李俊林 張煥朝 聶文婧 張海洋 王向譽 郭洪恩 韓蕾

（1. 山東省蠶業(yè)研究所，煙臺 264002；2. 南京林業(yè)大學，南京 210037；3. 魯東大學，煙臺 264025）

植物啟動子在基因的表達調(diào)控中起關鍵作用，基因表達的時空特異性、組織特異性和條件特異性主要取決于基因的啟動子。植物基因啟動子是重要的順式作用元件，能夠在轉(zhuǎn)錄水平上參與并調(diào)控下游相應基因表達，使植物能夠抵御外界各種環(huán)境脅迫［1-2］。因此，研究植物啟動子有助于了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達模式及其調(diào)控機制，并應用于基因工程中提高或改進外源目的基因的表達。

干旱條件下，植物體內(nèi)ABA水平升高，保衛(wèi)細胞中的離子從細胞質(zhì)膜運出，從而驅(qū)使氣孔關閉，減少蒸騰失水［3-4］。保衛(wèi)細胞外向整流鉀離子通道（guard cell outward rectifying K+channe，GORK）是擬南芥保衛(wèi)細胞唯一一個介導鉀離子外流的鉀離子通道，在氣孔關閉過程起重要作用［5-7］。擬南芥GORK在保衛(wèi)細胞、根及維管組織中表達，在轉(zhuǎn)錄水平上受干旱、鹽和冷脅迫誘導［8］。在保衛(wèi)細胞中，GORK的表達與分布對ABA不敏感，但其分布受細胞外鉀濃度影響［7-8］。但是，ABA對保衛(wèi)細胞外向整流鉀通道轉(zhuǎn)運鉀離子有直接調(diào)控作用［9］。GORK也可通過蛋白磷酸酶（PP2C-type protein phosphatase，PP2CA）介導的信號途徑增強擬南芥對ABA的敏感性，并對高鹽和滲透脅迫的相關機制起到了負調(diào)節(jié)作用［10］。GORK通道可以作為細胞代謝的“主開關”，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)K+穩(wěn)態(tài)以適應環(huán)境條件的變化，從而最大限度地發(fā)揮植物的適應潛力［11］。迄今為止，除了擬南芥GORK，Li等［12］曾報道蒙古沙冬青中一個與擬南芥GORK同源的外鉀離子通道AmGORK，該通道與擬南芥GORK電生理功能特征相似，但其體內(nèi)生理功能還未有報道。

蒙古沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）為豆科，沙冬青屬，是我國西北荒漠區(qū)特有的常綠旱生闊葉灌木，起源與第三紀，瀕危物種，國家三級保護植物［13-14］。常年生長在年降水量不足100 mm，年蒸發(fā)量大于3 000 mm的極端干旱環(huán)境中，是研究植物抗旱機制的很好材料［15］。

本研究從蒙古沙冬青中克隆了外向鉀離子通道AmGORK的啟動子序列，利用PlantCARE預測AmGORK啟動子順式作用元件。將AmGORKpro定向替換植物表達載體Cambia1301的CaMV35S啟動子，構(gòu)建重組載體Cambia1301-AmGORKpro-GUS，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入野生型擬南芥。組織化學染色和定量分析揭示該啟動子對干旱脅迫的響應特性，為深入研究該基因在水分及養(yǎng)分利用、光合作用、抗旱等過程的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

蒙古沙冬青（A. mongolicus）由甘肅民勤沙生植物園提供。擬南芥（Arabidopsis thaliana）哥倫比亞（Columbia）野生型和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101為海水農(nóng)業(yè)實驗室保存。大腸桿菌（Escherichia coli）Trans1-T1、Taq酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 利用CTAB法提取蒙古沙冬青幼嫩葉片基因組DNA，微量紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AmGORK基因5′側(cè)翼片段克隆 鑒于AmGORK啟動子序列未知，參考Liu等［16］的方法進行交錯式熱不對稱PCR法（thermal asymmetric interlaced PCR），以沙冬青基因組DNA為模板，根據(jù)前期已經(jīng)克隆得到的AmGORK序列，分別在其DNA序列ATG下游45、114和248 bp處設計3條反向引物GP1-3、GP1-2和GP1-1。為了增加PCR反應特異性，在GP1-2引物前添加一段隨機引物序列。合成4條隨機引物LAD1-1、LAD1-2、LAD1-3和LAD1-4以及1條引物AC1，具體序列見表1。

