武歡 盧珍紅 郝向陽(yáng) 王斌 焦元辰 楊春梅 程春振，4

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，昆明 650100；3. 玉溪云星生物科技有限公司，玉溪 652604；4. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太谷 030801）

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，可高效清除生物體內(nèi)超氧化物陰離子、過氧化氫和羥基自由基等物質(zhì)［1-2］。它還可以通過誘導(dǎo)其他一些抗氧化酶的活性，在有機(jī)體維持自由基動(dòng)態(tài)平衡過程中發(fā)揮重要作用［3］。所有SOD的催化中心都含一個(gè)金屬離子，根據(jù)金屬輔基的差異，SOD家族可分為Cu/ZnSOD、FeSOD、MnSOD和NiSOD等4類［4］。其中，Cu/ZnSOD在植物中分布最廣、穩(wěn)定性最高，可提高植物的耐鹽性［5］。FeSOD僅存在于葉綠體中，熱穩(wěn)定性高［6］，參與調(diào)控植物的抗寒性及抗氧化能力［7-8］。與前兩種SOD不同，MnSOD主要是誘導(dǎo)型表達(dá)［9］，廣泛參與植物的抗逆防御，與旱生植物耐旱、耐鹽能力密切相關(guān)［10］。此外，MnSOD和FeSOD具有很高的相似性，可能起源于共同的祖先基因［11］。與FeSOD類似，MnSOD對(duì)植物抗寒性的也有促進(jìn)作用［12］。而Ni-SOD是最近從土壤微生物和藍(lán)細(xì)菌分離獲得的一種SOD，與其他SOD相似性較低［4，13］，目前在植物中尚未見報(bào)道。

鑒于SOD在植物抗逆防護(hù)反應(yīng)中的重要作用，人們對(duì)編碼SOD的基因展開了大量研究［14］。自1982年科學(xué)家從玉米中克隆獲得了SOD基因后［15］，眾多單子葉和雙子葉植物SOD基因被陸續(xù)克隆獲得［16］。多項(xiàng)研究顯示：提高SOD基因的表達(dá)可賦予植物抵抗多種非生物脅迫的能力。如過表達(dá)南瓜SOD的擬南芥，其冷誘導(dǎo)基因和干旱響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)顯著升高，抗低溫和干旱能力得到明顯增強(qiáng)［17］。過表達(dá)花生Cu/ZnSOD的煙草對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的抗性顯著提升［11］。還有研究指出過表達(dá)MnSOD 可提高煙草［18］、小麥［19］和紫桿檉柳［20］等植物的抗鹽性。

非洲菊（Gerbera jamesonii）作為世界五大鮮切花之一，具有極高的商業(yè)價(jià)值［21］。目前有關(guān)非洲菊SOD基因的研究較少。在本研究中，我們從實(shí)驗(yàn)室前期獲得的非洲菊轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得一個(gè)包含完整ORF的SOD基因序列，使用反轉(zhuǎn)錄PCR克隆獲得該基因并對(duì)其進(jìn)行了系列生物信息學(xué)分析，同時(shí)還研究了該基因在IAA、SA和GA3等激素處理和鹽、干旱和低溫等非生物脅迫處理下的表達(dá)模式，以期為揭示該基因的功能及其在非洲菊抗逆育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用非洲菊品種‘玲瓏’由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所提供。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致、株高約為30 cm的植株，取根、葉柄和葉片用于 RNA 提?。?2］。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 IAA、GA3和SA等3種激素（濃度均為 100 μmol/L）和鹽脅迫（200 μmol/L NaCl）處理參照孫雪麗等［23］的方法，于處理0 h、2 h、4 h、8 h、24 h和48 h取葉片。干旱脅迫（30% PEG-3000）處理參照郝向陽(yáng)等［24］的方法，由于PEG模擬干旱處理植株顯癥時(shí)間較早，因此選擇于處理后0 h、1 h、2 h、4 h和6 h取葉片。4℃低溫處理參照王星淇等［25］的方法，于處理后0 h、4 h、8 h、12 h和24 h取葉片。所有樣品取樣后立即置于液氮中速凍，之后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 利用Trizol RNA提取試劑盒（TaKaRa）提取非洲菊葉片總RNA。采用RevertAid第一輪cDNA 合成試劑盒（thermo scientific）合成cDNA第一鏈，用于基因全長(zhǎng)克隆。同時(shí)采用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removel）試劑盒（全式金）逆轉(zhuǎn)錄合成不同處理樣品的cDNA用于qRT-PCR試驗(yàn)。

