仲建鋒 李興奎 徐重新 張霄 劉賢金

（1. 江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，南京 210014；2. 鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鄭州 450121）

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種廣泛存在于各類環(huán)境中的昆蟲(chóng)病原菌，對(duì)多種農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性［1］。Cry1B是Bt Cry毒素的一種，其對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)的靶標(biāo)位點(diǎn)包括中腸刷狀緣膜囊泡（brush border membrane vesicles，BBMV）上的氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）、鈣粘蛋白（cadherin）［2-3］， 以 及 ABC 轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白［4］等。APN屬于鋅結(jié)合金屬蛋白酶家族蛋白，它的碳端結(jié)合部位富含N-乙酰氨半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc），這些區(qū)域是Cry毒素的結(jié)合位點(diǎn)［5］。煙芽夜蛾（Heliothis virescens）的170 kD的APN可與Cry1Aa、Cry1Ab 和 Cry1Ac結(jié)合［6］。卷葉蛾（Epiphyas postvittana）BBMV上的120 kD的APN可與Cry1Ac和Cry1Ba結(jié)合［7］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Cry1B抗獨(dú)特型（anti-idiotypic，anti-Id）單鏈抗體（single chain fragment variable，scFv）C7可以模擬Cry1B的結(jié)構(gòu)和功能［8］，因此推測(cè)C7與昆蟲(chóng)BBMV上的APN可能存在結(jié)合關(guān)系。但是C7的結(jié)合和生物活性跟原毒素Cry1B相比有差距，需要改進(jìn)提升。

單鏈抗體由重鏈可變區(qū)（heavy chain variable，VH）和輕鏈可變區(qū)（light chain variable，VL）通過(guò)一條單一肽鏈（linker）組成，大小為完整抗體分子的1/6，制備流程較簡(jiǎn)單，易進(jìn)行分子改造［9-10］。然而，基因工程抗體一般存在親和力低等問(wèn)題，以計(jì)算機(jī)模擬為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變可以預(yù)測(cè)分子間結(jié)合區(qū)域并確定關(guān)鍵氨基酸殘基［11］，關(guān)鍵氨基酸的有利突變可以提高抗體的親和力，在體外通過(guò)定點(diǎn)突變等基因工程手段可以構(gòu)建限定性突變抗體庫(kù)，進(jìn)而篩選到高親和力抗體［12］。Barderas等［13］在研究人類抗胃泌素TA4 scFv親和力成熟的過(guò)程中，在限定性突變的基礎(chǔ)上采取定點(diǎn)突變等方法，最終得到將TA4的親和力提高了454倍的突變scFv。Zhang等［14］在構(gòu)建了抗成纖維細(xì)胞活化蛋白scFv E3突變庫(kù)的前提下，對(duì)CDR區(qū)進(jìn)行了定點(diǎn)突變，其中重鏈33位氨基酸Asp變?yōu)镚ly，107位Tyr變?yōu)镠is效果最好，此E3 Mut2親和力提高了4倍。此方法目的明確，避免了隨機(jī)突變編碼可變區(qū)基因片段法隨意性大的缺點(diǎn)。

分子模擬技術(shù)在抗體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系分析、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)與改造等過(guò)程中得到了廣泛開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。本研究通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)指導(dǎo)抗體親和力成熟，借助分子模擬技術(shù)獲得對(duì)接復(fù)合物的關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域并預(yù)測(cè)熱點(diǎn)，利用熱點(diǎn)構(gòu)建飽和突變抗體庫(kù)，篩選出親和力和生物活性提高的突變體。以期進(jìn)一步對(duì)基因工程抗體結(jié)合區(qū)域改造指明方向。

1 材料與方法

1.1 材料

抗Cry1B毒素Ab2β 型scFv-C7來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室，使用噬菌體展示技術(shù)從Tomlinson I+J庫(kù)中篩選獲得，具殺蟲(chóng)活性［10］，還得到了與C7結(jié)構(gòu)相似的scFv-D5，但無(wú)殺蟲(chóng)活性（圖1）。CrylB購(gòu)于上海佑隆生物科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）TG1購(gòu)自英國(guó)劍橋MRC實(shí)驗(yàn)室；輔助噬菌體M13K07、Nco I酶、Not I酶、T4 DNA連接酶和Dpn I酶均購(gòu)于NEB公司；使用的其余試劑均為分析純。

圖1 CrylB毒素的anti-Id scFv C7和D5的氨基酸序列分析Fig. 1 Amino acid sequence alignment of anti-Id scFv C7 and D5 against Cry1B toxin