AmGORK的5′側(cè)翼片段的擴增由3輪PCR完成，第一輪PCR反應以沙冬青基因組DNA為模板，上游引物分別是4條隨機引物，下游引物是GP1-1；首輪PCR產(chǎn)物稀釋40倍后作為第二輪PCR反應模板，上游引物為AC1，下游引物為GP1-2；第二輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍后作為第三輪PCR反應模板，上游引物為AC1，下游引物為GP1-3。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將PCR條帶切膠回收，與pMD19-T載體連接，送華大基因測序。根據(jù)測序結(jié)果設計引物（GP2-1、GP2-2和GP2-3），用同樣方法進行PCR擴增，直到獲得需要大小的目的片段。

1.2.3 AmGORK啟動子的克隆及鑒定 根據(jù)上述測序得到的DNA拼接序列設計上游引物AmGORK-pro-F和下游引物AmGORK-pro-R（表1），并分別在引物5′端引入KpnⅠ和NcoⅠ酶切位點。

表1 試驗所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the experiment

以沙冬青基因組DNA為模板，用上述引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測。按照回收試劑盒說明書回收目的片段。獲得的目的片段和pEasy-blunt zero載體（TransGen Biotech）連接，并轉(zhuǎn)化Trans1-T1，涂在含氨芐的平板上，挑取菌斑做菌落PCR鑒定，初步確認為陽性克隆后，送華大公司測序。測序結(jié)果正確，含有AmGORK啟動子重組質(zhì)粒，保存待用。

1.2.4 AmGORK啟動子序列的特征分析 通過在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件預測分析［17］。

1.2.5 AmGORK啟動子植物表達載體的構(gòu)建 用KpnⅠ和NcoⅠ分別對上述測序正確的含有AmGORK啟動子重組質(zhì)粒和植物表達載體pCambia1301-GUS進行酶切、片段回收、純化、連接及陽性克隆鑒定（圖 1）。

圖1 表達載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction map of expression vector

1.2.6 AmGORK啟動子轉(zhuǎn)化擬南芥 根據(jù)農(nóng)桿菌介導的花序侵染法，將Cambia1301-AmGORKPro-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥。將收獲的T0代種子播種于含有50 mg/L潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基中，選取能夠長出綠色真葉，根系較長的抗性苗移栽到基質(zhì)中。

1.2.7 GUS組織化學染色 參考Han等［18］的方法，選取T3代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同組織置于GUS染色液中，37℃黑暗培養(yǎng)過夜，用梯度濃度酒精完全脫色，顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 AmGORK啟動子的克隆

AmGORK的5′側(cè)翼片段的擴增由3輪PCR完成（圖2-A），獲得約1 200 bp的序列。然后根據(jù)測得序列重新設計3條引物GP2-1、GP2-2和GP2-3（表1），繼續(xù)向5′側(cè)翼延伸（圖2-B）獲得500 bp左右的序列。將2次測得的序列拼接，刪除中間重復片段，得到長度為1 723 bp的序列，命名為AmGORKpro。

圖2 AmGORK啟動子序列的擴增Fig. 2 Amplification of AmGORK promoter sequence

根據(jù)上述拼接序列設計上游引物AmGORK-pro-F和下游引物AmGORK-pro-R，分別在引物5′端引入KpnⅠ和NcoⅠ酶切位點。以沙冬青基因組DNA為模板，進行PCR擴增（圖2-C），得到2條約1 700 bp的特異條帶。將上述片段與pEasy-blunt zero載體（TransGen Biotech）連接，轉(zhuǎn)化Trans1-T1，進行菌落PCR鑒定，初步確認為陽性克隆后測序。將測序結(jié)果正確含有AmGORKpro的重組質(zhì)粒保存待用。

2.2 AmGORK啟動子序列功能預測分析

利用在線數(shù)據(jù)庫PlantCARE對AmGORK啟動子序列的結(jié)構(gòu)特征及重要的順式作用元件進行分析。結(jié)果（表2）顯示，AmGORK啟動子序列包含典型的TATA-box及CAAT-box。此外，還包含ABA響應元件ABRE、赤霉素響應元件GARE、干旱誘導元件MBS、低溫響應元件LTR等各1個，及多個光響應元件。表明AmGORK可能受到干旱、低溫等非生物脅迫或光信號的調(diào)控。

表2 AmGORK啟動子序列預測分析Table 2 Prediction analysis of AmGORK promoter sequence

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的鑒定

根據(jù)農(nóng)桿菌介導的花序侵染法，將Cambia1301-AmGORKPro-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥。將收獲的T0代種子播種于含有潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基中，提取能夠長出綠色真葉，根系較長的抗性苗基因組DNA，進行PCR檢測（圖3），抗性植株的PCR產(chǎn)物與目的條帶大小一致。初步證明目的基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥中。按照上述方法獲得T3代純合轉(zhuǎn)基因株系。

圖3 轉(zhuǎn)AmGORK擬南芥PCR鑒定結(jié)果Fig. 3 PCR validation of AmGORK transgenic A. thaliana

