劉謙謙 唐梓靜 李天真 李寶庫 朱蕾蕾

（1. 河北大學藥學院，保定 071002；2. 中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國家工程實驗室，天津 300308）

隨著現(xiàn)代化工行業(yè)的發(fā)展，染料在紡織廠、印染廠和造紙廠中被廣泛使用［1］。今天大多使用的染料都是經(jīng)還原、氧化、縮合、硝化或者磺酸化等合成得到，通常含有復(fù)雜的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)［2］。全球每年大約有8×105-9×105t不同的染料被生產(chǎn)，并在紡織品、皮革、紙張、塑料、化妝品和食物染色中廣泛使用［3-4］。偶氮染料以一個或多個R1-N=N-R2鍵存在，其中偶氮染料在每年生產(chǎn)的染料中所占比例為60%-70%，是使用比較廣泛的一類染料［5-6］。大約有90%的染料進入污水處理場，存在未處理完全的染料排放到河流中，不僅污染水質(zhì)，而且破壞光線的穿透等，對水體及周邊的生態(tài)系統(tǒng)造成危害，并威脅人類的生命健康［2，7］。利用安全、低成本的高效脫色微生物來處理染料廢水變得越來越受人們關(guān)注［8］。氧化還原酶類對染料分子有破壞作用，能夠達到脫色的效果。

NAD（P）H∶醌氧化還原酶1（NAD（P）H∶quinone oxidoreductase，NQO1，EC 1.6.99.2）是一種黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）依賴型蛋白，可以利用NAD（P）H作為輔因子催化包括醌類、醌亞胺類、硝基化合物和偶氮類染料等一系列底物的雙電子還原［9-11］。其還原反應(yīng)以乒乓機制進行，NAD（P）H和底物交替占據(jù)相同的結(jié)合位點的重疊區(qū)域，并參與雙氫離子的轉(zhuǎn)移，首先NAD（P）H進入活性位點還原FAD形成FADH2，然后底物進入活性位點被FADH2還原［12］。NQO1在抗氧化防御中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其通過還原內(nèi)源性醌類如維生素E、輔酶Q10產(chǎn)生穩(wěn)定的氫醌類化合物而發(fā)揮重要的抗氧化作用［13-14］。其次NQO1也是一個20S蛋白酶體相關(guān)的蛋白，其可以穩(wěn)定腫瘤抑制因子p53、p73，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［15-16］。同時，NQO1還能激活醌類化療藥物，成為治療癌癥的潛在藥物靶點［17］。有報道稱，來自大腸桿菌（E. coli）的偶氮還原酶（AzoR）和來自渾球紅細菌（R. sphaeroides）的偶氮還原酶（AZR）能夠催化偶氮染料的還原，且同時具有醌還原酶活性。也有研究表明，添加醌類氧化還原介質(zhì)，如2-羥基-1，4-萘 醌（2-hydroxy-1，4-naphthoquinone，HNQ）、 蒽醌-2-磺酸鹽（anthraquinone-2-sulfonate，AQS）、蒽醌 -2，6-二 磺 酸 鹽（anthraquinone-2，6-disulfonate，AQDS）能促進偶氮染料的還原［18-19］。Cui等［20］在有氧情況下利用E. coli CD-2的全細胞，在不添加氧化還原介質(zhì)條件下，只有8.5%甲基橙被脫色；而在甲萘醌存在的情況下，8 h時的脫色率達到40%以上。利用NQO1在體外進行偶氮染料的脫色研究較少。

本研究將人來源的NAD（P）H∶醌氧化還原酶（hNQO1）在大腸桿菌中成功進行異源表達，并進行蛋白純化，考察hNQO1對3種偶氮染料剛果紅和莧菜紅及活性黑5的脫色研究，旨為偶氮染料的脫色及降解提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 大 腸 桿 菌E.coli BL21 Gold（DE3）pET28a-hNQO1；大腸桿菌 E.coli BL21 Gold（DE3）pET28a均由所在實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 主要試劑：酵母粉（yeast extract），胰蛋白胨（tryptone）購自英國 OXOID公司；異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-dthiogalactoside，IPTG）購自天津樂寶生物科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate），甲萘醌（menadione）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；剛果紅（Congo red）購自上海源葉生物公司；莧菜紅（amaranth）購自北京國納宸宇科技有限公司；活性黑5（reactive black 5）購自Sigma Aldrich；1，4-二羥基蒽醌（1，4-Dihydroxyanthracene-9，10-dion），甲基對苯醌（2-Methlcyclohexa-2，5-diene-1，4-dione）購自上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；1，4-萘醌（1，4-Naphthoquinone）購自上海邁瑞爾化學技術(shù)有限公司；蒽醌（anthraquinone）購自國藥集團化學試劑有限公司；蒽醌-2-磺酸鈉鹽（sodium anthraquinone-2-sulfonate）購自上海吉至生化科技有限公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基：10 g NaCl，5 g酵母粉，10 g胰蛋白胨，121℃ 20 min滅菌使用；固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂糖。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 低溫高速離心機；移液槍；TeCan酶標儀；搖床；微孔板振蕩器；超聲破碎儀等。

