胡曉 王寶寶 竇少華 姜南 付常振 金行 高鳳山

（大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116622）

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）是染色體上由高度多態(tài)、緊密連鎖的基因座組成的一個(gè)遺傳區(qū)域，編碼一系列與免疫應(yīng)答相關(guān)的分子。豬的MHC也叫豬白細(xì)胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA）。SLA由 3個(gè) 基因簇組成，分別是SLA I、II、III。其中SLA I類分子主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。該分子包括重鏈和輕鏈［1］，輕鏈只有一個(gè)等位基因β2微球蛋白（β2 microglobulin，β2m）；重鏈具有多態(tài)性，包括胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)、胞外區(qū)和信號肽4個(gè)區(qū)域，含有SLA-1、SLA-2和SLA-3三個(gè)功能基因［2-3］。其中，SLA-2比SLA-1和SLA-3在信號肽的起始端多3個(gè)氨基酸。重鏈與輕鏈以非共價(jià)鍵結(jié)合構(gòu)成SLA I類分子，不僅識別內(nèi)源性抗原肽［4］，也可以通過交叉遞呈途徑識別外源性抗原肽［5］。被識別的多肽與SLA I類分子形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物（peptide-MHC complex，pMHC）并被遞呈到細(xì)胞表面，pMHC進(jìn)一步與CD8+T淋巴細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）結(jié)合，激活CD8+T淋巴細(xì)胞，使活化的CD8+T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為有細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），發(fā)揮毒性作用并對靶細(xì)胞造成殺傷，啟動(dòng)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答［6］。不同的SLA I類分子遞呈的抗原肽不同，根據(jù)抗原遞呈機(jī)理，可建立不同SLA I類分子表位遞呈規(guī)律的研究平臺。

煙臺黑豬是我國優(yōu)良的地方豬種之一，基因資源十分寶貴［7-8］。本課題組已經(jīng)克隆了煙臺黑豬SLA-2基因，并構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體，進(jìn)行了原核表達(dá)研究［9］。然而，煙臺黑豬SLA-2基因的真核表達(dá)研究尚未開展，其表位遞呈規(guī)律研究平臺也尚未建立。本研究擬以煙臺黑豬SLA-2-YT/pMD 18-T全基因?yàn)椴牧?，?gòu)建SLA-2-YT編碼區(qū)基因的真核表達(dá)載體，并使其在sT2細(xì)胞系中優(yōu)勢表達(dá)，為探究煙臺黑豬SLA-2-YT基因的抗原表位遞呈規(guī)律等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和細(xì)胞 煙臺黑豬SLA-2-YT/pMD18-T菌種、psPAX2菌種、pMD2.G菌種由本實(shí)驗(yàn)室保存；pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro（簡稱pCDH）真核表達(dá)載體菌種購自中國上海思享生物科技有限公司；pMD 19-T Simple Vector和Escherichia coli.Top10菌種購自寶生物工程（大連）有限公司；Stbl 3感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物科技有限公司；人胚胎腎上皮細(xì)胞（HEK-293T）由大連醫(yī)科大學(xué)李文哲教授課題組惠贈；豬腎上皮細(xì)胞（PK15）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心并由本實(shí)驗(yàn)室保存；sT2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中利用CRISPR/Cas9技術(shù)將PK15細(xì)胞的Tap轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（TAP1、TAP2）敲除后獲得并保存。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒及配制LB培養(yǎng)基的試劑均購自上海生工生物工程有限公司；高保真DNA聚合酶、核酸染料、Lipoectine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自諾唯贊有限公司 ；T4 DNA Ligase、DL 2000 DNA Marker、dNTP、限制性內(nèi)切酶（EcoR I、Hind III、Xba I、Not I）購自寶生物工程（大連）有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清購自BI公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和Opti-MEM培養(yǎng)基購自 Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自寶生物（大連）有限公司；Western Blotting使用的0.45 μmPVDF膜購自Millipore公司；小鼠SLA-1-HB01單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室自制；GAPDH Mouse Monoclonal antibody（ 貨 號 ：60004-1-Ig） 購自Proteintech公司；Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（貨號：D110087）購自上海生工生物工程有限公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自新賽美生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 梯度PCR儀購自基因有限公司；各型電泳儀和紫外分析儀購自北京市六一儀器廠；二級生物安全柜和二氧化碳培養(yǎng)箱購自ESCO公司；超靈敏多功能凝膠成像儀購自通用電氣公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中煙臺黑豬SLA-2-YT編碼區(qū)（coding sequence，CDS）基因序列（GenBank序列號：AB672508.1），遵守引物設(shè)計(jì)原則，使用Vector NTI 11.5和Oligo 7軟件，設(shè)計(jì)1對擴(kuò)增煙臺黑豬SLA-2基因編碼區(qū)序列的特異性正、反向寡核苷酸引物（上下游引物），根據(jù)pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體的序列和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇的限制性內(nèi)切酶為：Xba I和 Not I，在上下游引物的5′端分別添加酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，引物信息見表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PCR引物信息Table 1 Information of the primers used in PCR

