯酶來(lái)調(diào)整產(chǎn)物鏈長(zhǎng)，有望生產(chǎn)出可替代汽油(平均碳鏈長(zhǎng)度C8)及航空煤油(平均碳鏈長(zhǎng)度C11)的生物燃料分子[19-20]。

?；?ACP硫酯酶大多兼具酰基-CoA硫酯酶活性，可用于逆β-氧化途徑的鏈長(zhǎng)控制，如過(guò)表達(dá)大腸埃希菌內(nèi)源硫酯酶tesA和ydiI，可顯著提高中鏈脂肪酸合成水平[4-5，21]。最近報(bào)道細(xì)菌硫酯酶AtTE(源自Anaerococcustetradium)可能更偏好?；?CoA底物，使表達(dá)的逆β-氧化途徑與內(nèi)源脂肪酸合成途徑正交[22]。

由于硫酯酶在產(chǎn)物鏈長(zhǎng)控制方面的重要作用，通過(guò)家族序列特征挖掘硫酯酶或通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段提高硫酯酶活性或特異性，都有許多成功的例子。例如，根據(jù)序列親緣關(guān)系和來(lái)源物種的脂肪酸組成，選擇31條硫酯酶基因，表征并歸類這些硫酯酶的底物特異性，發(fā)現(xiàn)多個(gè)合成中短鏈脂肪酸的硫酯酶[23]。硫辛酸合成缺陷菌株(ΔlipB)的生長(zhǎng)依賴辛酸(C8)，使用該宿主篩選CpFatB1基因的隨機(jī)突變文庫(kù)，可獲得高特異性合成辛酸的突變體[24]。使用迭代蛋白重設(shè)計(jì)算法指導(dǎo)大腸埃希菌tesA改造，也改變了該硫酯酶的鏈長(zhǎng)特異性[25]；另外根據(jù)tesA蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)底物結(jié)構(gòu)口袋進(jìn)行改造，使該酶對(duì)?；?ACP(C8)的底物選擇性提高了133倍，而表達(dá)RD-2突變體(E142D、Y145G、M141L、L146K)使C8脂肪酸的合成量提高了10倍[26]。針對(duì)酵母和細(xì)菌來(lái)源的I型脂肪酸合酶，筆者研究發(fā)現(xiàn)其反應(yīng)活性空腔存在富余空間，可嵌入中短鏈硫酯酶以劫持中間體，并證明重設(shè)計(jì)的脂肪酸合酶可合成中鏈脂肪酸[27-28]，且已利用該重設(shè)計(jì)的脂肪酸合酶為下游中鏈化合物合成提供前體[29]。

3.2 酮酰合酶

酮酰合酶催化酰基-CoA/ACP與丙二酰-ACP發(fā)生Claisen縮合反應(yīng)，該酶底物結(jié)合口袋空間是影響鏈長(zhǎng)的重要因素。大腸埃希菌含3個(gè)酮酰合酶編碼基因(FabH、FabB和FabF)，并具有不同的底物特異性。FabH對(duì)乙酰-CoA具有選擇性，特異性催化脂肪酸鏈延伸的起始反應(yīng)形成乙酰乙酰-ACP，而FabB和FabF則催化后續(xù)Claisen縮合反應(yīng)[30]。FabF底物結(jié)合口袋存在特定異亮氨酸殘基I108，可根據(jù)?；兼滈L(zhǎng)度調(diào)整構(gòu)象，而突變?cè)摪被釣楸奖彼?，可使FabF催化C6以上底物的活性顯著減弱[31]，從而限制長(zhǎng)鏈脂肪酸合成。線粒體II型脂肪酸合成系統(tǒng)和真菌I型脂肪酸合酶的酮酰合酶也存在相似的Gatekeeper殘基，例如酵母Fas2蛋白的M1251殘基，如果突變其鄰近的G1250為絲氨酸，限制M1251側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)，或直接突變M1251為大側(cè)鏈色氨酸，可使酵母脂肪酸合酶催化產(chǎn)生中短鏈脂肪酸[2，27，32]，引入類似突變到細(xì)菌I型脂肪酸合酶，也能獲得合成中鏈脂肪酸的突變體[28，33]。

