李珍陽 姜潤 劉琳 李思琦 王曉慧

（1. 陜西省西咸新區(qū)空港新城管理委員會，西安 712034；2. 北京化工大學化學工程學院，北京 100029）

隨著我國人口數量的增加，工農業(yè)的快速發(fā)展，氨氮污染問題日益突出［1］。氨氮主要來源于生活污水、農業(yè)灌溉及工業(yè)廢水［2］。氨氮含量過高不僅會造成水體富營養(yǎng)化，也會對人體健康構成威脅。目前，在氨氮的處理技術中，生物法具有設備簡單、成本低、效率高等優(yōu)勢，已成為氨氮去除的主流技術［3］，如連續(xù)流分段進水生物脫氮工藝（continuous step feed biological nutrient removal，CSFBNR）［4］，新型預曝氣/厭氧-缺氧-好氧法（anaerobic-anoxicoxic，OAA）/間歇曝氣的組合工藝（sequencing batch reactor，SBR）［5］等。生物法去除氨氮主要是利用硝化菌來完成，在好氧條件下，硝化菌會將NH4+-N或有機氮降解轉化為亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮，進而在通過反硝化細菌完成脫氮。硝化細菌分為異養(yǎng)型和自養(yǎng)型，與對環(huán)境因素敏感的自養(yǎng)型硝化菌相比，異養(yǎng)型硝化菌具有適應性強，能以多種有機物作為碳源進行生長繁殖等優(yōu)勢而被廣泛應用［6-9］。近年來，發(fā)現越來越多的異養(yǎng)型硝化菌，Gupta等［10］發(fā)現菌株 T. pantotropha 制成的混合菌劑具有較好的硝化能力，Joo、Rout和Zhang等［11-13］也發(fā)現了3種不同菌屬的異養(yǎng)硝化菌，分別為產堿菌屬（Alcaligenes）的Alcaligenes faecalis strain 4、芽孢桿菌屬（Bacillus）的Bacillus cereus GS-5 strain、假單胞菌屬（Pseudomonas）的 Pseudomonas stutzeri YZN-001。

然而生物法去除氨氮仍存在較大弊端，在北方地區(qū)尤其是黑龍江省，冬季水溫處于10℃以下，異氧硝化菌的生物活性受到抑制［14］，出水中氨氮含量過高，最終會導致出水質量不佳。經調查研究發(fā)現，目前低溫菌的篩選存在以下問題：（1）篩選溫度過高，冬季不適用，如趙燕［15］從青藏高原凍土中篩選出3株脫氮優(yōu)勢菌株，并按一定比例將3株脫氮菌配制成混合菌群投加至氨氮廢水中，在16℃的條件下，配制得混合菌群對NH4+-N的去除效率達85%；（2）低溫篩選的菌株氨氮的去除效果不佳，如孫靜等［16］從北方人工濕地分離篩選得到一株菌可8℃條件下進行脫氮，氨氮去除率為50.63%。因此篩選出低溫高效的異養(yǎng)硝化菌是解決此類問題的關鍵。本研究分別從3種不同的泥樣中，在13℃條件下篩選出3株耐低溫性能較好的異養(yǎng)硝化菌，并對分離出的菌株進行形態(tài)特征、生理生化特性以及16S rDNA測序結果進行分析。根據前人研究所設溫度和處理效率的高低［15-16］，選擇更加貼近冬季且處理效率較高的溫度，因此培養(yǎng)溫度設置為13℃。選用3種不同的污泥制成復合菌劑，因為復合菌劑可能存在協同菌株，可以提高氨氮去除效率，同時進行固定化后可避免菌的流失，因此將篩選的菌株按一定比例進行混合后形成復合菌劑，分析碳源種類、氮源濃度、pH及鹽度等條件對菌劑硝化性能影響，進而確定最優(yōu)硝化條件，最后對復合菌劑進行固定化測定氨氮去除效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 泥樣樣品來源 泥樣分別取自實驗室培養(yǎng)的好氧顆粒污泥、冬季北京化工大學污水處理站活性污泥、江蘇省某污水處理廠生物轉盤污泥。

