劉李林 曹紅娣,2 綜述 楊俊偉,2 審校

常染色體顯性遺傳性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)是以雙側(cè)腎臟囊腫進(jìn)行性增長為主要特征的最常見的遺傳性腎臟病,是終末期腎臟病的重要病因之一。ADPKD的人群發(fā)病率在1:400[1]～1:1000[2],而基于大型基因測序數(shù)據(jù)庫的預(yù)估模型[3]和梅奧診所開展的流行病學(xué)研究[4]顯示,ADPKD是一種患病率被嚴(yán)重低估的遺傳病。ADPKD的治療以基礎(chǔ)治療為主,在近年開展的臨床藥物驗證中,僅托伐普坦能有效減緩各期ADPKD的疾病進(jìn)展,其他大部分以失敗告終。因此,ADPKD的發(fā)病機(jī)制研究對治療靶點的挖掘具有重要意義。

根據(jù)經(jīng)典的纖毛中心假說,定位在16p13.3的Pkd1(85%～90%病例)和4q21的Pkd2(10%～15%病例)基因發(fā)生突變,腎小管上皮細(xì)胞中初級纖毛上的多囊蛋白1(polycystin 1, PC1)、PC2出現(xiàn)蛋白缺失,引起細(xì)胞鈣離子內(nèi)流減少及G蛋白信號高度活化,激活環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)-蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)下游增殖信號通路[5],其中的關(guān)鍵信號分子在能量代謝相關(guān)通路中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。相當(dāng)數(shù)量的研究證實ADPKD中存在明顯的能量代謝改變,因此,作為富有前景的治療方向,本文對ADPKD的能量代謝改變研究進(jìn)展作一綜述。

ADPKD的能量代謝特征

有氧糖酵解增加糖酵解是一種高效供能方式,多見于低氧狀態(tài)。在常氧環(huán)境中,僅部分能量需求極高的組織細(xì)胞以糖酵解作為主要產(chǎn)能方式,如腦細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。ADPKD腎組織中存在有氧糖酵解的能量利用傾向,類似腫瘤的Warburg效應(yīng)[6]。

2013年,Rowe等[7]首先在體內(nèi)外實驗中發(fā)現(xiàn),與對照細(xì)胞相比,Pkd1-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)的ATP水平更高、葡萄糖消耗更顯著、乳酸生成更多,糖酵解相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平也存在明顯上調(diào)。后續(xù)在多囊腎小型豬等其他模型中的研究也觀察到類似現(xiàn)象[8]。使用13C標(biāo)記的葡萄糖進(jìn)行示蹤處理,Pkd1-/-細(xì)胞與對照細(xì)胞相比吸收了更多的葡萄糖,并將其轉(zhuǎn)化為乳酸,而三羧酸循環(huán)的主要中間產(chǎn)物琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸的13C標(biāo)記低于對照細(xì)胞[9],進(jìn)一步證實有氧糖酵解替代氧化磷酸化成為Pkd1-/-細(xì)胞主要的能量來源。葡萄糖剝奪實驗[10]或使用己糖激酶抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)治療[7,11-12],能夠明顯減輕ADPKD動物模型的囊腫表型。與動物實驗結(jié)果一致,ADPKD患者的腎囊腫液中存在高水平的乳酸。人類Pkd1腎囊腫基因數(shù)據(jù)庫顯示,編碼糖異生關(guān)鍵酶的基因被下調(diào),糖酵解相關(guān)基因被上調(diào),這表明人類ADPKD患者中也存在糖酵解增強的特征[7]。

ADPKD細(xì)胞內(nèi)鈣離子減少,cAMP-PKA以Src/Ras/B-Raf依賴的途徑激活絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)。一方面,ERK直接上調(diào)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白敏感型復(fù)合體1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1);另一方面,ERK磷酸化肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1),影響LKB1結(jié)合腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK),從而抑制AMPK活性,上調(diào)mTORC1-缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α)-糖酵解級聯(lián)信號[7]。使用mTOR抑制劑雷帕霉素及AMPK間接激動劑二甲雙胍[12]、根皮苷(非選擇性鈉糖共轉(zhuǎn)運體抑制劑)[13]和AMPK直接激動劑雙水楊酸酯[14]治療ADPKD動物,能夠顯著減輕囊腫負(fù)荷。ADPKD腎囊腫上皮細(xì)胞分泌的巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)也能夠激活ERK、mTOR信號,促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖和產(chǎn)生ATP。MIF抑制劑ISO-1能夠下調(diào)Pkd1fl/flKsp-Cre小鼠和Pkd1fl/flPkhd1-Cre小鼠中糖酵解關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄水平,減少體內(nèi)葡萄糖攝取和ATP水平[15]。