1.2.2 目的基因PCR擴(kuò)增與DNA片段回收 以SLA-2-YT/pMD18-T質(zhì)粒為模板，以pSLA-2-YTF/pSLA-2-YT-R 作 引 物， 用 Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶系統(tǒng)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增SLA-2-YT編碼區(qū)基因序列，PCR反應(yīng)體系為：5×SF buffer（with 10 mmol/L MgSO4），5 μL ；dNTP Mix（10 mmol/L each），1 μL；SLA-2-YT/pMD 18-T 全 基 因質(zhì)粒（提取后稀釋30倍），4 μL；SLA-2-YT-F（25 μmol/L），1 μL ；SLA-2-YT-R（25 μmol/L），1 μL ；Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase（1 U/μL），0.5 μL；超純水補(bǔ)足至25 μL；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀成像。確認(rèn)目的條帶大小正確后，用DNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。由于用DNA聚合酶Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增的目的片段末端平滑化不易與pMD 19-T Simple Vector連接，因此需要在回收后的PCR產(chǎn)物DNA雙鏈的3′端分別添加Poly A尾（堿基“A”），使其轉(zhuǎn)變?yōu)轲ば阅┒?，反?yīng)液體系如下：10×Ex Taq buffer，5 μL ；dATP（10 mmol/L），1 μL ；PCR 回 收產(chǎn)物，35 μL ；Ex Taq 酶（5 U/μL），1 μL，超純水補(bǔ)足至50 μL；條件為：72℃水浴15 min。添加Poly A尾后的PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)成像，目的條帶用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收并保存回收產(chǎn)物。

1.2.3 SLA-2-YT編碼區(qū)基因TA克隆載體的構(gòu)建 將回收的目的條帶與pMD19-T Simple Vector連接，反應(yīng)體系為：pMD 19-T Simple Vector，0.5 μL；加Poly A尾回收產(chǎn)物，9.5 μL；Solution I，10 μL；條件為：16℃低溫水浴2 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Escherichia coli. Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取生長良好的重組單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒提取，將提取的重組質(zhì)粒用Not I/Xba I進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，選擇初步鑒定正確的陽性克隆菌送至上海生工生物工程有限公司測序。通過雙向DNA測序確認(rèn)插入序列的完整性后，將測序正確的陽性克隆菌株命名為 SLA-2-YT/pMD 19-T Simple，并保存菌種供后期實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.4 SLA-2-YT編碼區(qū)基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 從超低溫冰箱取出SLA-2-YT/pMD 19-T Simple和pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro菌種，經(jīng)平板劃線、挑取單菌落培養(yǎng)過后，用DNA質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測。對SLA-2-YT/pMD 19-T Simple質(zhì)粒進(jìn)行Not I/Xba I雙酶切處理，回收目的條帶；對真核表達(dá)載體pCDH-CMV-MCSEF1-Puro質(zhì)粒（環(huán)狀）同樣進(jìn)行Not I/Xba I雙酶切處理，使載體線性化，并回收載體條帶。將目的條帶與載體條帶用T4 DNA連接酶連接，反應(yīng)體系為：目的條帶 15 μL（μg）；載體條帶 0.5 μL（μg）；超純水1.5 μL；條件為：45℃水浴5 min，立即冰浴2 min，然后向反應(yīng)液中加入10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL ；T4 DNA Ligase 1 μL ；混勻后在 16℃低溫水浴鍋中過夜放置。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Stbl 3感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有氨芐青霉素（AMP+）的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)；然后挑取單菌落至AMP+LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h；培養(yǎng)的菌液提取質(zhì)粒后利用雙酶切鑒定真核重組DNA載體中是否攜帶插入片段；將初步鑒定正確的陽性克隆菌送至上海生工生物工程有限公司測序，使用Vector NTI 11.5對DNA測序結(jié)果進(jìn)行序列分析驗(yàn)證插入核苷酸序列的正確性。將測序正確的陽性重組菌株命名為SLA-2-YT/pCDH，重組質(zhì)粒SLA-2-YT/pCDH圖譜見圖1。

