李招發(fā) 邱丹丹

（1. 華僑大學(xué)醫(yī)學(xué)院，泉州 362021；2. 華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，泉州 362021）

魚精蛋白（protamine，Pro）是一種由30-50個氨基酸組成的多聚陽離子肽，以精氨酸為主，存在各類雄魚成熟精巢組織與帶負電的DNA緊密結(jié)合［1］。Pro抑菌作用具有廣譜性、高效性和安全性。Pro對黃色葡萄球菌、酵母菌、霉菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及四鏈球菌均表現(xiàn)為抑制效果，可作為綠色防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè)中［2-4］?，F(xiàn)在普遍認為魚精蛋白抑菌活性是由其分子中存在著大量精氨酸，精氨酸中的正電荷胍基與細胞壁肽聚糖的負電荷產(chǎn)生靜電作用，但它們均能與細胞膜特異性結(jié)合，通過破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致整個細胞不能正常運行［5］。在手術(shù)中，Pro作為肝素抗凝血劑用于因肝素注射過量而引起的出血；還可以延遲或阻止胰島素的釋放［6-7］。Pro與 DNA 有較強的結(jié)合能力，作為DNA藥物載體而被廣泛應(yīng)用［8-9］。

細胞珠蛋白（cytoglobin，CYGB）是 Kawada等［10］在大鼠肝星狀細胞中發(fā)現(xiàn)的一種六配位血紅素球蛋白，分子量為21.4 kD。研究表明CYGB具有過氧化物酶活性和清除氧自由基的功能，并能通過調(diào)控CYGB基因的表達抑制肝纖維化［11］。本課題研究表明，CYGB在原核表達系統(tǒng)中表達量極大，可借助CYGB蛋白來實現(xiàn)目的蛋白的高效表達［12］。魚精蛋白的主要來源是天然提取，產(chǎn)量受限，且魚精蛋白富含精氨酸，這樣編碼的氨基酸序列在大腸桿菌中是難以表達的［13］，嚴重制約了其應(yīng)用。本研究旨在通過基因工程技術(shù)，通過CYGB融合表達，探索大量制備重組魚精蛋白的可行性。因后續(xù)純化過程中需用CNBr切割CYGB-Pro中的甲硫氨酸位點，以裂解出重組 Pro（recombinant protamine，rPro）。將CYGB內(nèi)部的甲硫氨酸對應(yīng)的密碼子ATG全部突變?yōu)楫惲涟彼釋?yīng)的密碼子ATC（起始密碼子除外）獲得CYGBm。采用CYGB與Pro融合，并在原核表達系統(tǒng)表達。為重組抗菌肽的研究和開發(fā)提供了依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21（DE3）、pET22b、pET22b-CYGB均為本實驗室保藏。pUC57-Pro為上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 試劑與材料 硫酸魚精蛋白（Sigma公司）；NdeⅠ限制性內(nèi)切酶、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、BglⅡ限制性內(nèi)切酶、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、Pyrobest DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker（大連寶生物工程有限公司）；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒（碧云天生物公司）；引物合成（表1）、DNA 測序（上海生工生物工程有限公司完成）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 本研究涉及的寡核苷酸序列Table 1 Oligonucleotide sequences involved in this study

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pET22b-CYGBm 的構(gòu)建與表達驗證實驗 以實驗室保存的pET22b-CYGB質(zhì)粒為模板，以SEQ ID NO.1為上游引物，以SEQ ID NO.6為下游引物，PCR得片段1-6，以SEQ ID NO.7為上游引物，以SEQ ID NO.8為下游引物，PCR得片段7-8，核酸電泳后，回收片段1-6和7-8。以回收片段1-6和7-8為模板，以SEQ ID NO.1為上游引物，以SEQ ID NO.8為下游，PCR得片段（1-8）67，核酸電泳后，回收片段（1-8）67。以回收片段（1-8）67模板，以SEQ ID NO.1為上游引物，以SEQ ID NO.4為下游引物，PCR得片段1-4，以SEQ ID NO.5為上游引物，以SEQ ID NO.8為下游引物，PCR得片段5-8，核酸電泳后，回收片段1-4和5-8。以回收得到的片段1-4和5-8為模板，以SEQ ID NO.1為上游引物，以SEQ ID NO.8為下游引物，PCR得片段（1-8）45，核酸電泳后，回收片段（1-8）45。以回收片段（1-8）45模板，以SEQ ID NO.1為上游引物，以SEQ ID NO.2為下游引物，PCR得片段1-2，以SEQ ID NO.3為上游引物，以SEQ ID NO.8為下游引物，PCR得片段3-8，核酸電泳后，回收片段1-2和3-8。以回收片段1-2和3-8為模板，以SEQ ID NO.1為上游引物，以SEQ ID NO.8為下游引物，PCR得片段（1-8）23，即CYGBm。CYGBm和pET22b用NdeI/EcoRI雙酶切，核酸電泳后，回收目的片段，T4 DNA Ligase連接，構(gòu)建pET22b-CYGBm（圖1）。將質(zhì)粒pET22b-CYGBm與BL21感受態(tài)混合，42℃熱激轉(zhuǎn)化，37℃ 100 μL/mL（Amp+）LB 平板（10 g/L tryptone，5 g/L yeast extarct，10 g/L NaCl） 培 養(yǎng)20 h，挑選單克隆菌落（上海生工生物工程有限公司DNA 測序結(jié)果正確），接入乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基（15 g/L tryptone，12 g/L yeast extarct，3 g/L NaH2PO4·2H2O，7 g/L K2HPO4·3H2O，2.5 g/L NaCl，0.2%葡萄糖，2.1 mmol/L乳糖，0.05% MgSO4·7H2O）中，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)30 h，收集菌體，SDS-PAGE電泳檢測CYGBm在原核表達系統(tǒng)情況。