1.1.2 培養(yǎng)基的種類及成分配比 根據培養(yǎng)需要，共配置4種類型的培養(yǎng)基，分別為活化培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基、異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基和異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH范圍7.0-7.4，成分配比如表1所示，培養(yǎng)基的配置參考袁雪嬌［17］培養(yǎng)高效異養(yǎng)硝化菌的配方。配置好的培養(yǎng)基均置于高壓滅菌鍋中121℃，滅菌30 min后再使用。

表1 培養(yǎng)基成分表Table 1 Medium composition

1.1.3 試劑的配制 1 mol/L的NaOH溶液：稱取4 g的NaOH固體粉末于燒杯中，加入適量的蒸餾水使之溶解，再用100 mL的容量瓶定容。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集、分離、純化及保存 富集：將冬季北京化工大學污水處理站的活性污泥進行靜置沉淀，取10 mL沉淀后的活性污泥樣品，5 g生物轉盤泥樣、5 g實驗室培養(yǎng)的好氧顆粒污泥，分別置于含無菌水的錐形瓶中進行振蕩培養(yǎng)。錐形瓶中加入少量玻璃珠，將污泥絮體打散，有利于菌的釋放。振蕩一段時間后靜置10 min，取10 mL的上清液于富集培養(yǎng)基中進行異養(yǎng)硝化菌的富集，置于13℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)振蕩器上培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基渾濁。然后再取10 mL富集培養(yǎng)液于新的富集培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，此步驟重復4次，以確保得到較高的菌濃度。

分離：取1 mL最終富集培養(yǎng)液于9 mL的無菌水中進行梯度稀釋，稀釋梯度為10-1-10-6。選擇10-4、10-5和10-6的稀釋濃度，各取200 μL菌液采用稀釋涂布法涂布于固體培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)，每份樣品做3個重復，最后置于生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，溫度為13℃。

純化：待培養(yǎng)基長出菌落后，挑取單個菌落，通過平板劃線法反復劃線得到純化的菌落。

保存：將純化的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱中直至斜面長出菌落后放于4℃冰箱保存，每兩個月進行菌株的活化，活化后在進行培養(yǎng)接種于斜面。同時將菌株進行擴大培養(yǎng)與已滅菌40%的甘油以1∶1的比例存于-20℃冰箱。

1.2.2 菌株篩選 將上述分離得到的純化菌株進行擴大培養(yǎng)，吸取適量培養(yǎng)后的菌液置于離心機上5 000 r/min，離心3 min，然后制備成菌懸液放入含異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在好氧的條件下，在13℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)5 d。測量培養(yǎng)前后菌液中NH4+-N的含量變化，篩選出能夠在低溫條件下，較好降解NH4+-N的菌株。重復上述操作，以篩選出高效降解NH4+-N的菌株。將篩選出的菌株進行鑒定，包括形態(tài)觀察、革蘭氏染色及16S rDNA測序分析。

16S rDNA測序分析步驟：用DNA試劑盒提取DNA，選取引物27F primer和1492R，序列分別 為AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和TACGGYTACCTTGTTACGACTT。PCR反應體系如表2所示。PCR反應過程：預變性94℃ 3 min，進行1次循環(huán)；變性 94℃ 30 s；退火 54℃ 30 s；延伸 72℃ 90 s。變性、退火和延伸過程循環(huán)24次。

表2 PCR反應體系Table 2 PCR reaction system

繪制生長曲線時，需將斜面培養(yǎng)基上經過篩選的菌株活化，并置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔3 d測定一次OD600。