1.2.3 SOD基因克隆及測(cè)序驗(yàn)證 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的非洲菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)基因特異性引物（上游引物序列為：ATGGCTCTTCGAACCCTAG，下游引物序列為 ：TTAAGGGCACTCTTTCTC）。25 μL PCR 反應(yīng)體系包括：Dream TaqTMGreen PCR Master Mix（2X）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL 和上下游引物各1 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用Gel/PCR Extraction Kit回收目的片段，連接到PMD 18-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，經(jīng)菌液PCR鑒定后選取陽(yáng)性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 參照郝向陽(yáng)等［24］的方法，利用在線軟件分析GjMnSOD蛋白基本理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以及保守結(jié)構(gòu)域。分別使用在線工具分析前導(dǎo)肽（https：//ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html）、蛋白保守基序（http：//meme-suite.org/）和三維結(jié)構(gòu)（https：//swissmodel.expasy.org/）。從 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并下載其他物種MnSODs的氨基酸序列，使用MEGE-X鄰近歸并法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 SOD基因表達(dá)分析 以稀釋50倍的cDNA為模板，以非洲菊18S rRNA為內(nèi)參基因，在Roche Lighcycler 480熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量分析。qRT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s；58℃退火30 s；72℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。qRT-PCR反應(yīng)體系包含SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）熒光染料 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物各 1 μL 和 cDNA 1 μL［24］。使用 2-△△CT法計(jì)算其不同處理下GjMnSOD相對(duì)表達(dá)量［26］。利用SPSS軟件分析不同樣品和處理間的差異顯著性，使用Excel 2016作圖。

2 結(jié)果

2.1 SOD基因克隆驗(yàn)證及序列分析結(jié)果

成功從非洲菊品種‘玲瓏’中克隆獲得了一條789 bp的基因序列（圖1）。序列分析結(jié)果顯示，該基因的CDS長(zhǎng)度為519 bp，預(yù)測(cè)可編碼172個(gè)氨基酸。BLASTn序列比對(duì)結(jié)果顯示該基因與其他物種MnSOD同源性較高。其中，與刺苞菜薊MnSOD基因序列同源性高達(dá)91.27%，與紫花苜蓿MnSOD基因序列同源性達(dá)90.45%，推測(cè)該基因是一個(gè)MnSOD基因（命名為：GjMnSOD，GenBank登錄號(hào)為 MH708534.1）。

圖1 cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis detection result of cDNA amplification products

2.2 GjMnSOD基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析

分析結(jié)果顯示：GjMnSOD的編碼蛋白為穩(wěn)定的親水蛋白，分子量為19 203.85，分子式為C862H1346N238O252S4，原子總數(shù)為2 702，不穩(wěn)定系數(shù)23.52，脂肪系數(shù)為82.79，等電點(diǎn)7.93；該蛋白由19種氨基酸組成，其中亮氨酸（Leu）和賴氨酸（Lys）含量最多，均占9.3%；其次為丙氨酸（Ala），占8.1%。含有帶正電荷殘基總數(shù)（Ary+Lys）20個(gè)和帶負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）19個(gè)。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白中僅有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)：酪氨酸（17thaa、19thaa），蘇氨酸（7thaa）和絲氨酸（18thaa）（圖2-A）。

GjMnSOD無跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽及線粒體前導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)，推測(cè)屬于非分泌性蛋白。通過分析其保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有SodA（位于1-164 aa間）和Sod-Fe-C（位于70-164 aa間）保守結(jié)構(gòu)域和非特異性保守結(jié)構(gòu)域PLN02471（位于1-160 aa間，圖2-B），屬于MnSOD家族。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示GjMnSOD主要定位于線粒體，與前人報(bào)道的植物MnSODs主要定位于線粒體或過氧化物酶體的結(jié)論相符。

圖2 GjMnSOD蛋白磷酸化位點(diǎn)及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.2 Prediction of GjMnSOD protein phosphorylation site and conserved domain

2.3 保守基序預(yù)測(cè)及蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

GjMnSOD二級(jí)結(jié)構(gòu)由44.19% 的α螺旋、30.18% 的無規(guī)則卷曲、8.14% 的β-轉(zhuǎn)角和16.86%的延伸片段構(gòu)成（圖3）。MEME預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，GjMnSOD包含11個(gè)保守基序（表1）。以擬南芥中錳超氧化物歧化酶的晶體結(jié)構(gòu)（與GjMnSOD相似度達(dá)78.70%）作為模板進(jìn)行SWISS-MODEL同源建模，發(fā)現(xiàn)該蛋白金屬結(jié)合位點(diǎn)為His4、His52、Asp141和 His145（圖4）。