稻 縱 卷 葉 螟（Cnaphalocrocis medinalis） 源自揚(yáng)州綠源生物化工有限公司。試蟲(chóng)飼養(yǎng)溫度為（27±1）℃，相對(duì)濕度80%±5%，光照時(shí)間14 h，以水稻（Oryza sativa）葉片續(xù)代飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 ScFv-C7與稻縱卷葉螟APN的同源建模和分子對(duì)接 ScFv-C7的同源建模從Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫(kù)分別搜索VH、VL的同源序列，根據(jù)一致性確定模板。在分別構(gòu)建VH和VL的同源模型后，通過(guò)最小二乘法對(duì)蛋白質(zhì)主鏈結(jié)構(gòu)重疊以構(gòu)建C7三維結(jié)構(gòu)。稻縱卷葉螟APN（CmAPN，NCBI登錄號(hào)：ADZ05466.1）的建模則從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)搜索一致性較高的模板即可。采用Ramachandran plot對(duì)C7和APN三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估，評(píng)價(jià)其合理性。建模采用的Modeller程序由EasyModeller 4.0軟件［15］完成，Ramachandran plot分析由PROCHECK模塊評(píng)估（https：//saves.mbi.ucla.edu）完成，蛋白三維結(jié)構(gòu)輸出使用 PyMOL 1.3 軟件［16］。

使用ZDOCK在線程序（http：//zdock.umassmed.edu/）對(duì)scFv-C7和CmAPN進(jìn)行蛋白對(duì)接。采用KFC熱點(diǎn)預(yù)測(cè)（http：//kfc.mitchell-lab.org/）計(jì)算分析scFv-C7和CmAPN對(duì)接復(fù)合物，獲得二者接觸界面上互作的熱點(diǎn)殘基。

1.2.2 ScFv-C7定點(diǎn)突變抗體庫(kù)的構(gòu)建 采用大引物PCR法（megaprimer PCR）［17-18］進(jìn)行飽和突變，分析scFv-C7位于對(duì)接界面上的熱點(diǎn)殘基，選擇了scFv- C7的 H-CDR3區(qū) A123、Y124和 L-CDR2區(qū)S204、S207作為突變位點(diǎn)。LMB3和pHENseq是用來(lái)擴(kuò)增全長(zhǎng)序列的引物；NNK_VH是引入H-CDR3區(qū)A123、Y124飽和突變的引物；NNK_VL是引入L-CDR2區(qū)S204、S207飽和突變的引物（表1）。所有引物均由上海生工生物合成。

表1 飽和突變抗體庫(kù)構(gòu)建使用的引物序列Table 1 Primer sequences for the construction of sitedirected mutagenesis library

普通 PCR 擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，72oC 延伸10 min?！按笠铩盤(pán)CR 擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸10 min。為去除PCR產(chǎn)物中未突變的的模板質(zhì)粒，使用Dpn I酶消解處理。

分別將載體pIT2質(zhì)粒與定點(diǎn)飽和突變產(chǎn)物使用Nco I、Not I雙酶切處理，再用T4 DNA連接酶連接。使用BTX ECM 830電轉(zhuǎn)儀（Harvard Apparatus公司）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TG1感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)產(chǎn)物快速加入1 mL 2×TY培養(yǎng)基，37℃，200 r/min復(fù)蘇1 h；10倍梯度稀釋后涂布于TYE-AG平板，置于37℃過(guò)夜培養(yǎng)，計(jì)算庫(kù)容；然后將剩余復(fù)蘇產(chǎn)物離心后用100 μL 2×TY重懸沉淀，并均勻涂布于TYE-AG平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日，隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆，并用菌落PCR驗(yàn)證突變庫(kù)的準(zhǔn)確性，然后向TYEAG平板中加入1 mL 2×TY，用涂布棒刮起平板上的菌體細(xì)胞，并徹底混勻，所得即為定點(diǎn)飽和突變抗體庫(kù)。

