方丹丹 張婷 文曉鵬

（1. 貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院 生命科學學院 山地植物資源保護與保護種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室 貴陽 550025；2. 貴陽學院生物與環(huán)境工程學院 貴州省山地珍稀動物與經(jīng)濟昆蟲重點實驗室，貴陽 550005）

磷元素是植物生長發(fā)育過程中不可或缺的營養(yǎng)元素之一，是促進植物生長發(fā)育的重要元素，但土壤對磷元素有著強烈的吸附作用。土壤溶液中的無機磷酸鹽作為植物磷的主要來源，大多是以沉淀的形式存在于土壤環(huán)境中；同時可以與土壤溶液中的陽離子形成絡(luò)合物，導致土壤環(huán)境中的有機磷不能直接被植物吸收利用［1］。植株在低磷脅迫環(huán)境中會通過根系向土壤中排放其分泌物，進而活化土壤中的無機、有機磷，以及接收缺磷的信號來誘導表達磷轉(zhuǎn)運蛋白基因［2-4］。多項研究表明，植物在響應(yīng)低磷脅迫的過程中，磷轉(zhuǎn)運蛋白（Phosphorus Transporter，PT）會被高效誘導表達，而正常供磷環(huán)境下該蛋白反被抑制［5-9］。在低磷脅迫條件下，蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）PT1家族中的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因MtPT5和MtPT6下可以促進有效磷向根瘤運輸，使根瘤中保持磷平衡［10］。Xu等［11］從玉米（Zea Mays）中分離出ZmPt9，過表達擬南芥后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥具有小葉子和早開花的現(xiàn)象。Naureen等［12］借助VIGS介導的基因瞬時沉默的技術(shù)方法，對番茄（Solanum lycopersicum）中的SlPT1基因的沉默導致番茄植株在低磷脅迫的條件下保護酶類活性顯著下降。在磷素吸收與轉(zhuǎn)運分配過程中，對杉木（Cunninghamia lanceolata）中的磷酸轉(zhuǎn)運蛋白PHT1家族中的ClPht1基因進行同源轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)，該基因參與杉木地下部分和地上部分磷素的運輸和分配［13］。雙子葉植物紫云英（Astragalus sinicus）中磷轉(zhuǎn)運蛋白AsPT5基因?qū)υ鰪娖渲仓瓯旧砀祵α姿猁}的吸收起著關(guān)鍵性的作用［14］。由此可知，磷轉(zhuǎn)運蛋白（PHT）在植物吸收磷酸鹽中具有重要作用。然而，木本植物中的PHT家族基因在其他植物中賦予植物生長的作用還有待探索。馬尾松（Pinus massoniana）是我國松屬類分布最廣的針葉樹種，是擁有多方面用途的用材林，同時支撐著我國森林文化、醫(yī)療保健和化工業(yè)等多個行業(yè)，被冠名為“高附加值林產(chǎn)品的經(jīng)濟樹種”［15］。在我國部分缺磷嚴重的地區(qū)，馬尾松經(jīng)歷長期的地理隔離、生殖隔離和自然選擇，致使其種內(nèi)產(chǎn)生遺傳變異現(xiàn)象，在低磷環(huán)境下展現(xiàn)出良好的適應(yīng)生存能力。前期研究發(fā)現(xiàn)通過對馬尾松在低磷脅迫下的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的效應(yīng)，其中磷轉(zhuǎn)運蛋白基因在低磷脅迫環(huán)境下具有良好的作用機制［5］。因此，進行相關(guān)植株遺傳轉(zhuǎn)化可以分析其潛在的應(yīng)用價值。本研究通過采用花序浸染法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，探討在低磷脅迫條件下馬尾松高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白PmPT3基因在草本植物擬南芥中耐低磷脅迫的能力，可為林木優(yōu)良基因的利用及創(chuàng)制耐低磷新種質(zhì)提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

生態(tài)型哥倫比亞擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子，馬尾松PmPT3基因（GenBank注冊號為KT390744）由本實驗前期克隆并注冊，農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株、植物表達載體pBWA（V）HS由貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院保存。