脂代謝障礙脂肪酸β氧化是正常腎組織氧化磷酸化的首選能源,其產(chǎn)生的ATP是葡萄糖氧化的3倍,但受到重要限速酶肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I(carnitine palmitoyl transferase 1, CPT1)的影響,產(chǎn)能速率不高。在ADPKD高耗能增殖的背景下,脂肪酸氧化、利用出現(xiàn)障礙。

對ADPKD男性患者和正常男性腎組織的代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)對比分析發(fā)現(xiàn),ADPKD患者的腎臟具有獨特的代謝譜,其中二?；视偷淖兓哂酗@著的統(tǒng)計學(xué)差異;研究者進(jìn)一步使用細(xì)胞能量代謝分析儀對Pkd1敲除的5種不同的小管上皮細(xì)胞系進(jìn)行耗氧率(macrophage migration inhibitory factor,OCR)測定,顯示脂肪酸氧化存在缺陷;且Pkd1敲除小鼠飲食中的脂質(zhì)含量與囊腫病變的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[16]。

在Pkd1敲除小鼠中,c-Myc促進(jìn)miR-17表達(dá),下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor α,PPARα)及其靶基因,導(dǎo)致脂肪酸氧化障礙,影響線粒體功能;而miR-17～92缺失在多種ADPKD模型中都能改善線粒體和代謝相關(guān)基因的表達(dá),并降低細(xì)胞增殖標(biāo)志物磷酸化組蛋白H3。該研究中PPARα的下調(diào)結(jié)果與人類ADPKD微陣列數(shù)據(jù)的分析結(jié)果一致[17]。使用PPARα激動劑非諾貝特治療Pkd1RC/RC小鼠5個月,治療組的腎臟體積、囊腫體積、腎重體重比、囊腫指數(shù)和血清肌酐水平均顯著低于對照組[18]。皮下注射miR-17抑制劑RGLS4326也在多種PKD小鼠模型中減緩了囊腫的生長,表現(xiàn)出良好的臨床前安全性[19]。

此外,在低碳水飲食背景下,通過急性禁食誘導(dǎo)酮癥狀態(tài),能夠觀察到Han:SPRD大鼠中囊腫負(fù)荷和纖維化的明顯改善;即使在高碳水飲食背景下,直接補充外源性酮體也能觀察到該現(xiàn)象,提示ADPKD缺乏能量轉(zhuǎn)換的靈活性,但限制葡萄糖并非必要條件,補充外源性酮體β-羥丁酸鹽(β-hydroxybutyrate,BHB)才是抑制囊腫的關(guān)鍵[20]。研究者推測其中可能的機(jī)制有:(1)BHB替代琥珀酰CoA和增加琥珀酸游離池,從而改善TCA循環(huán),提高線粒體效率;(2)BHB直接影響mTOR、AMPK和組蛋白去乙酰化等參與PKD進(jìn)展的生物過程;(3)BHB與G蛋白偶聯(lián)受體Gpr109a結(jié)合,抑制cAMP信號。另一方面,酮癥狀態(tài)下游離脂肪酸增加,但由于ADPKD細(xì)胞脂肪酸氧化利用障礙,引起脂滴沉積,導(dǎo)致脂毒性甚至細(xì)胞死亡。

值得注意的是,個別脂代謝研究中未見囊性腎臟的乳酸水平升高及糖酵解活性增強,研究者分析認(rèn)為不排除細(xì)胞背景或永生化方式不同的原因,此外,細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)不同也可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。同時,增強的脂肪酸從頭合成也是ADPKD的重要特征[9],其可能與異常增殖過程中細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層涉及大量的脂質(zhì)合成有關(guān),這一過程可能消耗了有氧糖酵解產(chǎn)生的ATP。

氨基酸代謝上調(diào)谷氨酰胺代謝是細(xì)胞重要的碳、氮來源,能夠為細(xì)胞生物合成提供ATP以及大分子物質(zhì)合成過程的中間體,在腫瘤細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用[21]。因此,谷氨酰胺代謝在ADPKD能量代謝研究中也受到關(guān)注。

ADPKD的線粒體異常

線粒體是能量代謝的核心場所[23],ADPKD存在顯著的線粒體形態(tài)和功能障礙。ADPKD動物模型腎臟中線粒體膜電位發(fā)生改變,超微結(jié)構(gòu)電子顯微鏡觀察到線粒體明顯腫脹和網(wǎng)格碎片化增多,同時線粒體DNA拷貝數(shù)在早期即明顯降低[24]。蛋白組學(xué)研究顯示ADPKD中參與調(diào)節(jié)氧化還原酶活性和電子傳遞鏈的蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào),其中三分之一定位在線粒體上;免疫熒光染色顯示ADPKD患者及小鼠細(xì)胞中存在明顯的活性氧(reactive oxygen species,ROS)聚積,表明存在顯著的氧化應(yīng)激[25]。