圖1 重疊延伸PCR定點突變CYGB流程圖Fig. 1 Flow chart of fixed point mutations CYGB by overlapping extended PCR

1.2.2 工程菌BL21-pET22b-CYGBm-Pro的構(gòu)建與表達實驗 pUC57-Pro質(zhì)粒（上海生工生物工程有限公司合成）和pET22b-CYGBm質(zhì)粒經(jīng)NdeI/EcoRI雙酶切，核酸電泳后，回收目的片段，通過T4 DNA Ligase將pET22-CYGBm與Pro連接，構(gòu)建pET22-CYGBm-Pro。將pET22b-CYGBm-Pro與BL21感受態(tài)混合，42℃熱激轉(zhuǎn)化，37℃ 100 μL/mL（Amp+）LB平板培養(yǎng)20 h，挑選單克隆菌落經(jīng)PCR法和雙酶切法驗證，陽性克隆子命名為工程菌BL21-pET22b-CYGBm-Pro。工程菌BL21-pET22b-CYGBm-Pro接入乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)30 h，乳糖誘導(dǎo)菌液于4℃，10 000 r/min離心20 min，收集菌體存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 rPro 的純化實驗 將上述收集的菌體稱重，經(jīng)-80℃和4℃反復(fù)凍融3、4次，以1∶10的比例加入包涵體破菌液（1.22 g Tris-HCl、5.85 g NaCl、0.075 g EDTA、3.3 mL 30%曲拉通 X100，加入 150 mL 超純水溶解，調(diào) pH 至 8.0，定容至 200 mL），冰中懸浮菌體，冰浴超聲，功率200 W，5 s超聲，5 s間歇，4℃，10 000 r/min離心20 min，棄上清，收集包涵體沉淀。按3倍體積量加入包涵體洗滌液（3.1 g Tris-HCl、14.63 g NaCl、0.186 g EDTA、8.3 mL 30%曲拉通 X100、60.2 g 尿素，加入 400 mL 超純水溶解，調(diào) pH 至 8.0，定容至 500 mL），重懸沉淀，冰中搖動洗滌10 min，4℃，10 000 r/min，離心20 min。如此重復(fù)3、4次。加入適當(dāng)包涵體溶解液（3.1 g Tris-HCl、14.63 g NaCl、0.186 g EDTA、242.5 g 尿素，加入 400 mL 超純水溶解，調(diào) pH 至 8.0，定容至 500 mL），重懸沉淀，冰浴平緩搖動1 h后4℃冰箱放置過夜以充分溶解，10 000 r/min，離心20 min，收集上清。上清液經(jīng)20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液平衡的Sephadex G-25凝膠過濾，CYGBm-Pro復(fù)性，并初步除去小分子雜質(zhì)。Sephadex G-25凝膠過濾接收液再經(jīng)肝素瓊脂糖凝膠層析柱純化、CM陽離子瓊脂糖凝膠層析柱分離純化，獲得重組CYGBm-Pro融合蛋白。純化后的重組融合蛋白CYGBm-Pro經(jīng)0.2 mmol/L濃鹽酸和50 mg/mL CNBr避光室溫裂解24 h，經(jīng)20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液平衡的Sephadex G-25凝膠過濾，即得純化的rPro。