1.2.3 定點(diǎn)飽和突變抗體庫(kù)的篩選

1.2.3.1 突變抗體庫(kù)的擴(kuò)增 取500 μL飽和突變庫(kù)加入到200 mL 2×TY-AG培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600=0.4），將2×1011PFU M13KO7輔助噬菌體加入到上述50 mL培養(yǎng)液中，37℃孵育30 min。剩余的150 mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，10 800× g離心10 min，去上清，并重懸至10 mL的2×TY（含15%甘油）中，最后分裝保存至超低溫冰箱。含輔助噬菌體的飽和突變庫(kù)菌液孵育后，3 000 × g離心10 min，棄上清，再用100 mL 2×TY-AKG將菌體沉淀重懸，30℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日，3 300 × g離心30 min，上清加入1/4體積的PEG/NaCl并充分混勻，冰浴1 h。3 300× g離心30 min，再用4 mL PBS重懸沉淀，最后11 600× g離心10 min，上清即為擴(kuò)增好的飽和突變抗體庫(kù)，可用于后續(xù)篩選。

1.2.3.2 稻縱卷葉螟B(niǎo)BMV對(duì)突變抗體庫(kù)的富集和篩選 使用稻縱卷葉螟4齡末期幼蟲(chóng)的中腸提取BBMV，采用Mg-EGTA沉降法制備［19］。篩選策略參考課題組前期方法［20］，略有改動(dòng)。采用逐漸降低包被濃度的固相篩選方法對(duì)擴(kuò)增好的飽和突變抗體庫(kù)進(jìn)行3輪篩選，稻縱卷葉螟B(niǎo)BMV（CmBBMV）的濃度分別是 100 μg/mL、50 μg/mL 和 25 μg/mL，以每孔4 mL包被6孔板。經(jīng)過(guò)3輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的篩選，使特異性結(jié)合的噬菌體得到有效富集。

1.2.3.3 單克隆ELISA鑒定 參考劍橋MRC和課題組前期的方法［20］，稍有改動(dòng)，從第3輪篩選后的平板中隨機(jī)挑取單菌落轉(zhuǎn)接至96孔板中培養(yǎng)；次日，從中取2 mL菌液轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，培養(yǎng)2 h后，每孔加入25 mL滴度為109的輔助噬菌體M13KO7，培養(yǎng)、離心、去上清，每孔加入200 mL 2×TY-AKG重懸細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜；次日離心，取上清液備用。取30 mg/mL CmBBMV包被96孔板，每孔100 mL。次日封閉后加入每孔100 mL單克隆表達(dá)上清。其余均為ELISA標(biāo)準(zhǔn)操作步驟，使用酶標(biāo)儀（Thermo）測(cè)定OD450值，陽(yáng)性/陰性值大于2.1，即可判斷為陽(yáng)性克隆。

1.2.4 突變抗體基因的測(cè)序與分析 選取在上述單克隆噬菌體ELISA分析中OD450值高于野生型scFv-C7的突變單克隆，按標(biāo)準(zhǔn)流程培養(yǎng)后提取質(zhì)粒、酶切、PCR鑒定和測(cè)序。序列比對(duì)分析使用ClustralW 2.0.10程序，圖像輸出使用Jalview 2.11軟件。

1.2.5 突變單鏈抗體與CmBBMV的結(jié)合能力分析 表面等離子體子共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)是一種快速監(jiān)測(cè)生物分子互作的方法。各樣品菌液的制備方法同抗體庫(kù)擴(kuò)增方法一致，使用20 mL 2×TY-AG培養(yǎng)體系，次日PEG/NaCl充分混勻后冰浴、離心后棄上清，再用10 mL PBS重懸沉淀，最后11 600 × g離心10 min，上清即為待測(cè)樣品，滴度為3.2×107CFU/mL。陽(yáng)性對(duì)照Cry1B毒素濃度20 μg/mL。

使用BIAcore X100 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)（GE Healthcare），所用材料購(gòu)自GE公司。CmBBMV先用PBS稀釋至500 mg/L待用，進(jìn)樣反應(yīng)再用NaAc稀釋到50 mg/L。各待測(cè)樣品均使用HBS-EP稀釋到指定濃度。

CmBBMV作為受體蛋白，通過(guò)氨基偶聯(lián)法固定到CM5傳感芯片上。將CM5傳感芯片F(xiàn)C1通道設(shè)為對(duì)照通道，F(xiàn)C2通道設(shè)為反應(yīng)通道?；罨疐C2通道待基線平穩(wěn)封閉，確定固定CmBBMV至芯片上的蛋白量。然后確定芯片再生反應(yīng)所需再生緩沖液Glycine-HCl的最適pH值。所有待測(cè)樣品勻速連續(xù)流過(guò)芯片表面，最后的傳感圖顯示FC2-FC1的響應(yīng)值（RU）。