1.2 方法

1.2.1 PmPT3基因擴增及純化 根據(jù)馬尾松PmPT3基因序列與pBWA（V）HS質(zhì)粒上原有的限制性內(nèi)切酶酶切位點，利用軟件Primer5設(shè)計特異性正反引物，并在引物5′端插入Ase I和Bsa I的酶切位點及保護堿基，所獲得的克隆正反引物序列見表1，用該引物對馬尾松cDNA模板進行擴增，反應(yīng)總體系為 10 μL，包括 PreMix 5 μL，正反引物各 0.5 μL，模板 1 μL，ddH2O 3 μL。PCR 反應(yīng)程序 ：94℃預變性5 min；94℃變性30 s；50℃退火45 s；72℃延伸90 s；30個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，回收純化，保存在-20℃冰箱中備用。

1.2.2 植物表達載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 將回收產(chǎn)物連接到BLUNT載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α 37℃培養(yǎng)過夜，篩選陽性菌落進行測序，提取質(zhì)粒備用。分別用限制性內(nèi)切酶Ase I和Bsa I對含有PmPT3基因和pBWA（V）HS載體質(zhì)粒進行雙酶切，回收PmPT3和pBWA（V）HS兩個目的片段。用T4連接酶將目的片段產(chǎn)物進行過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α細胞，PCR鑒定陽性克隆，獲得重組質(zhì)粒后命名為pBWA（V）HSPmPT3。用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，并進行陽性檢測。

1.2.3 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及陽性植株鑒定 將攜帶pBWA（V）HS-PmPT3超表達載體的農(nóng)桿菌于液體培養(yǎng)基中活化過夜培養(yǎng)，用15%蔗糖溶液懸浮離心2次后將農(nóng)桿菌重懸于20 mL滲透液（15%蔗糖+20 μL Silwet-77，OD600=1.0-1.2）中，將提前澆足水的擬南芥上的果莢和完全開放的花剪除，將滲透液充分搖勻后浸泡擬南芥花絮1 min，幼嫩的枝條花絮浸染30 s，同時輕微震蕩。浸染后暗培養(yǎng)36 h，然后置于正常培養(yǎng)1周左右方可澆水，并定期繼續(xù)浸染2-3次，培養(yǎng)至種子成熟備用。將收集到的種子培養(yǎng)于MS+20 mg/L Hyg（潮霉素B）+100 mg/L Cep（頭孢）的固體培養(yǎng)基上進行篩選，pH=5.8，篩選得到T0代植株后，分株收獲T1代轉(zhuǎn)基因種子。按照上步方法篩選T1代轉(zhuǎn)基因種子，根據(jù)孟德爾遺傳定律挑選符合3∶1分離比的T2代苗，分株收獲T2代轉(zhuǎn)基因種子，經(jīng)篩選培養(yǎng)最終得到T3代轉(zhuǎn)基因種子，培養(yǎng)T3代轉(zhuǎn)基因苗進行后續(xù)實驗。

1.2.4 低磷脅迫處理及相關(guān)生理生化指標的測定 將擬南芥野生型和篩選得到的T3代轉(zhuǎn)基因種子分別在MS條件下春化處理4 d，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，挑選長勢一致的擬南芥野生型和轉(zhuǎn)基因植株，分別移植到低磷（LP，0.125 mmol/L）、對照（MS，1.25 mmol/L）2個供磷水平的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后，觀察葉片、根系的形態(tài)變化，測定相關(guān)生理生化指標：地上和地下部分的干重，總磷和無機磷含量，丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性（測量方法參照購于索萊寶生物科技有限公司的試劑盒）。每項生理生化指標重復測定3次。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥PmPT3基因表達分析 提取轉(zhuǎn)基因擬南芥地上部分和根部的RNA，并進行cDNA第一鏈合成。之后進行PmPT3基因的qRT-PCR表達分析，Actin2為內(nèi)參基因［9］，所用引物名稱及基因特異性引物序列見表1。熒光定量反應(yīng)體系為10 μL ：SYBR? Green Master Mix 5.0 μL、ddH2O 4.0 μL、正反向引物各0.25 μL、模板cDNA 0.5 μL。擴增程序 ：95℃ 10 min；95℃ 15 s；59℃ 30 s；72℃ 60 s；40個循環(huán)。