圖1 SLA-2-YT/pCDH 重組表達(dá)質(zhì)粒示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the recombinant expression plasmid SLA-2-YT/pCDH

1.2.5 嘌呤霉素終濃度測定 復(fù)蘇的sT2細(xì)胞傳代兩次待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，以每孔4×105個(gè)細(xì)胞鋪24孔板，共鋪33個(gè)孔，37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)到70%-80%時(shí)，每孔添加終濃度為0、5、10、15、30、60、90、200、300、500、1 000 μg/mL的嘌呤霉素，并將培養(yǎng)基補(bǔ)足至2 mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每2 d使用含有對應(yīng)濃度的嘌呤霉素的培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行換液，7 d后可以殺死所有細(xì)胞的最低濃度即為篩選轉(zhuǎn)染外源基因的sT2細(xì)胞的最佳嘌呤霉素終濃度。

1.2.6 慢病毒包裝 將凍存的HEK-293T細(xì)胞復(fù)蘇，傳代兩次待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行慢病毒包裝前的細(xì)胞鋪板，每個(gè)60 mm培養(yǎng)皿接種1.5×106個(gè)細(xì)胞，待培養(yǎng)皿中的HEK-293T細(xì)胞融合率達(dá)到80%-90%后，按照Lipoectine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書將pCDH-CMV-MCS-EF1-Pruo質(zhì)粒和SLA-2-YT/pCDH重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中，置37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，去除培養(yǎng)皿中含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，更換為4 mL新鮮的DMEM培養(yǎng)基，分別于更換培養(yǎng)基后48 h、72 h收集培養(yǎng)皿中的上清液，經(jīng)3 000 r/min離心10 min、0.22 μm PVDF膜濾器過濾，根據(jù)文獻(xiàn)測定并計(jì)算病毒滴度［10］，將剩余的病毒液凍存于超低溫冰箱中，備用。

1.2.7 慢病毒感染sT2細(xì)胞及抗性篩選 根據(jù)文獻(xiàn)及最佳感染復(fù)數(shù)（multiple of infection，MOI）值計(jì)算公式：MOI值=病毒滴度（TU/mL）×病毒體積（mL）/細(xì)胞個(gè)數(shù)，設(shè)定MOI值梯度為2.5、5、10、20、40、60，分別進(jìn)行病毒感染預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定感染sT2細(xì)胞的最佳MOI值范圍［11］。將凍存的sT2細(xì)胞復(fù)蘇，傳代2次后進(jìn)行慢病毒感染前的細(xì)胞鋪板，狀態(tài)良好的細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h至細(xì)胞完全貼壁，從超低溫冰箱取出1.2.6中收集的病毒液于4℃解凍備用，參考最佳MOI值，將1.5 mL病毒液與0.5 mL DMEM培養(yǎng)基混勻后加入需感染的孔板中，同時(shí)在其中一個(gè)孔板中只加入2 mL DMEM培養(yǎng)基，作為對照組，37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；病毒感染24 h后去除含病毒的培養(yǎng)基，更換為新鮮的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；換液6-8 h后，加入終濃度為30 μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，待6孔板中細(xì)胞長滿后傳代至100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞長滿，一部分細(xì)胞進(jìn)行Western Blotting驗(yàn)證，另一部分細(xì)胞添加嘌呤霉素繼續(xù)篩選，直到獲得成功轉(zhuǎn)染外源基因的單克隆細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)并命名為pCDH/sT2、SLA-2-YT-pCDH/sT2，將部分細(xì)胞凍存于液氮罐中，備用。