圖4 GjMnSOD三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 4 Predicted tertiary structure of GjMnSOD

表1 GjMnSOD蛋白保守基序Table 1 GjMnSOD protein conserved motif

圖3 GjMnSOD二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 3 Prediction of secondary structure of GjMnSOD

2.4 GjMnSOD蛋白質(zhì)序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果（圖5）顯示，GjMnSOD與刺苞菜薊、紫花苜蓿及萵苣等植物的MnSODs相似度較高，且 C端序列更為保守。GjMnSOD在141-148位氨基酸之間含有一個(gè)MnSOD特征序列（DVWEHAYY），再次說明其屬于MnSOD。GjMnSOD與刺苞菜薊（Cynara cardunculus）MnSOD（XP_024979965.1）相似度最高，達(dá)93.86%。與紫花苜蓿、萵苣和向日葵MnSOD相似度也均高于92%，相似度分別為93.45%、92.58%和92.54%。進(jìn)化樹分析結(jié)果也顯示非洲菊GjMnSOD與刺苞菜薊（Cynara cardunculus）MnSOD（XP_024979965.1）親緣關(guān)系最近（圖6）。此外，非洲菊GjMnSOD與萵苣、向日葵、刺苞菜薊和黃花蒿等菊科植物MnSODs聚在一支，木薯、海欖雌和松蒿MnSODs聚為另一支。

圖5 不同植物MnSOD蛋白序列多重比對(duì)結(jié)果Fig. 5 Multiple alignment results of MnSOD proteins from different plants

圖6 非洲菊GjMnSOD與其他植物MnSOD系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 6 Phylogenetic tree of GjMnSOD in G. jamesonni and MnSOD proteins from other plants

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

在IAA、GA3和SA等3種激素處理下，GjMnSOD相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)（圖7-A-C）。其中，IAA處理后下調(diào)最為明顯，在處理初期相對(duì)表達(dá)量即極顯著降低，處理12 h時(shí)達(dá)到最低值；GA3處理后，GjMnSOD相對(duì)表達(dá)量顯著下降，24 h時(shí)有所回升但仍顯著低于對(duì)照；SA處理后，GjMnSOD相對(duì)表達(dá)大致呈逐步降低的趨勢(shì)，24 h時(shí)僅約為對(duì)照組1/3。

鹽脅迫處理下，GjMnSOD表達(dá)受到抑制，呈“降-升-降”趨勢(shì)，處理4 h后相對(duì)表達(dá)量降為對(duì)照的2/5，8 h時(shí)表達(dá)量有所回升，但仍顯著低于對(duì)照，之后表達(dá)量顯著下降，并于24 h時(shí)達(dá)到最低值（圖7-D）。

在30% PEG模擬干旱脅迫下，GjMnSOD相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出“先降后升”的趨勢(shì)。處理1 h和2 h時(shí)，表達(dá)量顯著低于對(duì)照，4 h時(shí)顯著高于對(duì)照，并于6 h時(shí)達(dá)到最大值，約為對(duì)照組2.3倍（圖7-E）。

4℃低溫處理下，GjMnSOD基因的表達(dá)受到極顯著抑制（P＜0.01），低溫處理后各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均不足對(duì)照組1/5（圖7-F）。

圖7 激素與非生物脅迫處理對(duì)GjMnSOD相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 7 Effects of hormone and abiotic stresses on the relative expression of GjMnSOD

3 討論

本研究成功從‘玲瓏’非洲菊克隆獲得了一個(gè)SOD基因，其編碼蛋白具有經(jīng)典MnSOD的特征序列及保守結(jié)構(gòu)域，與刺苞菜薊MnSOD相似度最高且親緣關(guān)系最近，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白定位于線粒體，由此推斷其屬于線粒體MnSOD（命名為GjMnSOD）。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)GjMnSOD的表達(dá)受多種激素和非生物脅迫處理影響顯著。