1.2 方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 將E. coli pET28a-hNQO1劃線于LB固體平板（含50 μg/mL硫酸卡那霉素），挑單克隆接種于3 mL/管的LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL硫酸卡那霉素）中，37℃，220 r/min過夜培養(yǎng)16-20 h。將種子液以1%接種量接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL 硫酸卡那霉素）中，37℃，220 r/min條件下培養(yǎng)至OD600為0.7-0.8，添加0.5 mmol/L IPTG，10℃，220 r/min，培養(yǎng)24 h誘導(dǎo)蛋白表達。4℃，4 000 r/min離心20 min，棄掉上清液收集菌體，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白純化 用磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 6.2）重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎細胞，12 000 r/min離心30 min，收集上清液并于0.22 μm濾膜過濾，使用Ni Sepharose 6 Fast Flow His標簽蛋白純化填料自填裝鎳柱純化。

蛋白純化步驟：用5倍柱體積的去離子水沖洗Ni2+填充層析柱，再用5倍柱體積含有20 mmol/L咪唑的裂解緩沖液（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Hepes，pH 7.0）平衡Ni2+層析柱，隨即將過膜后的破碎上清加入層析柱中，使目的蛋白與層析柱充分結(jié)合；先用5倍柱體積含有20 mmol/L咪唑的裂解緩沖液（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Hepes，pH 7.0）進行洗脫雜蛋白，再用5倍柱體積含有50 mmol/L咪唑的洗雜緩沖液（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Hepes，pH 7.0）洗脫雜蛋白，最后用含有300 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Hepes，pH 7.0）洗脫目的蛋白得到hNQO1純酶。利用10 kD超濾管去除咪唑并濃縮置換磷酸鈉 緩 沖 液（0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 6.2），去除咪唑后，將hNQO1蛋白加入0.6 mmol/L FAD冰上孵育1 h，再使用超濾管置換緩沖溶液，并去掉表面游離的FAD，超濾結(jié)束后備用。

1.2.3 hNQO1純化后的蛋白濃度測定 以牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）為標準蛋白，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度。

1.2.4 hNQO1熱穩(wěn)定的測定 用磷酸鈉緩沖液將hNQO1蛋白稀釋到0.165 mg/mL，取出50 μL hNQO1分別在30、35、40、50和60℃條件下加熱30 min，加熱完成后，冷卻到室溫，離心再分別加入100 μL 100 mmol/L pH 6.2磷酸鈉緩沖液，以及50 μL 4 mmol/L NADH，于波長340 nm處室溫下測定吸光度（反應(yīng)機理：hNQO1催化NADH→NAD+，在波長340 nm處檢測NADH的下降來進一步表征酶的活性）。以最高酶活為100%，計算相對酶活力。

1.2.5 不同的介體小分子對剛果紅脫色影響的反應(yīng)體系 在200 μL反應(yīng)體系中分別加入0.07 mg/mL hNQO1純酶，0.5 mmol/L NADH、0.2 mmol/L剛果紅，0.05 mmol/L介體小分子（1，4-萘醌、蒽醌-2-磺酸鈉鹽、甲基對苯醌、1，4-二羥基蒽醌、蒽醌、甲萘醌），100 mmol/L pH6的Tris-HCl緩沖液。在30℃條件下反應(yīng)6 h，反應(yīng)0 h和6 h分別使用酶標儀在434 nm處檢測吸光度值。以0 h測得的吸光度值作為起始值，計算剛果紅的脫色率。