1.2.8 Western Blotting檢測外源基因的表達(dá) 復(fù)蘇PK15、sT2兩個(gè)細(xì)胞株，傳代兩次待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，使用RIPA細(xì)胞裂解液分別提取PK15、sT2和1.2.7中篩選得到的pCDH/sT2、SLA-2-YT-pCDH/sT2細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，然后將蛋白原液、超純水和5×蛋白上樣緩沖液按比例混勻后煮沸5-10 min，制成終濃度為30 μg/μL的蛋白溶液樣品，分別取10 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后參考預(yù)染Marker進(jìn)行切膠并將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，使用1×麗春紅染液染色，確認(rèn)轉(zhuǎn)膜成功后參考預(yù)染Marker切割目的條帶和內(nèi)參GAPDH條帶，用5%BSA溶液在室溫下封閉1 h，除去封閉液后，含目的條帶的膜中加入稀釋的小鼠抗SLA-1-HB01單克隆抗體（視抗體推薦倍數(shù)稀釋），含GAPDH條帶的膜加入稀釋的小鼠抗GAPDH 單克隆抗體，室溫孵育1 h，再4℃孵育過夜，去除抗體溶液，用1×TBST溶液洗膜4次，每次5 min，徹底洗去未與蛋白結(jié)合的一抗，分別加入稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h，然后用1×TBST洗膜4次，每次5 min，最后采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，通過GE AI600多功能超靈敏成像儀進(jìn)行顯影成像，以檢測sT2細(xì)胞中SLA-2-YT的表達(dá)量。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Image J 軟件分析Western Blotting雜交條帶的累積光密度值（IOD），計(jì)算目的蛋白的相對光密度值（目的條帶的IOD值與內(nèi)參GAPDH的IOD值之比），然后采用GraphPad Prism 8.0.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 煙臺黑豬SLA-2-YT CDS區(qū)基因PCR擴(kuò)增及加尾

對煙臺黑豬SLA-2-YT基因編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增的目的基因條帶大小約為1 100 bp（圖2-A），與理論設(shè)計(jì)值1 104 bp相符，表明目的基因被成功擴(kuò)增。PCR回收產(chǎn)物加Poly A尾并回收，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示在同樣條件下加尾回收產(chǎn)物略大于PCR回收產(chǎn)物（圖2-B），初步判斷加Poly A尾成功，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 煙臺黑豬SLA-2-YT基因CDS區(qū)PCR擴(kuò)增與加尾Fig. 2 PCR amplification and tailing of SLA-2-YT gene CDS region in Yantai black pig

2.2 SLA-2-YT/pMD 19-T Simple克隆表達(dá)載體鑒定

2.2.1 重組質(zhì)粒SLA-2-YT/pMD 19-T Simple限制性雙酶切鑒定 利用Xba I、Not I限制性內(nèi)切酶對SLA-2-YT/pMD 19-T Simple質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)結(jié)果（圖3）可以看出：每個(gè)樣品的泳道上均有兩個(gè)條帶，靠近點(diǎn)樣孔端的條帶為載體帶，大小約為2 692 bp，離點(diǎn)樣孔較遠(yuǎn)的條帶為目的條帶，大小約為1 100 bp，1-7號樣品的載體條帶大小正確，即1-7號樣品可能為成功構(gòu)建的克隆質(zhì)粒，將對應(yīng)的3個(gè)菌株送去生物公司測序，測序結(jié)果經(jīng)分析后顯示1、2號菌株的序列正確，即1、2號為成功構(gòu)建的重組克隆菌株。

2.2.2 序列分析 SLA-2-YT/pMD 19-T Simple經(jīng)核酸序列測序后，進(jìn)一步用Vector NTI 11.5進(jìn)行序列比對，結(jié)果（圖4）顯示SLA-2-YT/pMD 19-T Simple重組克隆載體中插入的SLA-2-YT編碼區(qū)基因序列與原序列100%同源，未出現(xiàn)核苷酸突變。

圖4 Vector NTI 11.5分析SLA-2-YT/pMD 19-T Simple重組克隆載體中插入序列Fig. 4 Insertion sequences in SLA-2-YT/pMD 19-T Simple recombinant vector analyzed by Vector NTI 11.5