1.2.4 rPro的抑菌活性分析實驗 利用試管培養(yǎng)法分析rPro對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及巴斯德畢赤酵母GS115 的抑菌活性。取活化菌液10 μL接種于5 mL 培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h 后，用紫外分光光度計測定OD600值，分析測試菌加rPro（168.96 μg/mL、84.48 μg/mL、42.24 μg/mL、21.12 μg/mL）和陰性對照（去離子水）的生長曲線，計算抑制率（inhibition rate）＝（陰性對照OD600-加rPro OD600）/陰性對照OD600，從而檢測分析抑菌活性。

1.2.5 rPro在魚蝦儲存中的應(yīng)用實驗 稱取經(jīng)21.12 μg/mL rPro浸潤處理、未處理的蝦尾5 g，用干凈剪刀將其剪爛細碎，放入放入盛有50 mL三角瓶，加入50 mL去離子水，攪勻不時振蕩，浸漬30 min后過濾，留取濾液冰箱4℃儲存?zhèn)溆?，儲存時間不宜過久。將盛有10 mL 2%硼酸溶液的燒杯中加入5滴指示液置于冷凝管下端，并將冷凝管下端插入到燒杯吸收液液面以下。吸取樣品濾液于蒸餾瓶內(nèi)，加入5 mL 1%氧化鎂，迅速加上塞子，密閉封緊，并在冷靜管外端包上棉花，加熱蒸餾30 min停止蒸餾，吸收液用0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，待終點為藍紫色停止滴定。記錄好鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用量。同時做無rPro的空白對照實驗和以Sigma公司購買的天然提取的硫酸魚精蛋白（Pro）陽性對照實驗。根據(jù)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量計算的揮發(fā)性鹽基氮的含量（TVB-N）。稱取經(jīng)21.12 μg/mL rPro浸潤處理、未處理的蝦尾5 g，將其剪碎放入研缽，將樣品研成肉泥，加入50 mL蒸餾水，充分攪拌后過濾取濾液。同時做無rPro的空白對照實驗和以Sigma公司購買的天然提取的硫酸魚精蛋白（Pro）陽性對照實驗。測量其pH。

2 結(jié)果

2.1 pET22b-CYGBm的構(gòu)建與CYGBm的表達

如圖1所示，經(jīng)過3次重疊延伸PCR定點突變，將CYGB基因內(nèi)部的甲硫氨酸對應(yīng)的密碼子ATG全部突變?yōu)楫惲涟彼釋?yīng)的密碼子ATC（起始密碼子除外）獲得CYGBm。將質(zhì)粒pET22b-CYGBm轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，挑選單克隆菌落乳糖誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE 檢測。結(jié)果表明，突變后的CYGBm其表達量與CYGB一樣仍可在原核表達系統(tǒng)中高表達（圖 2）。

2.2 pET22b-CYGBm-Pro的構(gòu)建、表達與rPro純化

CYGBm基 因 為 570 bp，Pro基 因 為 99 bp，CYGBm-Pro基因理論長度約為669 bp。如圖3結(jié)果所示，陽性單克隆菌落PCR產(chǎn)物核酸電泳條帶和pET22b-CYGBm-Pro質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物核酸電泳條帶與法與其基因理論長度相吻合。將質(zhì)粒pET22b-CYGBm-Pro轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，挑選單克隆菌落乳糖誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE 檢測。結(jié)果表明，乳糖誘導(dǎo)后在全菌和菌體裂解液離心沉淀中，在26 kD左右有明顯的條帶，說明CYGBm-Pro融合蛋白在原核表達系統(tǒng)以包涵體形式高表達（圖4）。經(jīng)BandScan軟件對圖4蛋白電泳泳道2進行灰度分析融合蛋白CYGBm-Pro表達率超過10%。CYGBm-Pro包涵體經(jīng)離心、洗滌、變性、Sephadex G-25凝膠復(fù)性、肝素瓊脂糖凝膠層析柱純化、CM陽離子瓊脂糖凝膠層析柱分離純化（圖4，5：純化的CYGBPro）。融合蛋白CYGBm-Pro純化收率為25%。純化的CYGB-Pro CNBr裂解（裂解率為75%）、Sephadex G-25凝膠過濾，即得純化的rPro（圖4，6：純化的rPro）。目的蛋白rPro總收率為17.5%，總收率偏低，主要原因在于融合蛋白CYGBm-Pro是以包涵體形式表達，包涵體的復(fù)性一般都很低。

圖3 重組質(zhì)粒pET22b-CYGBm-Pro PCR法和雙酶切法核酸電泳圖Fig. 3 Nucleic acid electrophoresis of recombinant plasmid pET22 B-CYGBm-Pro by PCR and double enzyme digestions