2.4 AmGORK啟動子的組織表達特異性

構(gòu)建了Cambia1301-AmGORKpro-GUS植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導，將該表達載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，觀測轉(zhuǎn)基因陽性植株GUS的表達情況（圖4），轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片葉柄、葉脈、保衛(wèi)細胞和莖均有明顯的藍色GUS染色信號，表明AmGORK的表達在整個發(fā)育階段具有連續(xù)性。除了葉片，在主根中柱和花萼也有GUS的表達，表明AmGORK的表達具有組織特異性，并且主要在輸導組織中表達。

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥中AmGORK啟動子活性分析Fig.4 Activity analysis of AmGORK promoter in transgenic A. thaliana

2.5 逆境脅迫對轉(zhuǎn)基因幼苗AmGORK啟動子活性的影響

為了研究非生物脅迫對擬南芥中AmGORK啟動子活性的影響，對轉(zhuǎn)AmGORK啟動子的擬南芥進行PEG或ABA處理。定量表達分析顯示，PEG處理24 h后，轉(zhuǎn)基因植株葉片的GUS表達為對照的3.2倍，ABA處理24 h后，轉(zhuǎn)基因植株葉片的GUS表達為對照的4.1倍（圖5）。以上結(jié)果表明，AmGORK啟動子活性受PEG或ABA誘導。

圖5 不同處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中GUS的表達分析Fig. 5 Expression analysis of GUS gene in the transgenic A. thaliana leaves under different treatments

3 討論

啟動子位于基因上游，被RNA聚合酶特異性識別并結(jié)合的一段DNA序列，在轉(zhuǎn)錄水平，對基因的表達起調(diào)控作用。啟動子核心區(qū)域一般包括TATA-box和CAAT-box等模塊，這也是啟動子的特征序列［19-20］。本研究通過生物信息學對克隆的AmGORKpro序列進行分析，發(fā)現(xiàn)該序列含有多個TATA-box和CAAT-box，說明該序列具有典型的啟動子特征。除了這些核心特征序列外，啟動子中還有很多特異的順式作用元件和非生物脅迫響應元件［21-22］。研究結(jié)果顯示，AmGORK啟動子序列內(nèi)包含干旱響應相關元件、激素響應元件和光響應元件等。啟動子區(qū)域的干旱誘導響應元件、ABA響應元件和水楊酸響應元件與基因參與的逆境響應和對應激素信號轉(zhuǎn)導有關，而ABA和水楊酸介導植物對外界環(huán)境的響應［23-25］。

擬南芥中2個外向型鉀離子通道分別為中柱鉀離子外向整流通道（stelar K+outward rectifier channel，SKOR）和GORK，SKOR主要在根中柱鞘和中柱薄壁細胞中表達［26］。GORK主要在保衛(wèi)細胞中表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)其在根、葉、花和花粉中都有表達［6，8］。本研究結(jié)果顯示，AmGORK組織定位模式與擬南芥GORK基本一致，都在根中柱、葉脈、葉柄等輸導組織中表達。輸導組織是植物體中擔負物質(zhì)長途運輸?shù)闹饕M織，根從土壤中吸收的水分和無機鹽分，由輸導組織運送到地上各個部位。植物組織間的物質(zhì)重新分配和轉(zhuǎn)移，也要通過輸導組織來進行。AmGORK在輸導組織中表達，推測其可能參與植物水分或養(yǎng)分運輸與再分配過程。此外，AmGORK啟動子還存在數(shù)個“TAAAG”元件，這些元件能夠驅(qū)動馬鈴薯鉀通道KST1在保衛(wèi)細胞中特異性表達［27］，同時，AmGORK在保衛(wèi)細胞中有強烈的GUS信號，表明AmGORK可能參與保衛(wèi)細胞運動過程。植物遭遇干旱脅迫時，體內(nèi)ABA含量提高，ABA通過激活保衛(wèi)細胞內(nèi)Ca2+、K+及陰離子通道，使保衛(wèi)細胞內(nèi)離子外流，減少保衛(wèi)細胞滲透壓，導致氣孔關閉，從而適應水分虧缺［28-29］。蒙古沙冬青幼苗受到PEG模擬水分脅迫及ABA處理2 d后，都能引起AmGORK表達上調(diào)［12］，有報道顯示，擬南芥外向整流鉀離子通道AtGORK受到干旱脅迫時，表達量也上調(diào)［8］，表明AmGORK可能參與干旱脅迫引起氣孔關閉過程。

4 結(jié)論

本研究克隆并鑒定一個沙冬青外向鉀離子通道AmGORK的啟動子，該啟動子可以驅(qū)動外源基因在植物葉片葉脈、葉柄、氣孔、根系中柱和花萼中表達，且主要集中于葉脈、葉柄和根系的輸導組織。AmGORK啟動子活性受PEG和ABA誘導。