表1 實驗所用引物及序列Table 1 Primers and sequences used in the study

2 結(jié)果

2.1 植物表達載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

cDNA模板PCR擴增后進行回收（圖1-A），將目的基因條帶連接BLUNT載體，測序拼接結(jié)果與PmPT3基因的ORF一致。進行雙酶切后，酶切產(chǎn)物凝膠電泳檢測（圖1-B，圖1-C），獲得大小兩個條帶，小條帶的大小在1 700 bp-1 800 bp之間，目的基因序列大小處于該區(qū)間內(nèi)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α細胞，獲得重組質(zhì)粒pBWA（V）HS-PmPT3，條帶大小符合（圖1-D）。向農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞加入重組質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化后，菌落PCR及凝膠電泳檢測（圖1-E），經(jīng)過比對與目的基因條帶相符，進而說明農(nóng)桿菌中已成功轉(zhuǎn)入pBWA（V）HSPmPT3質(zhì)粒，植物表達載體構(gòu)建成功。

圖1 馬尾松PmPT3基因植物表達載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of plant expression vector of P. massoniana PmPT3 Gene

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得及表達分析

采用花序浸染法，遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥（圖2），共獲得T1代擬南芥抗性植株27株，分別提取這27株擬南芥的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PmPT3基因的qRT-PCR表達分析，分析結(jié)果顯示27株株系中11號表達量最高，5號次之（圖3-A）。通過繼續(xù)篩選共獲得4株T3代純合株系，其馬尾松PmPT3基因表達量最高（圖3-B），進行磷處理后，葉片、根系的形態(tài)變化如圖2-G和圖2-F。

圖2 馬尾松PmPT3遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥過程Fig.2 Process of genetic transformation of P. massoniana PmPT3 into Arabidopsis

圖3 T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥qRT-PCR分析（A）及純合株系PCR檢測（B）Fig.3 Analysis of positive gene expression in T1 generation transgenic Arabidopsis thaliana (A) and PCR detection of homozygous strains (B)

2.3 低磷脅迫對酶活性與丙二醛含量的影響

在正常供磷條件下，擬南芥野生型和轉(zhuǎn)基因植株過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量差異不顯著，在低磷條件下轉(zhuǎn)基因植株的POD、SOD、CAT酶活性均高于野生型植株，分別是野生型植株的2.17倍（圖4-A）、1.59倍（圖4-B）、1.81倍（圖4-C）；MDA含量都增加，但野生型植株MDA含量極顯著高于轉(zhuǎn)基因植株，是轉(zhuǎn)基因植株的2.10倍（P＜0.05，圖4-D）。分析結(jié)果表明，在低磷脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥中馬尾松PmPT3基因的超表達有效的增強了植株保護酶活性，降低了丙二醛含量，進而增強了擬南芥耐低磷脅迫的能力。

圖4 低磷脅迫對轉(zhuǎn)基因擬南芥POD（A）、SOD（B）、CAT（C）活性及MDA（D）含量的影響Fig.4 Effect of low phosphorus stress on the POD(A), SOD(B), CAT(C) activity and MDA(D) content of transgenic Arabidopsis

2.4 低磷脅迫對磷含量的影響

在正常供磷條件下，地上部分及根部總磷含量和無機磷含量無顯著性差異。低磷脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的地上部分和根部總磷含量較野生型相比，分別提高了1.26倍和1.74倍（圖5-A），無機磷含量較野生型相比分別提高了1.38倍和1.89倍（圖5-B）。表明在低磷脅迫條件下PmPT3基因的超表達對擬南芥磷素吸收利用的能力有提高作用。

圖5 低磷脅迫對轉(zhuǎn)基因擬南芥總磷含量（A）和無機磷含量（B）的影響Fig.5 Effect of low phosphorus stress on the total phosphorus content (A) and inorganic phosphorus content (B) of transgenic Arabidopsis

2.5 低磷脅迫對生物量的影響

在正常供磷條件下，地上部干重、根干重和總干重都無顯著差異，但在低磷脅迫條件下都表現(xiàn)出極顯著的差異，其中轉(zhuǎn)基因植株較野生型地上部干重增加了45.46%，根干重增加了55.56%，總干重增加了46.15%（圖6）。根冠比都大于正常供磷條件下的擬南芥，表明低磷脅迫對植株地下部分的抑制作用可能小于地上部分。