2.3 SLA-2-YT/pCDH真核表達(dá)載體鑒定

2.3.1 重組質(zhì)粒SLA-2-YT/pCDH限制性雙酶切鑒定 真核表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro質(zhì)粒首先經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xba I、Not I雙酶切后進(jìn)行膠回收，0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖5）顯示回收的條帶大小約為7 300 bp，與理論值7 384 bp相符，表明載體回收成功。SLA-2-YT/pMD 19-T Simple質(zhì)粒經(jīng)雙酶切并回收目的基因后，與真核表達(dá)載體在T4 DNA Ligase的作用下連接，導(dǎo)入Stbl 3感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，再次進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖6）顯示：每個(gè)樣品的泳道上均有兩個(gè)條帶，靠近點(diǎn)樣孔端的條帶為載體帶，大小約為7 384 bp，離點(diǎn)樣孔較遠(yuǎn)的條帶為目的條帶，大小約為1 100 bp，1-3號樣品的載體條帶和目的條帶的大小正確。

圖5 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro 載體回收Fig. 5 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro vector recovery

圖6 重組質(zhì)粒SLA-2-YT/pCDH雙酶切鑒定Fig. 6 Identification of recombinant plasmid SLA-2-YT/pCDH by double digestion

2.3.2 序列分析 為進(jìn)一步確定目的基因與真核表達(dá)載體連接成功與否，將圖6對應(yīng)的3個(gè)菌株送去生物公司測序，測序結(jié)果經(jīng)初步分析后顯示2、3號菌株的序列正確，表明基因插入成功，即2、3號為成功構(gòu)建的重組真核表達(dá)菌株。進(jìn)一步經(jīng)Vector NTI 11.5進(jìn)行序列比對，證實(shí)SLA-2-YT/pCDH重組真核表達(dá)載體中插入的SLA-2-YT編碼區(qū)基因序列與原序列的同源性仍為100%，沒有出現(xiàn)核苷酸突變，能夠正確編碼對應(yīng)的蛋白。

2.4 嘌呤霉素最佳濃度篩選

通過不同濃度的嘌呤霉素作用于未轉(zhuǎn)染的sT2細(xì)胞，168 h后對存活細(xì)胞使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。結(jié)果（圖7）顯示：不加嘌呤霉素的孔板內(nèi)的細(xì)胞正常增殖，由于孔板底面積有限，細(xì)胞增殖數(shù)目受到限制；而添加了嘌呤霉素的孔板中的細(xì)胞增殖在不同程度上被抑制。由于嘌呤霉素的濃度不斷增大，各孔板中的細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的死亡現(xiàn)象：當(dāng)嘌呤霉素的濃度達(dá)到500 μg/mL對應(yīng)孔板中細(xì)胞無存活，根據(jù)慣例，選擇最低致死濃度的前一個(gè)濃度300 μg/mL進(jìn)行篩選。因此，選擇300 μg/mL作為嘌呤霉素最佳篩選濃度。

圖7 嘌呤霉素作用于sT2細(xì)胞的致死濃度曲線Fig. 7 Lethal concentration curve of puromycin on sT2 cells

2.5 HEK-293T細(xì)胞慢病毒包裝及感染sT2細(xì)胞

將攜帶SLA-2-YT的質(zhì)粒和兩種包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞后，成功包裝出慢病毒質(zhì)粒。通過不同濃度的病毒液感染HEK-293T細(xì)胞，測得病毒滴度約為1×105TU/mL，通過設(shè)定MOI值梯度，用1.2.6中獲得的慢病毒進(jìn)行感染，通過顯微鏡每天多次觀察細(xì)胞狀態(tài)，確定慢病毒的最佳感染sT2細(xì)胞復(fù)數(shù)為20。另外，本研究涉及的豬腎上皮細(xì)胞（PK15細(xì)胞）、用于慢病毒感染的sT2細(xì)胞（TAP基因敲除的PK15細(xì)胞），導(dǎo)入空載體pCDHCMV-MCS-EF1-Puro質(zhì)粒的sT2細(xì)胞，導(dǎo)入SLA-2-YT/pCDH重組質(zhì)粒的sT2細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)如圖8所示，可見這些細(xì)胞生長狀態(tài)良好、相互之間的外觀形態(tài)無明顯區(qū)別。

圖8 光學(xué)顯微鏡下觀察慢病毒感染后的細(xì)胞狀態(tài)Fig. 8 Observation of cell state after lentivirus infection under light microscope