1.2.6 不同濃度的1，4-二羥基蒽醌對剛果紅脫色影響的反應(yīng)體系 在300 μL反應(yīng)體系中分別加入0.075 U/mL hNQO1、0.5 mmol/L NADH、2 mmol/L剛果紅，不同濃度的1，4-二羥基蒽醌（0.02 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L），100 mmol/L pH6的 Tris-HCl緩沖液。在30℃條件下反應(yīng)2 h，取反應(yīng)液20 μL加180 μL Tris-HCl緩沖液于96孔板中，使用酶標儀在434 nm處檢測吸光度值，計算剛果紅的脫色率。

1.2.7 hNQO1全細胞對剛果紅脫色影響的反應(yīng)體系 在400 μL反應(yīng)體系中加入菌體密度（OD600）約為10的hNQO1全細胞或pET28a空載體全細胞，2 mmol/L剛果紅，0.1 mmol/L 1，4-二羥基蒽醌，0.1 mol/L的醋酸鈉作為反應(yīng)緩沖液。在40℃下反應(yīng)6 h，反應(yīng)完成后12 000 r/min離心2 min，取出200 μL在96孔板中使用酶標儀在434 nm下檢測吸光度值的變化。反應(yīng)結(jié)束檢測完后，去除上清溶液，加入相同濃度的上述各溶液，在同樣條件下進行第二和第三次反應(yīng)。

1.2.8 hNQO1全細胞對莧菜紅脫色影響的反應(yīng)體系 在500 μL反應(yīng)體系中加入菌體密度（OD600）約為10的hNQO1全細胞或pET28a空載體全細胞，2 mmol/L莧菜紅，0.1 mmol/L 1，4-二羥基蒽醌，0.1 mol/L的醋酸鈉作為反應(yīng)緩沖液。在40℃下反應(yīng)6 h，反應(yīng)完成后12 000 r/min離心5 min，取出20 μL反應(yīng)液加180 μL 0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液于96孔板中使用酶標儀在520 nm處檢測吸光度值的變化。

1.2.9 hNQO1全細胞對活性黑5脫色影響的反應(yīng)體系 在500 μL反應(yīng)體系中加入菌體密度（OD600）約為10的hNQO1全細胞或pET28a空載體全細胞，2 mmol/L活性黑5，0.1 mmol/L 1，4-二羥基蒽醌，0.1 mol/L的醋酸鈉作為反應(yīng)緩沖液。在40℃下反應(yīng)6 h，反應(yīng)完成后12 000 r/min離心5 min，取出20 μL反應(yīng)液加180 μL 0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液于96孔板中使用酶標儀在596 nm處檢測吸光度值的變化。

1.2.10 hNQO1對剛果紅、莧菜紅、活性黑5等偶氮染料脫色率的計算 以不加菌體的吸光度值為起始值，觀察染料脫色的情況，根據(jù)下列公式計算脫色率。

式中：R為染料脫色率（%）；A0、A1為脫色反應(yīng)前后溶液的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 hNQO1的表達和純化

對E. coli BL21（DE3）pET28a-hNQO1挑取單克隆，進行誘導(dǎo)表達后，利用SDS-PAGE檢測hNQO1蛋白的表達情況。結(jié)果如圖1-A所示，在全細胞和破碎上清液中均含有目的蛋白條帶，說明hNQO1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在E.coli BL21（DE3）中能夠大量地表達，蛋白質(zhì)實際分子量約為30.8 kD。采用鎳柱親和層析純化hNQO1蛋白，其SDS-PAGE結(jié)果如圖1-B所示，純酶樣品在35 kD-25 kD處出現(xiàn)明顯條帶，與理論分子質(zhì)量30.8 kD結(jié)果相一致。

圖1 異源表達 hNQO1 的 SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of hNQO1 heterologously expressed

2.2 hNQO1熱穩(wěn)定的測定

將hNQO1在一系列溫度下（30、35、40、50和60℃）加熱30 min后，進行殘余酶活測定，結(jié)果如圖2所示，在30-40℃內(nèi)，hNQO1較穩(wěn)定，進一步升高溫度，其酶活迅速下降。所以，后續(xù)實驗在30℃或40℃條件下進行。