1.2.6 突變單鏈抗體對(duì)稻縱卷葉螟的殺蟲(chóng)活性 采用浸葉法，生測(cè)樣品的制備同SPR分析一致，最終得到PEG/NaCl沉淀的上清（滴度3.2×107CFU/mL），Cry1B濃度也是20 μg/mL。將新鮮水稻葉片分別放入各種生測(cè)材料中浸漬后取出晾干，用于實(shí)驗(yàn)。將處理后的水稻葉片分別放入培養(yǎng)皿，每皿接入20頭3齡幼蟲(chóng)，24、48、72 h后分別記錄試蟲(chóng)狀態(tài)，每處理3次重復(fù)。試蟲(chóng)死亡率采用Abbott公式進(jìn)行校正，并以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。各處理時(shí)間樣品間采用單因素方差分析和Tukey顯著性比較，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 ScFv-C7與CmAPN三維結(jié)構(gòu)的同源建模及合理性評(píng)估

CrylB毒素anti-Id scFv C7的VH選取人類生殖細(xì)胞抗體3-23/B3（PDB：3QOS）作為同源建模的模板［21］，序列一致性為89%。C7的VL模板選取人類抗體Vκ域（PDB：2BX5）［22］，序列一致性達(dá)到了98%。分別構(gòu)建VH和VL的同源模型后，通過(guò)蛋白質(zhì)主鏈結(jié)構(gòu)重疊獲得C7的結(jié)構(gòu)模型（圖2-A）。CmAPN的模板選擇人類 APN Cd13（PDB：4FYQ）［23］，序列一致性為31%，CmAPN的三維結(jié)構(gòu)模型則如圖2-B所示。

通過(guò)Ramachandran 圖對(duì)C7和CmAPN結(jié)構(gòu)模型主鏈構(gòu)型的Φ-Ψ二面角的分布進(jìn)行檢查。結(jié)果C7的98.5% 殘基落在最佳區(qū)域（圖2-C）；CmAPN中97.3%殘基落在最佳區(qū)域（圖2-D），說(shuō)明模型結(jié)構(gòu)合理可信。

圖2 ScFv-C7和CmAPN三維結(jié)構(gòu)的同源建模Fig. 2 Three-dimensional structure models of scFv-C7 and CmAPN

2.2 ScFv-C7與CmAPN的分子對(duì)接及熱點(diǎn)預(yù)測(cè)

ScFv-C7和CmAPN對(duì)接后的空間結(jié)構(gòu)如圖3-A所示，使用KFC2熱點(diǎn)預(yù)測(cè)系統(tǒng)分析得到scFv-C7上 的 熱 點(diǎn) 有 ：Y54、A123、Y124、Y186、Y203、S204、S207。一般來(lái)說(shuō)，單鏈抗體氨基酸序列變化主要發(fā)生在VH和VL的CDR2、CDR3區(qū)，按照Kabat規(guī)則，上述預(yù)測(cè)的熱點(diǎn)殘基位于H-CDR3區(qū)（A123、Y124）和 L-CDR2 區(qū)（S204、S207）（圖 3-B），可以選擇這兩個(gè)區(qū)域進(jìn)行飽和突變。

圖3 scFv-C7和CmAPN的分子對(duì)接及互作熱點(diǎn)分析Fig. 3 Molecular docking and the interaction hot spot analysis between scFv-C7 and CmAPN

2.3 ScFv-C7飽和突變抗體庫(kù)的構(gòu)建

使用大引物PCR法對(duì)scFv-C7模板進(jìn)行突變，以LMB3和NNK_VH為引物擴(kuò)增引入H-CDR3區(qū)A123、Y124的飽和突變（圖4-A），并當(dāng)做下一輪PCR的上游引物（大引物1），加下游引物pHENseq擴(kuò)增即為帶有H-CDR3飽和突變位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物（圖4-B）。再以scFv-C7作為模板，NNK_VL和pHENseq為引物，引入VL區(qū)S204、S207的飽和突變（圖4-C），作為下一輪的PCR下游引物（大引物2），與上游引物L(fēng)MB3和模板（H-CDR3區(qū)突變位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物）進(jìn)行擴(kuò)增，本次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物即為引入H-CDR3和L-CDR2的飽和突變區(qū)域（圖4-D）。

圖4 基于scFv-C7對(duì)接界面熱點(diǎn)氨基酸的飽和突變Fig. 4 Saturation mutagenesis of hot spot amino acids on docking interface based on scFv-C7