圖6 低磷脅迫對轉(zhuǎn)基因擬南芥地上部干重（A）、根干重（B）、總干重（C）和根冠比（D）的影響Fig.6 Effect of low phosphorus stress on the above-ground dry weight (A), root dry weight (B), total dry weight (C) and root to shoot ratio (D) of transgenic Arabidopsis

2.6 低磷脅迫對轉(zhuǎn)基因擬南芥PmPT3基因表達量的影響

無論是正常供磷條件下，還是低磷脅迫條件下，根部及地上部分PmPT3基因表達量都表現(xiàn)為極顯著性差異（圖7）。與正常供磷相比，低磷脅迫下PmPT3基因相對表達量在根部及地上部分的相對表達量顯著提高，且在根部相對表達量最高，這說明該基因主要在植株的根部發(fā)揮作用。

圖7 磷處理后馬尾松PmPT3基因相對表達量Fig.7 Relative expression of PmPT3 gene of P. massoniana after phosphorus treatment

3 討論

磷是植物生長發(fā)育所需的重要常量元素，根系從土壤中吸收磷是植物獲取磷的主要途徑。當植物在面對低磷脅迫的過程中，植株本身不僅在發(fā)育、形態(tài)、生理和生化等方面形成復雜的機制來應(yīng)對低磷脅迫，同時在植物基因水平也發(fā)揮著不同的作用，以此來適應(yīng)各種逆境和脅迫帶來的不良影響［16］。當植物生長在低磷脅迫環(huán)境中時，植物體內(nèi)的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因?qū)l(fā)揮作用，其中PHT1基因家族是調(diào)節(jié)磷轉(zhuǎn)運非常重要的高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因，是植株細胞膜進行吸收和轉(zhuǎn)運土壤中無機磷的重要轉(zhuǎn)運蛋白［17］。

本研究中，進行低磷脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的地上部分和根部總磷含量及無機磷含量都顯著提高，說明PmPT3基因的超表達可能增加了擬南芥對磷的吸收。對其他植物中同類基因的研究也有報道，例如，番茄植株在供磷水平低的條件下，SlPT1基因如果保持沉默，則會導致植株磷含量顯著降低［18］。在橡膠樹中，HbPHT1基因表達量的增加改善了植株磷的吸收、轉(zhuǎn)運和利用［19］。有研究發(fā)現(xiàn)白羽扇豆中的LaPT1基因，在低磷脅迫環(huán)境中，獲得高效表達，特別是在根中［20］。馬鈴薯進行低磷處理后，磷轉(zhuǎn)運蛋白StPHT1基因獲得了過表達，根部的表達量高于莖和葉，這說明在低磷環(huán)境下，根部中StPHT1的依賴性可能大于莖與葉［21］。本研究中，低磷脅迫下PmPT3基因相對表達量在根部及地上部分的相對表達量顯著提高，且在根部相對表達量最高，與其他物種中的情況相似。

另外有研究表明，在植株處于非生物脅迫條件下，細胞會產(chǎn)生一系列活性氧簇來打破細胞內(nèi)自由基平衡，提高細胞膜透性，作為植物細胞抵御逆境的保護性酶類POD、SOD、CAT會明顯上升，以此來消除植物細胞內(nèi)多余的活性氧，進而來減弱低磷脅迫對植物細胞膜系統(tǒng)、蛋白質(zhì)和核酸造成的損傷，達到保護植物的作用［22-24］。清除活性氧自由基的關(guān)鍵酶SOD、POD和CAT，以及MDA的含量都能間接地反映細胞膜脂的過氧化程度，可反映植物耐逆境的能力［25］。在本研究中，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在低磷脅迫下SOD、POD、CAT活性較野生型顯著升高，MDA含量顯著降低。有研究表明，將馬鈴薯磷酸轉(zhuǎn)運蛋白StPht1-1基因過表達楊樹P39后生物量獲得顯著增加［26］。本研究中，擬南芥生物量的變化表明，PmPT3基因的超表達提高了擬南芥生物量的積累，與馬尾松Pht1家族中的基因在煙草中的結(jié)果相似［5］。

4 結(jié)論

馬尾松PmPT3基因的超表達提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥保護酶活性，降低了丙二醛含量，增加了磷含量和生物量的積累，進而顯著提高了擬南芥耐低磷脅迫的能力。