圖2 熱穩(wěn)定性對酶活力的影響Fig. 2 Influence of thermal stability on enzyme activity

2.3 偶氮染料及醌類小分子化合物的選擇

為研究hNQO1對偶氮染料的脫色作用，選擇了剛果紅、莧菜紅及活性黑5等偶氮染料進行脫色研究（表1）。以醌類小分子化合物（表2）作為介體，輔助醌氧化還原酶對偶氮染料的脫色。介體小分子可以加速初級電子供體向終極電子受體傳遞，在偶氮染料的脫色過程中起到橋梁作用。具體作用機理為：醌類小分子化合物通過醌還原酶還原成氫醌，氫醌在經(jīng)過純化學作用使偶氮染料還原，實現(xiàn)偶氮化合物的脫色。

表1 染料名稱及其最大吸收波長Table 1 Dye names and their maximum absorption wavelengths

表2 小分子介體的名稱及結(jié)構(gòu)Table 2 Names and structures of small molecular mediators

2.4 不同的小分子對hNQO1純酶脫色剛果紅的影響

首先選擇0.05 mmol/L為介體小分子（1，4-萘醌、蒽醌-2-磺酸鈉鹽、甲基對苯醌、1，4-二羥基蒽醌、蒽醌、甲萘醌）在反應(yīng)體系中的濃度。在反應(yīng)體系中，分別添加0.05 mmol/L的上述不同的介體小分子，分別以加酶與不加酶作為對照，在30℃條件下反應(yīng)6 h后，使用酶標儀在434 nm處檢測吸光度的變化，記錄在不同介體小分子下，hNQO1對剛果紅染料的脫色情況（圖3）。介體小分子為1，4-二羥基蒽醌時，hNQO1（0.07 mg/mL）對剛果紅脫色率為35.5%。所以，與其它介體小分子相比，1，4-二羥基蒽醌輔助hNQO1使剛果紅染料脫色效果較好。

圖3 不同介體小分子對hNQO1脫色剛果紅影響Fig. 3 Influence of different medium small molecules on the decolorization of hNQO1 Congo red

2.5 不同濃度的1 4-二羥基蒽醌對hNQO1純酶脫色剛果紅的影響

在上述5種介體小分子對hNQO1脫色剛果紅染料的影響中，選擇以1，4-二羥基蒽醌為目標在反應(yīng)體系中測試其不同濃度（0.02 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L） 對脫色率的影響，在30℃條件下反應(yīng)2 h，使用酶標儀在434 nm處檢測吸光度的變化。如圖4所示，介體小分子1，4-二羥基蒽醌在0.1 mmol/L時，hNQO1對剛果紅脫色率為29.2%，脫色效果較好，隨著小分子濃度的增加可能會存在析出，脫色率差別不大。因此，選擇0.1 mmol/L 1，4-二羥基蒽醌進行后續(xù)試驗。

2.6 重復(fù)利用hNQO1全細胞對剛果紅進行脫色的研究

經(jīng)過上述的研究，成功篩選出最佳的介體小分子—1，4-二羥基蒽醌。在1，4-二羥基蒽醌小分子的存在下，pET28a全細胞作為對照，與hNQO1全細胞分別對剛果紅進行脫色，我們首先選擇了菌體密度（OD600）為2、2.5和10進行剛果紅脫色，在434 nm處檢測吸光度，相比較菌體密度為10條件下最好（數(shù)據(jù)未顯示）。所以，我們進一步嘗試在1，4-二羥基蒽醌存在的反應(yīng)體系中重復(fù)多次利用hNQO1全細胞（菌體密度為10）對偶氮染料進行脫色。如圖5所示，在40℃反應(yīng)6 h后，hNQO1全細胞對剛果紅的脫色率為94.0%，而pET28a全細胞對剛果紅的脫色率為62.6%。第一次反應(yīng)結(jié)束后，離心去除上清液，二次加入剛果紅及介體小分子進行脫色，再次在40℃下反應(yīng)6 h發(fā)現(xiàn)，pET28a全細胞對剛果紅的脫色率只有9.5%，而hNQO1全細胞對剛果紅的脫色率為79.7%。第三次加入剛果紅進行脫色，40℃條件下反應(yīng)6 h后，發(fā)現(xiàn)pET28a全細胞對剛果紅的脫色率為5.1%，hNQO1全細胞對剛果紅的脫色率為20.3%。菌體3次利用的結(jié)果顯示，hNQO1全細胞對剛果紅的脫色效果較好。

圖5 重復(fù)利用hNQO1全細胞對剛果紅染料脫色的研究Fig. 5 Decolorization of Congo red dye by reusing whole cells of hNQO1