圖4 CYGBm-Pro表達以及純化的CYGBm-Pro和rPro的SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE of CYGBm-Pro expression and purified CYGBm-Pro and rPro

2.3 rPro對細菌生長抑制作用

如圖5所示，rPro對普通的大腸桿菌、耐藥的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、真核生物畢赤酵母GS115均有明顯的抑菌活性，且純化的rPro濃度越高，抑菌活性越強，從而證明了通過基因工程技術(shù)獲得的rPro具有抑菌活性。

圖5 不同濃度rPro對不同細菌生長抑制率曲線圖Fig. 5 Curves of growth inhibition rates of different bacteria with different concentrations of rPro

2.4 rPro對鮮蝦的保鮮應(yīng)用效果

鮮蝦儲存過程中會發(fā)現(xiàn)腐變，腐變程度可通過pH、TVB-N監(jiān)測，一般鮮蝦pH＞7、TVB-N＞20 mg/100，不可食用。每24 h測經(jīng)rPro處理、天然Pro處理和未處理的pH、TVB-N。結(jié)果表明：rPro處理樣品比未經(jīng)處理樣品在4℃儲存時間更長，其效果與天然Pro處理樣品幾乎相當(dāng)，具有一定的保鮮效果（圖6）。

圖6 rPro處理蝦儲存期間pH值（A）和TVB-N值（B）變化曲線圖Fig. 6 Curves of pH values（A）and TVB-N values（B）of shrimp treated by rPro during storage

3 討論

目前國內(nèi)外主要通過天然提取制備魚精蛋白［14-15］。雖然魚精蛋白已從多種魚類及其它水生動物中提取得到，但產(chǎn)量十分有限。精蛋白富含精氨酸，而且大多是由AGA或AGG這兩個大腸桿菌稀有密碼子編碼的；另外，精蛋白具有較為廣譜的抗菌能力，在菌體外加入精蛋白，會導(dǎo)致細菌細胞壁裂解，使細菌死亡。因此，精蛋白在大腸桿菌中是難以直接表達的［3，13］。目前精蛋白在大腸桿菌中主要是以融合蛋白形式表達。王靜等［16］利用牛β-防御素LAP 和牛CATHL2 抗菌肽融合成功的高表達抗菌肽，張雅麗等［13］在大腸桿菌中融合表達牛精蛋白，王昊等［17］在大腸桿菌中融合表達抗惡性黑素瘤單鏈抗體-魚精蛋白，孟艷玲等［18］在大腸桿菌中融合表達人抗HBsAg單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋自。本研究采用基因工程方法制備魚精蛋白，選取鮭魚魚精蛋白，依據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化并合成了Pro基因序列。不同物種的基因在密碼子使用上存在著明顯的偏愛性，密碼子偏愛性對重組蛋白質(zhì)的異源表達具有重要影響。從生物學(xué)基礎(chǔ)來看，不同的密碼子使用密碼子模式不同的形成可能與基因的GC含量有關(guān)。在生物中高表達的基因密碼子的使用偏性一般比較大。這些偏好可能與兩個原因有關(guān)：一是避免使用類似終止密碼子的密碼子；二是這些偏好能夠有效地翻譯密碼子，因為這些密碼子對應(yīng)于生物體中非常豐富的tRNA［19-20］。采用PCR定點突變的技術(shù)，將CYGB中甲硫氨酸位點ATG（除起始密碼子）全部突變?yōu)锳TC，成功獲得CYGBm。CYGBm 融合成功的高表達了CYGBm-Pro。研究發(fā)現(xiàn)CYGBm-Pro融合蛋白以包涵體形式大量表達。經(jīng)Sephadex G-25凝膠復(fù)性、肝素親和層析和陽離子交換層析，獲得了純度較高的CYGBm-Pro。CYGBm-Pro經(jīng)CNBr 裂解及進一步純化后得純化的rPro。通過試管培養(yǎng)法對所得rPro蛋白抗菌活性進行分析，發(fā)現(xiàn)對所選的革蘭氏陰性菌大腸桿菌、革蘭氏陽性枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌以及真核生物巴斯德畢赤酵母 GS115 均有顯著的抗菌活性，對鮮蝦有明顯的保鮮作用。

4 結(jié)論

本研究利用無甲硫氨酸位點（除起始密碼子）的 CYGBm與魚精蛋白融合成功的制備了有明顯抗菌活性的重組魚精蛋白。不僅有較高的表達量，更有利于CYGBm-Pro的CNBr裂解，提高rPro總的收率，為工業(yè)化生產(chǎn)重組魚精蛋白提供了一條新思路。