3.1 GjMnSOD的表達(dá)受激素影響顯著，可能在非洲菊激素穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用

研究表明，MnSOD基因的表達(dá)受激素含量和外源激素處理影響顯著［27］。如小麥CsMSD基因隨GA3處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)水平逐步升高，并于48 h時(shí)達(dá)到峰值［28］；芥菜 BjMnSOD 受 SA 顯著誘導(dǎo)［29］；在IAA、GA3和SA處理下，香蕉MaMSD的表達(dá)均隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而上調(diào)［30］。但也有一些MnSOD基因的表達(dá)受激素抑制，如番茄SlSOD7基因啟動(dòng)子區(qū)雖然含有SA應(yīng)答元件TCA-element，但在SA處理下表達(dá)水平明顯下調(diào)［13］；龍眼DlMSD的表達(dá)也受GA、IAA和SA顯著抑制［31］。本研究中，在IAA、GA3和SA等3種激素處理下，GjMnSOD基因的表達(dá)均顯著降低，暗示GjMnSOD在非洲菊激素穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。

3.2 GjMnSOD參與非洲菊對(duì)多種非生物脅迫的響應(yīng)

超氧化物歧化酶是一類金屬酶，MnSOD的表達(dá)受金屬離子影響顯著［14］。徐龍［32］的研究發(fā)現(xiàn)茄子SmMnSOD在0.15 mol/L NaCl處理6 h時(shí)的表達(dá)量約為對(duì)照的3.02倍。朱磊等［29］發(fā)現(xiàn)芥菜BjMnSOD的表達(dá)受150 mmol/L NaCl顯著誘導(dǎo)，處理36 h時(shí)表達(dá)量高達(dá)對(duì)照組的8.7倍。程華等［33］發(fā)現(xiàn)100 mmol/L NaCl處理后銀杏GbMnSOD的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量明顯提升，約為對(duì)照組3.5倍。而劉家林等［34］發(fā)現(xiàn)水稻OsSOD7受鹽脅迫影響并不顯著，說明MnSOD在不同植物響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮的作用可能不同。本研究發(fā)現(xiàn)，GjMnSOD受NaCl脅迫顯著抑制，在處理8 h時(shí)表達(dá)量有所回升，說明其參與非洲菊抗鹽反應(yīng)。

MnSOD與植物耐旱性息息相關(guān)［10］。研究發(fā)現(xiàn)不同植物MnSOD在干旱脅迫下的表達(dá)模式差異顯著。白三葉草MnSOD的表達(dá)在干旱脅迫12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值［35］。而茄子SmMnSOD受干旱（20% PEG）誘導(dǎo)表達(dá)不顯著，僅在48 h時(shí)略高于對(duì)照［36］。本研究發(fā)現(xiàn)，GjMnSOD在30% PEG模擬干旱處理4 h時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組，6 h時(shí)表達(dá)量進(jìn)一步升高，約為對(duì)照組的2.3倍，說明GjMnSOD在非洲菊遭受干旱脅迫4 h后表達(dá)量即出現(xiàn)顯著升高，從而在非洲菊抵御干旱過程中發(fā)揮重要作用。

MnSOD在植物抗寒反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。Li等［37］發(fā)現(xiàn)蓮花NnMSD1在低溫誘導(dǎo)過程中表達(dá)量顯著高于對(duì)照，于24 h時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照8.6倍。曾小玲等［38］發(fā)現(xiàn)菜心BclMSD在低溫處理下表達(dá)量呈“升-降”趨勢(shì)，處理6 h時(shí)在根中的表達(dá)量最高。而茄子SmMnSOD在低溫脅迫下表達(dá)量呈現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)，處理3 h時(shí)表達(dá)量?jī)H約為對(duì)照的20%［37］。苜蓿MtMSD基因在低溫脅迫24 h時(shí)的表達(dá)也受到顯著抑制［39］。本研究中，GjMnSOD的表達(dá)受低溫脅迫抑制顯著，與雋加香等［40］研究番茄線粒體中的SOD在低溫脅迫下的結(jié)果相一致。前人研究表明，MnSOD活性與線粒體呼吸鏈的電子傳遞密切相關(guān)［38］，由此推測(cè)低溫下非洲菊呼吸速率的降低可能是GjMnSOD基因表達(dá)被抑制的原因。

4 結(jié)論

本研究成功克隆獲得一個(gè)非洲菊線粒體錳超氧化物酶基因GjMnSOD。該基因的表達(dá)受IAA、GA3、SA、鹽脅迫和低溫顯著抑制，但受干旱顯著誘導(dǎo)，說明作為一個(gè)線粒體SOD基因，GjMnSOD參與非洲菊激素和逆境脅迫響應(yīng)，可能在非洲菊抵御干旱過程中發(fā)揮重要的正向調(diào)控作用。