3.3 硫解酶

硫解酶可分為合成型(如乙酰乙酰-CoA硫解酶)和分解型(如β-酮酰-CoA硫解酶)。分解型硫解酶熱力學(xué)上偏好于催化β-酮酰-CoA裂解，但是在偶聯(lián)下游熱力學(xué)偏好反應(yīng)(如烯酰-CoA還原)情況下，可催化兩種?；?CoA發(fā)生Claisen縮合反應(yīng)[4，34]。硫解酶的底物特異性對(duì)產(chǎn)物鏈長(zhǎng)起決定性作用，然而該酶的鏈長(zhǎng)控制機(jī)制尚不清楚。篩選并測(cè)試不同來(lái)源的硫解酶有助于獲得可特異性催化合成特定鏈長(zhǎng)產(chǎn)物的硫解酶，通過(guò)序列相似性網(wǎng)絡(luò)(Sequence Similarity Network)分析，找到了區(qū)別于聚羥基烷酸和脂肪酸降解途徑的硫解酶，該酶可用于合成C8和C10脂肪酸[22]。蛋白質(zhì)工程改造也能提高硫解酶的鏈長(zhǎng)選擇性，模型指導(dǎo)的底物結(jié)合位點(diǎn)重設(shè)計(jì)，使硫解酶合成產(chǎn)物中C6/C4的比例提高10倍[35]。近期研究發(fā)現(xiàn)，硫解酶介導(dǎo)的碳鏈延伸也可以接受β-酮酰-CoA為底物，實(shí)現(xiàn)聚酮化合物合成[36]，硫解酶在碳鏈延伸反應(yīng)過(guò)程中的底物混雜性，有望用于擴(kuò)展生物合成化學(xué)品的結(jié)構(gòu)多樣性[34，37]。

3.4 ?；D(zhuǎn)移酶

酰基轉(zhuǎn)移酶在脂肪酸合酶和聚酮合酶中，催化?；?CoA與酰基-ACP間發(fā)生可逆的轉(zhuǎn)?；磻?yīng)。該酶活性中心存在保守絲氨酸殘基，該絲氨酸殘基的羥基與?；纬甚ブ虚g體。不同脂肪酸合酶系統(tǒng)中，?；D(zhuǎn)移酶的催化特性與底物選擇性不一樣。例如大腸埃希菌FabD催化丙二酰-CoA為丙二酰-ACP；動(dòng)物脂肪酸合酶的丙二酰/乙酰轉(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu)域可轉(zhuǎn)移乙酰-CoA和丙二酰-CoA兩種底物，且還能識(shí)別多種CoA硫酯[38]；而真菌I型脂肪酸合酶含有兩個(gè)?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，催化乙酰-CoA的乙?；D(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域和催化丙二酰-CoA與長(zhǎng)鏈終產(chǎn)物棕櫚酰-ACP的丙二酰/棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(MPT)結(jié)構(gòu)域。突變釀酒酵母脂肪酸合酶AT結(jié)構(gòu)域(I306A)可增加對(duì)底物乙酰-CoA的親和力，而突變MPT結(jié)構(gòu)域(R1834K)則減少對(duì)底物丙二酰-CoA的親和力，這兩種突變改變進(jìn)入脂肪酸鏈延伸反應(yīng)的兩種底物(乙酰-CoA和丙二酰-CoA)的比例，從而使脂肪酸合酶合成中鏈脂肪酸[32-33]。

4 前體供應(yīng)

中鏈化學(xué)品合成依賴細(xì)胞代謝提供前體，并通過(guò)前述碳鏈延伸途徑合成中鏈脂肪酸等平臺(tái)化合物。乙酰-CoA和還原型輔因子是碳鏈延伸途徑的關(guān)鍵前體底物，而這兩種代謝物供應(yīng)的原子經(jīng)濟(jì)性及能量轉(zhuǎn)化效率是影響產(chǎn)物合成的重要因素。

4.1 乙酰-CoA

乙酰-CoA是細(xì)胞內(nèi)重要的C2中心代謝物，是許多產(chǎn)物(如脂肪酸、聚酮、萜類化合物)的前體，并通過(guò)乙?；揎梾⑴c細(xì)胞調(diào)控過(guò)程[39]。提高乙酰-CoA的供給，對(duì)平臺(tái)細(xì)胞工廠的創(chuàng)制非常重要[40]。Nielsen課題組對(duì)釀酒酵母乙酰-CoA供給進(jìn)行了系統(tǒng)改造，包括引入多條乙酰-CoA合成途徑，并結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化手段對(duì)胞內(nèi)初級(jí)代謝進(jìn)行了重塑(例如阻斷乙醇發(fā)酵，消除Crabtree效應(yīng))，并用于目標(biāo)產(chǎn)物的合成[40-46]。大腸埃希菌等原核微生物的丙酮酸脫氫酶位于胞漿中，上調(diào)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物基因表達(dá)，并通過(guò)質(zhì)?？截悢?shù)調(diào)諧表達(dá)水平，增加了乙酰-CoA合成，并提升脂肪酸產(chǎn)量[47]。通過(guò)提高丙酮酸合成通量、減少乙酸代謝溢流以及提升CoA合成水平，也能增加乙酰-CoA供給[48]。此外設(shè)計(jì)構(gòu)建新型乙酰-CoA合成途徑，例如非氧化糖酵解途徑可保留葡萄糖的所有碳原子，有望提高碳源轉(zhuǎn)化得率[48-49]。從頭設(shè)計(jì)羥基乙醛合酶和乙酰磷酸合酶，可使甲醛經(jīng)3步反應(yīng)形成乙酰-CoA，該精簡(jiǎn)途徑不需要ATP輸入，為C1底物原料的生物煉制提供同化途徑[50]。