2.6 Western Blotting檢測SLA-2-YT/pCDH表達(dá)

以PK15細(xì)胞系為陽性對照，轉(zhuǎn)染空載體pCDH的sT2細(xì)胞為陰性對照，未轉(zhuǎn)染SLA-2-YT/pCDH質(zhì)粒的sT2細(xì)胞系為空白對照，通過Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢測SLA-2-YT/pCDH的表達(dá)情況。結(jié)果（圖9）表明，篩選出的4株細(xì)胞，與sT2、pCDH/sT2相比較，3號細(xì)胞株的SLA-2-YT基因得到了高豐度表達(dá)，大小約為45 kD，與理論值相符。用Image J軟件分析累積光密度值后計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量，用GraphPad Prism 8.0.1作圖并通過計(jì)算得出SLA-2-YT-pCDH/sT2 3號細(xì)胞株與sT2細(xì)胞、pCDH/sT2細(xì)胞相比較，SLA-2-YT呈優(yōu)勢表達(dá)，且相對表達(dá)量之間差異極顯著（P＜0.01）。表明插入載體的SLA-2-YT已在sT2細(xì)胞中成功表達(dá)，且表達(dá)量較高。

圖9 Western Blotting 檢測 SLA-2-YT/pCDH 在 sT2 細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 9 Western Blotting to detect the expression of SLA-2-YT/pCDH in sT2 cells

3 討論

本研究在構(gòu)建真核表達(dá)載體時(shí)選擇的pCDHCMV-MCS-EF1-Puro載體是慢病毒載體系統(tǒng)，其載體序列上有多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，可在PCR引物上添加酶切位點(diǎn)利于目的基因與真核表達(dá)載體連接；它具有氨芐青霉素抗性，篩選標(biāo)記為嘌呤霉素，便于前期單克隆菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞篩選［12］；本研究將Stbl 3菌株作為真核表達(dá)載體的宿主菌，它是慢病毒載體系統(tǒng)優(yōu)良的宿主菌株，其基因組中含有重組酶recA13突變，可有效抑制長片段末端重復(fù)區(qū)的重組，降低錯(cuò)誤重組的概率［13］。本研究用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是實(shí)驗(yàn)室前期利用基因編輯技術(shù)將PK15細(xì)胞的TAP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（TAP1、TAP2）敲除后得到的sT2細(xì)胞，該細(xì)胞中需TAP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與遞呈內(nèi)源性抗原的胞質(zhì)途徑被阻斷，因此只能遞呈外源性的抗原肽，從而可以通過有目的設(shè)計(jì)外源性抗原肽篩選細(xì)胞遞呈的SLA I限制性的抗原表位。但研究中發(fā)現(xiàn)，將TAP1和TAP2基因敲除后，PK15細(xì)胞本身表達(dá)的SLA I類分子急劇減少，甚至不表達(dá)，從而為引入外源SLA I分子在sT2表達(dá)創(chuàng)造了條件，從而可以建立表達(dá)特定SLA I類分子的sT2細(xì)胞系，將來可以篩選特定SLA I類分子限制性的CTL表位。在開展本實(shí)驗(yàn)時(shí)，慢病毒包裝并感染sT2細(xì)胞后的嘌呤霉素篩選過程并不順利，由于初次篩選時(shí)選擇的嘌呤霉素濃度不合理，SLA-2-YT在sT2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量不夠高。在設(shè)置合理的嘌呤霉素濃度梯度對sT2的嘌呤霉素最佳篩選濃度進(jìn)行確定后，選擇能夠殺死大部分sT2細(xì)胞的濃度（300 μg/mL），最終得到了優(yōu)勢達(dá)外源SLA-2-YT基因的sT2細(xì)胞。

煙臺黑豬是我國地方特色品種，研究我國地方品系豬SLA I類分子基因的表達(dá)及相關(guān)功能更具有戰(zhàn)略意義［9，14］。本研究不僅成功構(gòu)建了煙臺黑豬SLA-2-YT基因的真核表達(dá)載體，并且實(shí)現(xiàn)了在 sT2細(xì)胞的優(yōu)勢表達(dá)，從而建立了煙臺黑豬SLA-2-YT基因在sT2細(xì)胞中的抗原遞呈研究體系。課題組在后續(xù)研究中將進(jìn)行SLA-2-YT限制性的CTL多肽表位篩選，并進(jìn)行相關(guān)功能研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了SLA-2-YT/pCDH重組真核表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)染至sT2細(xì)胞，使其在sT2細(xì)胞中優(yōu)勢表達(dá)，為研究外源SLA-2-YT在sT2細(xì)胞中的抗原遞呈規(guī)律及CTL多肽表位篩選奠定了基礎(chǔ)。