1.2.3 復合菌株的構建 設計3因素3水平正交實驗，3因素分別為上述篩選出的高效降解菌株命名為AJ-5、BJ-4和CJ-1，3水平分別為接種量1 mL、2 mL和3 mL。將AJ-5、BJ-4和CJ-1活化獲得菌懸液，各菌液調至OD600相同，按正交實驗的各菌株接種量進行混合，然后接種于含100 mL異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基的錐形瓶中13℃，150 r/min培養(yǎng)3 d，測量培養(yǎng)前后菌液中NH4+-N的含量變化，確定最佳配比。

1.2.4 菌株脫氮因素影響 碳源種類、氮源濃度、pH和鹽度對異養(yǎng)硝化菌的脫氮性能具有顯著的影響［18-23］。本實驗通過選取4種碳源（乙酸鈉（CH3COONa）、葡萄糖、檸檬酸鈉、丁二酸鈉），按照C/N=15計算添加量［24］，5個氮源濃度梯度（50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L 和 400 mg/L），5個pH值（pH為5、6、7、8和9）和4個鹽濃度梯度（10 g/L、20g/L、30 g/L和40 g/L）來探究不同因素對復合菌劑去除NH4+-N能力的影響。

1.2.5 復合菌的固定化及脫氮效率 采用海藻酸鈉-硅藻土對復配菌株進行包埋固定化，其成分比例為硅藻土1%、海藻酸鈉（sodium alginate，SA）2%、CaCl23%和沸石6%，從污水處理站的曝氣池采集生活污水，NH4+-N 濃度為3.92 mg/L，每升污水中添加NH4Cl 0.04 g，得到NH4+-N含量為15.13 mg/L，進行3組實驗，1組作為空白對照組，2組為游離復合菌劑組，3組為固定化顆粒組，測定其處理效果。

1.2.6 測定方法 NH4+-N測定采用納氏試劑分光光度法；OD600測定采用光電比濁法；pH值用FE28 pH計進行測量。

2 結果

2.1 菌株篩選結果

從活性污泥中篩選出低溫異養(yǎng)硝化菌19株，生物轉盤中篩選出17株，好氧顆粒污泥中篩選出14株，根據圖1顯示上述部分菌株降解NH4+-N情況，選出降解效率最好的3株菌分別命名為AJ-5、BJ-4和CJ-1，其對應的NH4+-N去除率為70.57%、73.66%和68.14%。

圖1 菌株對NH4+-N的去除率Fig. 1 Removal rate of NH4+-N by various strains

2.2 菌落的形態(tài)特征

菌株AJ-5在固體培養(yǎng)基上呈乳白色，不透明，表面濕潤易被挑起，革蘭氏染色呈陰性（圖2-A，圖3-A）；菌株BJ-4的菌落形態(tài)呈乳白色，不透明，表面濕潤凸起，邊緣整齊，革蘭氏染色呈陰性（圖2-B，圖3-B）；CJ-1的菌落同樣為乳白色，不透明，表面濕潤，但是邊緣不整齊，革蘭氏染色呈陰性（圖2-C，圖 3-C）。

圖2 各菌株菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of each strain

圖3 革蘭氏染色呈像Fig.3 Gram chromatogram of each strain

2.3 16S rDNA序列及系統發(fā)育分析

對16S rDNA測序結果分析可知，AJ-5的序列長度為1 316 bp，BJ-4的序列長度為1 310 bp，CJ-1的序列長度為1 327 bp。將測序結果與EzBioCloud數據庫進行對比，結果顯示AJ-5鑒定為Acinetobacter johnsonii strain，BJ-4鑒定為Acinetobacter celticus strain，CJ-1鑒定為Acinetobacter albensis strain，3株菌均為不動桿菌屬。選擇Mega.7.0的NJ（neighbour Joining）法構建各菌株的系統發(fā)育樹，其結果如圖4-6所示。

圖4 菌株AJ-5的系統發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the bacterial strain AJ-5