4.2 還原型輔因子

脂肪酸類產(chǎn)物的還原度高，其合成需要大量還原型輔因子，如逆β-氧化途徑使用NADH為輔因子[51]，而脂肪酸合成途徑則主要使用NADPH[52]，因此提升細(xì)胞內(nèi)NAD(P)H水平和可及性是改善產(chǎn)物合成效率的有效手段[53]。過(guò)表達(dá)NAD+依賴型甲酸脫氫酶，不僅促進(jìn)甲酸副產(chǎn)物利用，還可以利用外加甲酸為細(xì)胞供給NADH，從而有效提高逆β-氧化途徑的中鏈脂肪酸合成能力[54]。對(duì)于脂肪酸合成途徑，為提高NADPH水平，通常過(guò)表達(dá)中心代謝途徑中產(chǎn)生NADPH的酶(如磷酸戊糖途徑、異檸檬酸脫氫酶、蘋果酸酶、NADP+依賴型3-磷酸甘油醛脫氫酶等)，或催化NAD(H)轉(zhuǎn)化為NADP(H)的NAD激酶和轉(zhuǎn)氫酶(如PntAB和Udh)，或改造目標(biāo)途徑使用NADH輔因子。例如，使用NADH依賴型酮酰-ACP還原酶fabG(源自Cupriavidustaiwanensis)，脂肪酸產(chǎn)量提升了60%[55]。Stephanopoulos課題組系統(tǒng)評(píng)估了解脂耶氏酵母(Yarrowialipolitica)的氧化還原代謝，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)NADP+依賴型3-磷酸甘油醛脫氫酶、NADP+依賴型蘋果酸酶可提高脂質(zhì)得率到0.28 g/g的最高水平[56]。在釀酒酵母中，過(guò)表達(dá)蘋果酸酶和磷酸戊糖途徑，并調(diào)諧磷酸葡萄糖異構(gòu)酶Pgi1的表達(dá)來(lái)控制磷酸戊糖途徑與糖酵解途徑的代謝流量分配，使脂肪酸產(chǎn)量提高了28%[44-45]。

5 代謝工程策略

天然菌株合成目標(biāo)產(chǎn)物的能力較低，要獲得符合工業(yè)生產(chǎn)要求的生產(chǎn)菌株，大多需要對(duì)出發(fā)菌種進(jìn)行多輪迭代改造，以提高底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度。隨著合成生物學(xué)工具研究的不斷擴(kuò)展，對(duì)細(xì)胞代謝的改造能力已達(dá)到前所未有的水平，并且會(huì)隨著組學(xué)大數(shù)據(jù)、自動(dòng)化設(shè)施、人工智能的應(yīng)用而進(jìn)一步深入。針對(duì)中鏈化學(xué)品制造，使用較多的代謝工程策略包括如下幾個(gè)方面。