2.7 hNQO1對莧菜紅及活性黑5進行脫色的研究

為進一步探究hNQO1對偶氮類染料的脫色效果，選擇了其他兩種染料：莧菜紅、活性黑5進行脫色實驗。如圖6所示，在1，4-二羥基蒽醌小分子的存在下，pET28a全細胞作為對照，與hNQO1全細胞（菌體密度為10）分別對莧菜紅、活性黑5進行脫色，在40℃反應(yīng)6 h后，hNQO1全細胞對莧菜紅染料的脫色率為18.8%，對活性黑5染料的脫色率為16.4%。

圖6 hNQO1全細胞對莧菜紅、活性黑5等兩種偶氮染料的脫色Fig. 6 Decolorization of two azo dyes such as amaranth and reactive black 5 by whole cells of hNQO1

3 討論

偶氮染料因分子結(jié)構(gòu)含有一個或多個R1-N=N-R2鍵而命名，因其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，很難利用傳統(tǒng)的污水處理系統(tǒng)去降解，本研究利用NAD（P）H∶醌氧化還原酶對3種偶氮類染料（剛果紅、莧菜紅和活性黑5）進行脫色實驗，測試不同介體小分子對脫色的影響，選出最佳介體小分子1，4-二羥基蒽醌。hNQO1全細胞對偶氮染料剛果紅的脫色率最高為94.0%，且全細胞多次利用后仍存在20.3%的脫色效果。此外，初步探索了hNQO1對莧菜紅、活性黑5的脫色，為偶氮類染料的脫色降解提供了一種新的思路。Hong等［21］利用AQS和ADQS作為氧化還原介體考察了Shewanella decolorationis S12對莧菜紅的脫色，在8 h后脫色率75%左右。Rahman等［22］利用假單胞菌Pseudomonas euroginosa在好氧情況下對剛果紅染料進行脫色，在pH 9，溫度為26℃的情況下，反應(yīng)5 d脫色率達87.64%。上述研究分別對偶氮染料莧菜紅及剛果紅進行了脫色研究發(fā)現(xiàn)，文獻中所提到的對剛果紅進行的脫色，反應(yīng)5 d脫色率達87.64%，與本文中對剛果紅的脫色率有所差別，本研究通過反應(yīng)體系的優(yōu)化最終實現(xiàn)hNQO1全細胞對剛果紅最高為94.0%的脫色率，且hNQO1具有較好的穩(wěn)定性，其全細胞多次利用后對剛果紅仍有20.3%的脫色效果。

周覓等［5］在考察E.coli JM109和E.coli YB全細胞對莧菜紅的脫色時，48 h脫色率為12%。Wang等［23］在一家紡織廠周圍的土壤樣品中分離得到Bacillus sp. YZU1菌株（具有偶氮還原酶特性）對多種活性染料具有較強脫色能力（包括偶氮染料），在40℃，pH 7.0條件下對活性黑5的脫色效果最佳。本研究初步探索了在1，4-二羥基蒽醌存在下，反應(yīng)6 h后，hNQO1全細胞對莧菜紅染料的脫色為18.8%，對活性黑5的脫色率為16.4%。一方面后續(xù)通過對反應(yīng)體系的優(yōu)化，希望能夠進一步提高其脫色率；另一方面，與剛果紅脫色相比，hNQO1對莧菜紅、活性黑5的脫色效果不是十分明顯，原因可能是莧菜紅、活性黑5與剛果紅在結(jié)構(gòu)方面有差異，莧菜紅、活性黑5等偶氮染料的脫色與苯環(huán)上的取代基的性質(zhì)、位置、數(shù)量有關(guān)，甲氧基、磺酸基、硝基、甲基和羧基等基團的存在可能會使染料分子更難脫色［1］，同時，高極性取代的磺化偶氮染料較難進入胞內(nèi)被還原［24］。

4 結(jié)論

本研究成功將hNQO1在大腸桿菌中異源表達，并進行蛋白純化，通過對酶的熱穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，其在30-40℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性很好。篩選了6種不同的介體小分子對hNOQ1脫色剛果紅的影響發(fā)現(xiàn)，1，4-二羥基蒽醌具有最佳的輔助hNQO1對偶氮染料剛果紅的脫色效果，hNQO1對偶氮染料莧菜紅及活性黑5有微弱的脫色作用。