2.4 菌株的生長曲線

AJ-5、BJ-4和CJ-1的OD600的變化情況如圖7所示。從圖中可知，0-15 h內，3株菌處于適應階段，生長不明顯。15 h-27 h內，各菌株處于對數生長期，營養(yǎng)物質充足，生長迅速。27 h，CJ-1的OD600最大的濃度值為0.766，27 h-39 h內，該株菌處于穩(wěn)定期，OD600變化不明顯，39 h后開始有較為明顯的下降趨勢，此時菌的數量減少。AJ-5和BJ-4的OD600的濃度值在30 h左右達到最大，分別為1.379和0.738，之后AJ-5的OD600的濃度值一直維持在1.3左右的水平，而BJ-4則隨時間增加而減少，BJ-4、CJ-1后期數量開始下降可能是對碳源的利用能力較低，營養(yǎng)物質短缺導致，因此AJ-5適應低溫的環(huán)境能力更強，能夠更高效的利用能源物質。綜上所述，為保證充足的生物量，應選擇30 h左右的菌液。

圖5 菌株BJ-4的系統發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of the bacterial strain BJ-4

圖6 菌株CJ-1的系統發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of the bacterial strain CJ-1

圖7 菌株生長曲線圖Fig.7 Growth curve of strain

2.5 復合菌株最佳配比確定

如上所述，選擇30 h左右的菌液進行正交實驗，來確定最佳配比，其結果如表3所示。根據K值高低可判斷，最佳為A1B1C1即AJ-5、BJ-4和CJ-1各1 mL進行混合，氨氮的去除能力可達72.94%，同時將復合菌劑命名為ABCJ-1。對比各因素的極差R，C因素的R最高為4.15%，說明CJ-1接種量對氨氮去除率影響最大，原因可能是CJ-1的接種量大小會引發(fā)更為激烈的營養(yǎng)物質競爭，3株菌株的生物量發(fā)生改變，從而影響氨氮的去除率。因此適宜的接種量對于復合菌劑的硝化能力也具有重要的意義。

表3 正交實驗設計及結果Table 3 Design and results of orthogonal experiment

2.6 菌株脫氮因素研究結果

2.6.1 碳源種類對復合菌株（ABCJ-1）脫氮效果的影響 本次共選取4種常見的有機碳源進行探究，分別是乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉和葡萄糖。不同碳源對氨氮去除率的影響以及OD600的變化情況如圖8所示。從圖8-A可知，以檸檬酸鈉為唯一碳源菌劑生長最好，30 h后OD600維持在1.2左右，其次是丁二酸鈉、乙酸鈉，以葡萄糖為唯一碳源菌劑生長最差，幾乎無增長現象。由圖8-B可知，菌劑在檸檬酸鈉的培養(yǎng)基中NH4+-N去除效率最高為84.91%，丁二酸鈉、乙酸鈉次之去除效率也在65%以上，在葡萄糖培養(yǎng)基中，無去除效果。綜上所述，檸檬酸鈉為最佳碳源。同時可以觀察到添加不同碳源的菌劑NH4+-N去除效率與其生長量變化是一致的，說明菌株的生長量對于菌劑的硝化能力有直接影響。

圖8 菌劑在不同碳源下OD600濃度變化（A）及NH4+-N去除率變化（B）Fig.8 Change of NH4+-N removal rate (A) and OD600 concentration (B) of microbial inoculum under different carbon sources

2.6.2 氨氮濃度對復合菌株（ABCJ-1）脫氮效果的影響 氨氮濃度高低直接影響碳氮比，因此也是影響微生物生長的重要因子。由圖9-A可知，NH4+-N的濃度為50 mg/L時，OD600接近1，NH4+-N的濃度為100 mg/L-400 mg/L時，OD600大于1.1，說明菌劑具有較好的耐受性，可在高氨氮濃度下正常生長。由圖9-B可知，NH4+-N的濃度為50 mg/L，幾乎完全去除，去除率可達96.92%，但隨著NH4+-N濃度的增加，去除效果越來越差，可能是C/N過低，影響了微生物的硝化過程，抑制了硝化反應的進行。綜上所述，最適的NH4+-N的濃度為50 mg/L。