5.1 Pull-Bush-Block

引入高活性酶催化不可逆的產(chǎn)物形成反應(yīng)(拉，Pull)、重編程中心代謝將前體導(dǎo)向目標(biāo)產(chǎn)物合成(推，Push)，阻斷非必需反應(yīng)減少副產(chǎn)物形成(阻，Block)是經(jīng)典的代謝工程策略。針對(duì)中鏈脂肪酸產(chǎn)物合成，表達(dá)硫酯酶，引入催化不可逆?；?ACP/CoA水解反應(yīng)，生成游離脂肪酸產(chǎn)物，是典型的Pull策略。該反應(yīng)減少?；?ACP/CoA積累，能解除脂肪酸合成途徑和逆β-氧化途徑的反饋抑制作用[57]；在酵母中，也可以敲除?；?CoA合成酶編碼基因FAA1和FAA4，使細(xì)胞積累和分泌脂肪酸[58]。除了提高乙酰-CoA和還原型輔因子的供應(yīng)外，針對(duì)脂肪酸合成途徑，提高丙二酰-CoA的水平對(duì)于推動(dòng)(Push)前體進(jìn)入脂肪酸合成途徑有重要作用。過(guò)表達(dá)乙酰-CoA羧化酶，在原核和真核微生物中均能提高脂肪酸或脂質(zhì)產(chǎn)量[58-60]。釀酒酵母乙酰-CoA羧化酶Acc1受磷酸化修飾調(diào)節(jié)，突變主要的磷酸化位點(diǎn)(S659和S1157)，可以提高脂肪酸乙酯產(chǎn)量[61]。結(jié)構(gòu)分析表明，S1157磷酸化位點(diǎn)位于非必需Loop區(qū)域(1137到1170)，該區(qū)域缺失可解除Acc1的磷酸化調(diào)節(jié)，并對(duì)脂肪酸合成有利[28，62]。脂肪酸降解途徑主要為β-氧化，為更好積累產(chǎn)物，一般均需要敲除β-氧化途徑的關(guān)鍵編碼基因，如大腸埃希菌的fadD/fadE[17，63]、釀酒酵母的POX1[44，58]、解脂耶氏酵母的MFE1[64]。對(duì)于酵母細(xì)胞，脂肪酸產(chǎn)物還可以用于合成甘油三酯、甾醇酯和磷脂，消除或減弱這些儲(chǔ)存脂質(zhì)的合成，可使碳流更多地導(dǎo)向脂肪酸產(chǎn)物形成[64-66]。此外，阻斷中心代謝途徑副產(chǎn)物形成，可實(shí)現(xiàn)代謝流匯聚，例如消除大腸埃希菌的發(fā)酵途徑，包括敲除adhE(乙醇形成)、ldhA(乳酸形成)、frdA(琥珀酸形成)和pta/poxB(乙酸形成)[51]。乙醇作為釀酒酵母的主要副產(chǎn)物，Nielsen課題組嘗試了消除乙醇形成途徑，并使釀酒酵母從醇類發(fā)酵轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣芍舅醄45]。

5.2 蛋白改造與重設(shè)計(jì)

中鏈脂肪酸合成需要對(duì)鏈長(zhǎng)進(jìn)行控制，已有多項(xiàng)研究對(duì)控制鏈長(zhǎng)的關(guān)鍵酶或催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改造(見(jiàn)小節(jié)3)。合成途徑的輔因子不適配也需對(duì)酶的輔因子依賴型進(jìn)行改造，與NAD(H)相比，NADP(H)的腺苷核糖環(huán)2′位連接磷酸基團(tuán)，與該環(huán)2′和3′位基團(tuán)相互作用的氨基酸殘基決定酶的輔因子特異性。Arnold課題組開(kāi)發(fā)了一種改變輔因子特異性的通用在線分析工具CSR-SALAD，可分析蛋白結(jié)構(gòu)，并預(yù)測(cè)需要改變的氨基酸位點(diǎn)[67]，該輔因子依賴型改造方法可用于調(diào)整輔因子不平衡問(wèn)題。膜轉(zhuǎn)運(yùn)子可促進(jìn)底物進(jìn)入細(xì)胞或產(chǎn)物分泌，是代謝工程操作的重要靶點(diǎn)，然而許多膜轉(zhuǎn)運(yùn)子的結(jié)構(gòu)及功能并不清楚。定向進(jìn)化是改造膜轉(zhuǎn)運(yùn)子的有效手段，針對(duì)辛酸耐受相關(guān)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)子Tpo1，筆者構(gòu)建隨機(jī)突變文庫(kù)，富集并篩選出可增加酵母辛酸耐受性的突變體M49(含F(xiàn)322L、T45S和I432N突變)，該突變體能提高多種胞外中鏈酸的產(chǎn)量[28]。