將scFv-C7飽和突變的PCR產(chǎn)物純化后克隆至pIT2噬菌粒載體，隨后電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于TYE-AG平板，構(gòu)建定點(diǎn)飽和突變抗體庫(kù)，經(jīng)菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算庫(kù)容為2×103。

為了驗(yàn)證突變抗體庫(kù)所含基因是否正確，隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆并利用噬菌體載體pIT2自帶引物L(fēng)MB3和pHENseq進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個(gè)克隆在950 bp左右有目的條帶（圖5），符合噬菌粒基因大小，只有1個(gè)突變克隆PCR未成功。構(gòu)建的飽和突變抗體庫(kù)基因正確率90%，可見(jiàn)適合后續(xù)篩選工作。

圖5 構(gòu)建的飽和突變抗體庫(kù)正確性驗(yàn)證Fig.5 Verification of correction from constructed saturation mutant antibody library

2.4 ScFv-C7定點(diǎn)突變抗體庫(kù)的篩選

分析每輪篩選之后整體次級(jí)庫(kù)的親和力變化趨勢(shì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)出/投入隨著篩選輪數(shù)而增高，第3輪比第1輪的產(chǎn)出/投入提高了12倍（表2），可見(jiàn)篩選3輪后特異性突變株得到了有效富集。

表2 scFv-C7突變抗體庫(kù)的富集和篩選Table 2 Enrichment and screening of scFv-C7 mutant antibody library

2.5 單克隆ELISA篩選陽(yáng)性重組噬菌體

隨機(jī)挑取第3輪篩選的單菌落用于單克隆噬菌體ELISA鑒定，從OD450值大于C7的陽(yáng)性克隆中選取了3個(gè)最高的單克?。?A5、3G2和2F7（圖6），用于進(jìn)一步序列比對(duì)分析。

圖6 突變抗體的單克隆噬菌體ELISA分析Fig. 6 ELISA analysis of monoclonal phage for mutant antibodies

2.6 篩選獲得突變基因的序列分析

使用pIT2載體引物對(duì)3A5、3G2和2F7進(jìn)行PCR檢測(cè)，條帶在950 bp左右（圖7-A），匹配噬菌體完整外源基因大小，可用于進(jìn)一步的測(cè)序分析。

多重序列比對(duì)顯示3A5的H-CDR3區(qū)124位發(fā)生了突變，Tyr變成了Gly（Y124G）；而3G2則無(wú)變化，跟C7序列完全一致，2F7序列的H-CDR2區(qū)76位出現(xiàn)了終止子（圖7-B）。最終選擇3A5即Y124G作進(jìn)一步分析。

圖7 突變單鏈抗體的基因克?。ˋ）與氨基酸序列比對(duì)（B）Fig.7 Gene cloning（A）and amino acid sequence alignment（B）of mutant scFv antibodies

2.7 突變單鏈抗體與CmBBMV的結(jié)合能力

SPR檢測(cè)單鏈抗體與CmBBMV的結(jié)合過(guò)程，上 樣 緩 沖 液 選 擇 pH 4.0的 NaAc（10 mmol/L），CmBBMV偶聯(lián)到芯片上的量為1 267 RU，再生反應(yīng)選擇pH 2.5的Glycine-HCl（10 mmol/L）和5 mmol/L NaOH。

各待測(cè)樣品分別通過(guò)CM5芯片，它們同CmBBMV的結(jié)合是動(dòng)態(tài)過(guò)程，先結(jié)合再解離。ScFv-D5同 CmBBMV基 本 沒(méi) 有 結(jié) 合（3.57 RU），Cry1B的結(jié)合能力最強(qiáng)（197.39 RU），突變型Y124G的結(jié)合能力（155.49 RU）將野生型scFv-C7的結(jié)合能力（72.77 RU）提高了2.1倍（圖8）。

圖8 SPR分析突變單鏈抗體與CmBBMV的結(jié)合Fig. 8 SPR analysis of mutant scFv antibodies binding to CmBBMV

2.8 突變單鏈抗體對(duì)稻縱卷葉螟的生物活性

稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)經(jīng)過(guò)24 h處理，Y124G與scFv-C7殺蟲(chóng)效果無(wú)明顯差異，但是48 h后，特別是經(jīng)過(guò)72 h處理，Y124G將scFv-C7的死亡率從42.22%提高到56.67%，雖然突變型將殺蟲(chóng)活性提高，但是顯著低于陽(yáng)性對(duì)照Cry1B的76.67%（表3），還需進(jìn)一步改造以達(dá)到更佳效果。