圖9 菌劑在不同氮源濃度下OD600濃度變化（A）及NH4+-N去除率變化（B）Fig.9 Change of NH4+-N removal rate (A) and OD600 concentration (B) of microbial inoculum under different nitrogen source concentration

2.6.3 pH對復合菌株（ABCJ-1）脫氮效果的影響pH的高低會影響微生物的生長及生物活性，因此選取適宜的pH對菌劑硝化能力具有重要意義。由圖10-A可知，在pH為5-8范圍內，菌劑的生物量會隨著pH的上升而增加，當pH 8時，OD600濃度值最大約為1.1，當pH大于8時，OD600濃度值小于1，說明復合菌劑更適合在弱堿性的條件下生長。菌劑在不同初始pH條件下對NH4+-N的去除效果如圖10-B所示，隨著pH的增加，NH4+-N的去除率從45.2%增值至82%，當pH 8時，NH4+-N的去除率最大為82%，當pH＞8時，NH4+-N的去除率有所下降，因此最佳pH為8。

2.6.4 鹽度對復合菌株（ABCJ-1）脫氮效果的影響 本實驗設計了鹽度梯度來探究不同鹽度對菌劑生長及硝化能力的影響。由圖11-A可知，鹽度在10 g/L-30 g/L范圍內，菌劑的OD600均可達到1.1以上，但是會隨著鹽度增加，生長所需的時間越來越長，當濃度大于30 g/L時，菌劑的生長狀態(tài)變差，OD600僅0.318。菌劑對NH4+-N的去除率如圖11-B所示，10 g/L-20 g/L時，去除效果良好，可達70%以上，當濃度大于30 g/L，去除效率低于60%。綜上所述，菌劑的最適宜的鹽度范圍為10 g/L-20 g/L。

圖11 菌劑在不同鹽度下OD600濃度變化（A）及NH4+-N去除率變化（B）Fig.11 Change of NH4+-N removal rate (A) and OD600 concentration (B) of microbial inoculum under different salinities

2.7 復合菌劑的脫氮效果

按照比例硅藻土1%、SA 2%、CaCl23%、沸石6%，在最優(yōu)化的條件下進行固定化，1組為空白對照組未作處理，2組為游離復合菌劑，3組為固定化菌劑，菌劑對氨氮的去除效率如圖12所示。隨著時間增加NH4+-N含量先依次下降后有輕微上升。在48 h時，1組NH4+-N去除率為40.4%；2組NH4+-N去除率為84.28%；3組NH4+-N的含量降至0.626 mg/L，去除率為95.86%，固定化菌劑處理效果最好。

圖12 固定化菌劑氨氮的去除效率Fig.12 Removal efficiency of ammonia nitrogen immobilized bacteria agent

3 討論

對復合菌劑進行探究的過程中，我們分別從碳源種類、氨氮濃度、pH、鹽度4個方面進行討論。碳源種類不僅影響著異養(yǎng)硝化菌的生長繁殖，同時還影響著硝化能力的大?。?5］。有些異養(yǎng)硝化菌如Alcaligenes faecalis No.4［26］對于碳源要求極為苛刻，從而也限制了該菌的廣泛應用，便宜易得、去除效果較好的碳源對于低溫異養(yǎng)硝化菌的實際應用很重要。ABCJ-1的最佳碳源為檸檬酸鈉，其原因可能是檸檬酸鈉是代謝過程中的產物，更容易被細菌利用進行代謝繁殖，且分子質量小于300，有研究表明，好氧硝化會受碳源分子質量的影響，尤其是分子質量小于300的碳源，若濃度過高會對硝化過程產生顯著的抑制作用［27］。本次以C/N為15計算碳源的添加量，去除效率可達84.91%，進一步證明了Liu等［24］研究成果的可靠性，同時在較低碳氮比的條件下進行硝化反應可有效解決碳源不足等問題。