5.3 自適應(yīng)進(jìn)化

中鏈化學(xué)品對(duì)細(xì)胞具有較大毒性，且理性改善細(xì)胞耐受性難度較大。自適應(yīng)進(jìn)化利用細(xì)胞復(fù)制產(chǎn)生的自發(fā)突變，通過(guò)施加脅迫因子富集有利突變，最終獲得耐受表型。自適應(yīng)進(jìn)化已廣泛應(yīng)用于提高細(xì)胞工廠的耐受性，并提升產(chǎn)物的合成[68]。對(duì)大腸埃希菌進(jìn)行自適應(yīng)進(jìn)化，提高其辛酸耐受性，所獲菌株可耐受30 mmol/L辛酸，且辛酸產(chǎn)量從32 mg/L提高到180 mg/L[69]。中鏈脂肪酸對(duì)酵母細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)，低至1 mmol/L即產(chǎn)生較大毒性[70]。筆者使用自適應(yīng)進(jìn)化手段，使釀酒酵母細(xì)胞在含辛酸的培養(yǎng)基中馴化約100 d，最終獲得辛酸耐受能力顯著改善的突變菌株，該菌株中鏈脂肪酸合成產(chǎn)量提高了2～3倍[28]。中鏈二羧酸可作為聚合物單體，自適應(yīng)進(jìn)化能提高釀酒酵母對(duì)戊二酸、己二酸和庚二酸的耐受性[71]。對(duì)進(jìn)化菌株進(jìn)行重測(cè)序，并與出發(fā)菌株進(jìn)行比較分析，可鑒定進(jìn)化菌株中的基因突變，結(jié)合CRISPR基因編輯工具，進(jìn)行反向工程和表型分析，可找到主效突變[68]。然而，當(dāng)存在許多中性突變時(shí)(不引起表型變化的突變)，鑒定主效突變將相當(dāng)困難。酵母細(xì)胞可進(jìn)行有性生殖，將進(jìn)化菌株與相反交配型出發(fā)菌株雜交形成二倍體，然后減數(shù)分裂形成子代單倍體，可實(shí)現(xiàn)突變等位基因的重組與分離，對(duì)子代細(xì)胞進(jìn)行表型分析，并選取目標(biāo)表型子代細(xì)胞進(jìn)行基因組測(cè)序分析，在具有目標(biāo)表型的子代細(xì)胞中富集的突變基因?qū)⒋蟾怕蕿橹餍Щ颉＝湍赣行陨程匦詾橹餍Щ虬l(fā)現(xiàn)提供便利，是理想的生物材料。

5.4 遺傳編碼的生物傳感器

傳統(tǒng)代謝物或產(chǎn)物的檢測(cè)和定量依賴體外分析技術(shù)，如氣相色譜、液相色譜等，但這些檢測(cè)方法的通量比較低(10～1 000樣品/d)。生物傳感器可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞代謝物水平，通過(guò)耦聯(lián)合適的基因調(diào)節(jié)回路，還可實(shí)時(shí)對(duì)代謝途徑進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)，因此生物傳感器可滿足合成細(xì)胞工廠構(gòu)建過(guò)程中的高通量分析檢測(cè)和動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控需求[72]。感知脂肪酸產(chǎn)物或前體的生物傳感器已應(yīng)用于脂肪酸類產(chǎn)物的生物合成調(diào)控。例如使用識(shí)別?；?CoA的轉(zhuǎn)錄因子FadR調(diào)控乙醇、?；?CoA和脂肪酸乙酯合成相關(guān)基因的表達(dá)，使脂肪酸乙酯產(chǎn)量提升，并顯著降低副產(chǎn)物積累[73]；使用FadR控制生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)，使低產(chǎn)脂肪酸菌株的生長(zhǎng)受抑制，對(duì)細(xì)胞群體的生產(chǎn)性能進(jìn)行質(zhì)量控制，使脂肪酸產(chǎn)量提升3倍，發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到21.5 g/L[74]?，F(xiàn)已開(kāi)發(fā)出識(shí)別中鏈脂肪酸的生物傳感器，包括基于G-蛋白偶聯(lián)受體OR1G1和PDR12啟動(dòng)子的傳感系統(tǒng)[75-76]，可用于基因組過(guò)表達(dá)文庫(kù)篩選，并找到KCS1和FSH2兩個(gè)基因，其過(guò)表達(dá)提高辛酸產(chǎn)量約60%[77]。后續(xù)研究設(shè)計(jì)特異性更好、動(dòng)態(tài)范圍更廣的生物傳感器，用于多種文庫(kù)的篩選，例如RNAi和CRISPRi基因表達(dá)抑制文庫(kù)，可找到以前未被認(rèn)知的靶點(diǎn)基因[78]。