表3 突變單鏈抗體對(duì)稻縱卷葉螟的生物測(cè)定Table 3 Bioassay of mutant scFv antibodies against C. medinalis larvae

3 討論

定點(diǎn)突變的改造方法與傳統(tǒng)抗體改造方法相比，避免了盲目性，成功率較高，而且以分子模擬為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變，在已知蛋白三維結(jié)構(gòu)及功能等方面信息的基礎(chǔ)上，預(yù)測(cè)分子間結(jié)合區(qū)域并確定關(guān)鍵氨基酸殘基，更加準(zhǔn)確的反應(yīng)了抗體蛋白作用界面的特征，大大提高了預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度［13，24-25］。本文利用分子對(duì)接、預(yù)測(cè)熱點(diǎn)的理論知識(shí)，構(gòu)建飽和突變抗體庫(kù)，經(jīng)過(guò)固相篩選，準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)了一株提高功能活性的突變株。

計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)所構(gòu)建的飽和突變抗體庫(kù)的庫(kù)容為2×103，庫(kù)容偏小。在設(shè)計(jì)飽和突變片段的時(shí)候，突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)成 NNK（N為A、G、C 或T，K為G或T），這使每個(gè)位點(diǎn)能囊括全部20種氨基酸，有效減少同義密碼子的數(shù)量，并能有效減少突變抗體庫(kù)的篩選數(shù)量［26-27］。此外，為了提高轉(zhuǎn)化效率，我們使用了電轉(zhuǎn)化來(lái)構(gòu)建抗體庫(kù)。庫(kù)容偏小可能的原因是在擴(kuò)增飽和突變基因過(guò)程中得到的PCR產(chǎn)物偏少或者濃度偏低（圖4-D），這需要優(yōu)化PCR程序或設(shè)計(jì)新的引物?；蛘呖稍诩扔型蛔凅w的基礎(chǔ)上進(jìn)行多輪突變，以積累有益突變，從而獲得親和力更高的突變體。

SPR技術(shù)是基于金屬薄膜的光學(xué)耦合作用原理建立的探測(cè)生物分子之間相互作用的新技術(shù)，可簡(jiǎn)單快捷地監(jiān)測(cè)生物分子之間的相互作用［28-30］。BIAcore SPR已在許多監(jiān)測(cè)種類中應(yīng)用，包括“抗原-抗體”和“受體-配體”互作這兩種最常見(jiàn)的類型。SPR分析發(fā)現(xiàn)Anti-Id scFv與CmBBMV的結(jié)合是“結(jié)合-平衡-解離”的動(dòng)態(tài)過(guò)程，不同于ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)只得到最終狀態(tài)的靜態(tài)結(jié)果。一般只有偶聯(lián)到CM5傳感芯片上蛋白是單一純化物質(zhì)才能計(jì)算動(dòng)力學(xué)常數(shù)［31-32］，由于昆蟲(chóng)中腸BBMV是多種受體蛋白混合而成，所以無(wú)法算出動(dòng)力學(xué)常數(shù)，但是可以計(jì)算出結(jié)合能力。SPR與ELISA結(jié)果相互印證，明確了突變株Y124G對(duì)CmBBMV的親和力比野生型scFv-C7提高（圖8）。

雖然突變型Y124G對(duì)稻縱卷葉螟的殺蟲(chóng)活性較野生型scFv-C7提高，但還是顯著低于Cry1B毒素（表3）。隨著蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的增加及優(yōu)化，三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)的擴(kuò)充，模型評(píng)價(jià)系統(tǒng)的優(yōu)化，分子對(duì)接技術(shù)的升級(jí)，從而可以獲得更準(zhǔn)確的對(duì)接模型［33］。進(jìn)而在模型結(jié)構(gòu)上可以精確分析接觸面殘基位點(diǎn)，確定突變氨基酸，為得到活性提高的抗體蛋白材料奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究采用計(jì)算機(jī)模擬方法構(gòu)建了scFv-C7和CmAPN的結(jié)構(gòu)模型，分子對(duì)接并預(yù)測(cè)對(duì)接復(fù)合物的關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域，分析位于scFv-C7上的熱點(diǎn)殘基并構(gòu)建定點(diǎn)飽和突變抗體庫(kù)，利用固相篩選方法包被CmBBMV，篩選出親和力和生物活性提高的突變單鏈抗體。對(duì)基因工程抗體分子對(duì)接熱點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，是一種快速抗體分子改造的有效方法，也為蛋白農(nóng)藥制備改造提供了一個(gè)新途徑。