最佳NH4+-N的濃度為50 mg/L，在100 mg/L-400 mg/L濃度范圍內，OD600仍維持在1.1。在城市污水處理系統中，自養(yǎng)型硝化菌的比例為0.086，氨氮需要保持一定濃度才能保證自養(yǎng)型硝化菌的正常生長［28］，而ABCJ-1耐高氨氮濃度，因此氨氮濃度沖擊對菌劑生長影響較小，相比之下，復合菌劑更具有生存優(yōu)勢。

適宜的pH會維持微生物體內酶的穩(wěn)定性，并通過影響細胞膜的電位來促進對營養(yǎng)物質的利用［29］。ABCJ-1的最適pH為8，但在酸性環(huán)境下，復合菌劑生長緩慢，菌劑的生長量小于0.7，其原因可能是在酸性條件下游離氨（NH3）數量較少，降低了參與硝化反應過程中氨單加氧酶（AMO）的活性，從而會抑制異養(yǎng)硝化反應［30］。

高鹽度廢水會影響菌體內脫氫酶的活性，抑制其生長和相關的生理功能［31］，但是也有研究表明，適量的鹽會促進微生物的生長，如Halomonas campisalis ha3菌［32］，加入適量的NaCl后，生長速率可達到 0.58 h-1，本研究確定的最佳鹽度范圍為10 g/L-20 g/L，其適應鹽度范圍相比于HN-02菌株［33］更為廣泛。

從復合菌劑的脫氮效果來看，固定化顆粒比游離的復合菌劑去除效果更好，其原因在于復合菌劑進行固定化后，生物的負荷量高，菌不易流失，生物穩(wěn)定性提升，耐受力也隨之增強［34］。

低溫異養(yǎng)硝化菌對冬季污水處理廠的污水處理具有重要意義，除了探討環(huán)境因素外還需要探究低溫異養(yǎng)硝化菌的耐冷機制以及其他功能的發(fā)掘，以更好地應用到實際中，解決冬季生物處理的難題。馬銀鵬等［35］在一株低溫氨氮去除能力較強的異養(yǎng)硝化細菌Acinetobacter harbinensis HITLi 7T的基因組信息中發(fā)現了冷休克蛋白基因SE27_RS01265，該基因在12.5℃時進行高表達，因此推測在不動桿菌中，該蛋白是菌株耐冷的主要調節(jié)因子。同時Richardson等［36］提出了異養(yǎng)硝化菌的脫氮途徑的假說，如圖13所示。該圖不僅列出硝化反應涉及的酶，同時表明了反硝化途徑中參與的酶，因此可通過判定酶的種類來間接驗證是否存在反硝化作用。本次篩選出的低溫復合菌劑可以在耐冷基因表達以及是否存在好氧反硝化作用方面進行后續(xù)深入地探究。

圖13 異養(yǎng)硝化菌的脫氮途徑Fig.13 Nitrogen removal ways of heterotrophic nitrifying bacteria

4 結論

從3種不同的泥樣中共篩分出3株低溫異養(yǎng)硝化菌，分別命名為AJ-5、BJ-4和CJ-1，通過16S rDNA的測序以及系統發(fā)育樹的構建，確定3株菌均屬于不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）。通過正交實驗，確定復合菌劑的最佳配比1∶1∶1，將復合菌劑命名為ABCJ-1，并探究碳源種類、氨氮濃度、pH及鹽度對ABCJ-1脫氮的影響，結果顯示當碳源為檸檬酸鈉，氨氮的濃度為50 mg/L、pH 8、鹽度在10 g/L-20 g/L時，ABCJ-1硝化能力最好。對復合菌劑按照比例硅藻土1%、SA 2%、CaCl23%和沸石6%進行固定化后，氨氮的轉化能力可達95.86%。