6 中鏈衍生化學(xué)品合成

以中鏈脂肪酸為前體，通過(guò)化學(xué)與生物合成方法可獲得許多衍生化學(xué)品。生物催化的衍生反應(yīng)主要發(fā)生在羧基官能團(tuán)，包括還原反應(yīng)、脫羧反應(yīng)、α-氧化、β-氧化、酯化反應(yīng)等(圖2)。P450酶可催化脂肪酸不同位置的碳?xì)滏I活化，并擴(kuò)展了脂肪酸結(jié)構(gòu)多樣性，形成內(nèi)酯、ω-羥基脂肪酸等。其中ω-羥基脂肪酸是聚合物單體，可進(jìn)一步形成ω-二羧酸、ω-氨基脂肪酸等。下面將對(duì)幾種重要衍生反應(yīng)進(jìn)行介紹。

圖2 中鏈脂肪酸衍生化學(xué)品

6.1 羧基還原

羧基還原是合成醇、烷烴和烷基乙酸酯的重要反應(yīng)，由于化學(xué)惰性，羧基往往需要激活后才參與化學(xué)反應(yīng)?，F(xiàn)有參與羧酸生物還原的酶都使用激活的羧酸硫酯(如酰基-CoA/ACP/PCP)為底物。其中羧酸還原酶為特殊非核糖體多肽合成酶，其腺苷化結(jié)構(gòu)域催化轉(zhuǎn)移羧酸到肽基載體蛋白形成硫酯中間體(酰基-PCP)，然后經(jīng)還原酶結(jié)構(gòu)域催化該中間體為脂肪醛[79]。羧酸還原酶整合了羧酸激活和還原兩種活性，并使用羧酸為直接底物，在催化還原脂肪酸的過(guò)程中有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞內(nèi)?；?CoA/ACP對(duì)脂肪酸合酶有反饋抑制作用[58]，為提高脂肪酸合成的代謝通量，一般采用硫酯酶釋放游離脂肪酸來(lái)消除?；?CoA/ACP積累[63]，從而解除反饋抑制。在這種情況下，細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸的濃度較?；?CoA/ACP硫酯高很多，相較于酰基-CoA/ACP還原酶，羧酸還原酶催化脂肪酸還原在動(dòng)力學(xué)上優(yōu)勢(shì)明顯，且評(píng)估多種脂肪酸還原酶對(duì)脂肪醇形成的影響，也表明羧酸還原酶性能最好[44]。由于羧酸還原酶底物特異性不好，筆者采用多種蛋白質(zhì)改造手段，包括理性定點(diǎn)突變縮小腺苷化結(jié)構(gòu)域的底物結(jié)合口袋、定點(diǎn)飽和突變消除還原酶的構(gòu)象調(diào)控、定向進(jìn)化提高轉(zhuǎn)化中鏈脂肪酸的能力，最好的羧酸還原酶突變體可提高中鏈醇產(chǎn)量約3倍[80]。

以脂肪醛為底物，經(jīng)醇脫氫酶或醛還原酶催化可合成脂肪醇。Pfleger課題組一直致力于辛醇合成，前期工作包括篩選合適的CpFatB1硫酯酶突變體[24]，通過(guò)表達(dá)特異性更好的酰基-CoA合成酶(源自Mycobacteriumtuberculosis的FadD6)和?；?CoA還原酶(源自Marinobacteraquaeolei的ACR)，其他優(yōu)化包括染色體整合型表達(dá)，提高?；?CoA合成酶基因拷貝數(shù)等，使辛醇產(chǎn)量達(dá)到1.3 g/L水平，占總脂肪醇產(chǎn)量的90%以上[81]。該課題組也在脂肪酸合成途徑和逆β-氧化途徑菌株中表達(dá)?；?CoA還原酶，使中鏈脂肪醇產(chǎn)量分別達(dá)到1.6 g/L和1.8 g/L水平[82-83]。在解脂耶式酵母中過(guò)表達(dá)中鏈硫酯酶(源自Cupheapalustris)和?；?CoA還原酶(源自Arabidopsisthaliana)，并敲除PEX10基因，獲得0.5 g/L的癸醇[84]。使用光合藍(lán)細(xì)菌為底盤，通過(guò)固定CO2和光能合成目標(biāo)產(chǎn)物，是一種低碳合成策略，Jones課題組使用羧酸還原酶催化脂肪酸還原，使光合藍(lán)細(xì)菌合成0.1 g/L的辛醇和癸醇，并發(fā)現(xiàn)中鏈脂肪酸前體不足是醇類產(chǎn)量受限的主要原因。以釀酒酵母為底盤，在表達(dá)脂肪酸合酶突變體形成辛酸的基礎(chǔ)上，過(guò)表達(dá)羧酸還原酶，可形成約50 mg/L的辛醇[85]。筆者在前期構(gòu)建的中鏈脂肪酸高產(chǎn)菌株中，過(guò)表達(dá)偏好中鏈底物的羧酸還原酶，敲除膜轉(zhuǎn)運(yùn)子Tpo1減少脂肪酸前體溢出胞外，最終搖瓶發(fā)酵合成252 mg/L的中鏈醇(C6-C12)[80]。脂肪醇進(jìn)一步與?；?CoA反應(yīng)合成酯，且?；?CoA硫酯鍵斷裂為反應(yīng)提供自由能，細(xì)胞內(nèi)乙酰-CoA是豐度最高的酰基-CoA分子，合成乙酸烷基酯的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)最具優(yōu)勢(shì)[86]，而且合成的乙酸酯對(duì)細(xì)胞的毒性較低[87]，因此中鏈醇乙酸酯目標(biāo)分子的合成具有多種優(yōu)勢(shì)。

脂肪醛經(jīng)脫羰基反應(yīng)形成烷烴分子，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)包括脂肪醛脫甲酰加氧酶(fatty aldehyde deformylating oxygenase，ADO)、植物膜結(jié)合脫羰基酶(CER1)和昆蟲P450氧化脫羰基酶(CYP4G1)可催化脂肪醛形成烷烴。與另外兩種酶相比，ADO為可溶性蛋白，不同宿主中均可表達(dá)ADO合成烷烴[88-89]。大腸埃希菌表達(dá)硫酯酶tesA(L109P突變體)、?；?CoA還原酶(源自Clostridiumacetobutylicum)和醛脫羰基酶CER1(源自Arabidopsisthaliana)，組合其他改造，補(bǔ)料批式發(fā)酵可合成0.5 g/L烷烴[19]。筆者在產(chǎn)中鏈酸的酵母細(xì)胞中，表達(dá)羧酸還原酶，同時(shí)測(cè)試了10余種ADO及其偏好中鏈底物的突變體，發(fā)現(xiàn)源自嗜熱藍(lán)細(xì)菌(Thermosynechococcuselongatus)的ADO催化性能最佳[29]。由于脂肪醛中間體易被還原為脂肪醇而形成副產(chǎn)物，將烷烴合成途徑區(qū)域化到過(guò)氧化物酶體，可顯著減少醛類還原，從而增加烷烴的合成量[29，90]。前述三種酶催化烷烴合成的效率均不高，提高這些酶的催化性能是未來(lái)需要解決的主要瓶頸問(wèn)題。

6.2 脫羧反應(yīng)

已報(bào)道多種酶可催化脂肪酸脫羧形成端位烯烴，包括P450脫羧酶OleT、非血紅素-鐵(II)-氧化酶UndA、膜結(jié)合的類脂肪酸去飽和酶UndB，以及脂肪酸光脫羧酶FAP[91]。使用這些酶催化中鏈脂肪酸脫羧形成中鏈端位烯烴也有較多報(bào)道，例如優(yōu)化OleT的氧化還原電子傳遞鏈，包括使用putidaredoxin作為電子傳遞系統(tǒng)，可以合成0.93 g/L的中短鏈烯烴(C3-C8)[92]。在大腸埃希菌中表達(dá)UndA，可合成超過(guò)5 mg/L的C11烯烴[93]，筆者在釀酒酵母中表達(dá)UndA，可合成3 mg/L的端位烯烴，其中C9和C11是主要產(chǎn)物[29]。在脂肪酸脫羧過(guò)程中，UndA的輔因子Fe(II)轉(zhuǎn)化為Fe(III)，而細(xì)胞內(nèi)再生該輔因子的還原劑尚未找到，限制了UndA的催化效率。UndB可合成不同鏈長(zhǎng)(C9-C17)的端位烯烴[94-95]，且還可以轉(zhuǎn)化α,ω-二羧酸為α,ω-二烯烴[96]。另外在藻類中發(fā)現(xiàn)了一種光催化型脫羧酶FAP[97]，F(xiàn)AP可催化長(zhǎng)鏈脂肪酸脫羧，通過(guò)加入不同鏈長(zhǎng)烷烴為誘導(dǎo)劑，可使短鏈羧酸發(fā)生脫羧反應(yīng)[98]。在大腸埃希菌中表達(dá)中鏈硫酯酶和FAP，可形成C11和C13烷烴，表明FAP具有催化中鏈脂肪酸脫羧活性[99]。與ADO相比，F(xiàn)AP催化烷烴合成的產(chǎn)量更高[100]，但藍(lán)光輸入顯著增加成本，若能改變其催化所需光的波長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)自然光下烷烴高效合成，并以光合微生物為底盤合成烴類，將顯著提高經(jīng)濟(jì)性。

6.3 ω-官能團(tuán)化

中鏈脂肪酸末端修飾羥基、羧基和氨基等，可用作可再生聚合物材料的單體。多種酶可以催化烷基羥基化[101]，這些酶為脂肪酸末端修飾提供基礎(chǔ)，例如P450單加氧酶或整合膜蛋白AlkB(烷烴單加氧酶)可催化ω-羥基化[102]。已報(bào)道能催化ω-羥基化的P450酶的種類和數(shù)量也比較多，但這些酶大多存在電子傳遞鏈復(fù)雜、底物特異性差、羥基化位點(diǎn)不專一等問(wèn)題[103]。CYP153家族的P450單加氧酶催化ω-羥基化的位置選擇性好，且為可溶性P450酶，其結(jié)構(gòu)信息豐富，酶催化機(jī)制比較清楚，有助于酶的理性改造[104-106]，使用CYP153合成ω-羥基脂肪酸將是比較理想的選擇。AlkB單加氧酶催化脂肪酸ω-羥基化的研究也比較多，由于是膜蛋白，獲得晶體結(jié)構(gòu)比較困難，所以其改造和設(shè)計(jì)只能采用不依賴于結(jié)構(gòu)的定向進(jìn)化策略[107]。使用熱帶假絲酵母為生物催化劑，轉(zhuǎn)化烷烴或脂肪酸甲酯為二羧酸已經(jīng)商業(yè)化。而轉(zhuǎn)化細(xì)胞自身合成的脂肪酸為ω-官能團(tuán)化產(chǎn)物，將創(chuàng)制出一條完全依賴可再生原料的合成路線，例如在合成中鏈脂肪酸的酵母中，表達(dá)P450單加氧酶合成8-羥基辛酸，可獲得3 mg/L的產(chǎn)物[108]，由于產(chǎn)量很低，后續(xù)仍需對(duì)酶和菌株進(jìn)行大量改造工作。

6.4 其他

中鏈酰基-CoA與醇類分子合成的中鏈酯可作為食用香精，例如己酸乙酯是濃香型白酒中主要的呈香成分。此外脂肪酸合成或降解途徑的中間體(α,β-不飽和脂肪酸、β-羥基脂肪酸和β-酮酸)也是重要的高值產(chǎn)物，如3-羥基脂肪酸是合成聚羥基烷酸的前體，β-酮酸脫羧可形成甲基酮。脂肪酸α-氧化使脂肪酸丟失一個(gè)碳原子形成奇數(shù)碳脂肪酸，或脂肪醇[109]，從而可擴(kuò)展中鏈產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)多樣性。

7 結(jié) 語(yǔ)

與其他鏈長(zhǎng)(長(zhǎng)鏈和短鏈)的脂肪酸相比，中鏈脂肪酸生物合成的難度更大，主要原因：①鏈長(zhǎng)控制困難，盡管已獲得多種硫酯酶和脂肪酸合酶突變體，或者使用逆β-氧化途徑合成中鏈脂肪酸，但精準(zhǔn)控制脂肪酸的鏈長(zhǎng)還比較困難，所獲得的產(chǎn)物為混合物，增加了后續(xù)分離成本；②中鏈脂肪酸的細(xì)胞毒性大，尤其是對(duì)細(xì)胞膜的擾動(dòng)較強(qiáng)，需要提高底盤細(xì)胞的耐受能力。部分中鏈衍生物，例如中鏈烷基乙酸酯、中鏈二羧酸的毒性相對(duì)較低，以這些低毒性中鏈衍生物為目標(biāo)產(chǎn)物，可以規(guī)避毒性問(wèn)題。但中鏈衍生物合成過(guò)程的前體如脂肪酸、脂肪醛等容易溢出細(xì)胞外，如何調(diào)諧中間體溢出與下游途徑合成也是需要考慮的問(wèn)題。例如，我們前期發(fā)現(xiàn)敲除膜轉(zhuǎn)運(yùn)子Tpo1可減少胞外脂肪酸形成，同時(shí)增加了脂肪醇的產(chǎn)量[80]。由于中鏈產(chǎn)物的合成涉及蛋白、途徑和細(xì)胞生理等多個(gè)尺度的調(diào)控，亟需組合蛋白質(zhì)工程、途徑工程和細(xì)胞生理工程進(jìn)行多維度優(yōu)化，并結(jié)合理性設(shè)計(jì)與非理性突變進(jìn)行多尺度工程。