PC1、PC2在線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria associated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)上也有定位,能夠直接或間接調(diào)節(jié)線粒體功能[26]。PC1在MAMs上的定位受到氧濃度的影響,低氧狀態(tài)下,脯氨酸羥化酶活性受到抑制,PC1從MAMs向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)移減少,減少了PC2依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放和線粒體Ca2+攝取[27]。PC1是一種非典型的G蛋白偶聯(lián)受體[28],能夠在G蛋白偶聯(lián)受體蛋白水解位點裂解,裂解片段細(xì)胞質(zhì)尾巴(cytoplasmic tail,CTT)向線粒體基質(zhì)的移位可恢復(fù)線粒體的完整性,并在細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用[29-30]。而PC2能夠調(diào)節(jié)其他鈣離子通道蛋白的表達(dá),敲除PC2增加線粒體外膜融合蛋白2(mitochondrial fusion protein 2,MFN2)表達(dá),增強線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連接,提高線粒體鈣離子內(nèi)流信號,激活生物能,增加線粒體密度,增強氧化代謝能力,促進(jìn)細(xì)胞增殖[31]。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+減少使鈣調(diào)磷酸酶、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)失活,降低過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1α)表達(dá),導(dǎo)致氧化應(yīng)激,增加線粒體超氧化物的產(chǎn)生,從而上調(diào)囊腫上皮細(xì)胞中的ERK/MAPK信號[24]。線粒體功能障礙改變乙酰CoA的氧化還原狀態(tài),導(dǎo)致組蛋白乙?；?、基因表達(dá)、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和對細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的變化,從而促進(jìn)囊腫生長和腎臟纖維化[32]。線粒體抗氧化劑谷胱甘肽、輔酶Q[33],以及核因子NF-E2相關(guān)因子的降解抑制劑SFN和TDZD-8[25]均能降低氧化應(yīng)激,減少ROS,抑制囊腫上皮細(xì)胞增殖。

基于能量代謝的治療靶點

ADPKD的發(fā)病機(jī)制以多囊蛋白缺失導(dǎo)致的鈣信號失調(diào)和cAMP堆積為核心內(nèi)容,能量代謝改變和細(xì)胞異常增殖是其下游兩條并行但互相影響的路徑,主要表現(xiàn)為能量感應(yīng)器AMPK與mTOR信號之間的串?dāng)_。AMPK能夠磷酸化結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2(tuberous sclerosis complex,TSC2),影響TSC的GTP酶活化蛋白活性,從而抑制mTOR[34]。ADPKD中AMPK受到ERK信號的抑制,導(dǎo)致mTOR的激活,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞增殖;而mTORC1-糖酵解級聯(lián)反應(yīng)使細(xì)胞內(nèi)ATP堆積,導(dǎo)致AMPK進(jìn)一步被抑制,使細(xì)胞內(nèi)能量代謝調(diào)控出現(xiàn)紊亂。同時,囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)作為一個ATP門控的氯離子通道,解除了AMPK的抑制作用,導(dǎo)致囊液分泌失調(diào)[35];而ROS和脂質(zhì)過氧化能夠激活跨膜蛋白16A,導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流減少和儲存鈣的消耗,激活CFTR依賴的氯離子分泌[33],促進(jìn)囊性病變的進(jìn)展。

因此,干預(yù)代謝重編程能夠有效改善ADPKD的細(xì)胞異常增殖和囊液分泌。通過飲食[10]、藥物干預(yù)能量代謝在細(xì)胞和動物實驗中取得了明顯的效果,目前全球范圍內(nèi)開展的關(guān)于ADPKD能量代謝飲食或藥物干預(yù)臨床研究見表1,這些臨床試驗的結(jié)果令人期待。但由于能量代謝具有全身普遍性,如何特異性有效抑制囊腫上皮細(xì)胞中高度活化的能量代謝狀態(tài)具有重要意義。

表1 ADPKD能量代謝相關(guān)治療靶點

小 結(jié)

ADPKD是一種預(yù)后不佳的遺傳性腎臟病,以囊腫上皮細(xì)胞的異常增殖和伴隨的炎癥、纖維化為特征。PC1和(或)PC2能夠通過直接和間接的方式調(diào)節(jié)線粒體能量代謝,ADPKD多囊蛋白失活狀態(tài)下,細(xì)胞線粒體的形態(tài)、功能發(fā)生改變,出現(xiàn)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)β氧化障礙,同時發(fā)生代謝重編程,有氧糖酵解成為主要供能方式,增強氨基酸代謝,提高產(chǎn)能效率,為細(xì)胞分裂增殖提供生產(chǎn)底物,保證細(xì)胞快速增殖的可行性和持續(xù)性(圖1)。

圖1 ADPKD能量代謝改變相關(guān)機(jī)制[26,32]ADPKD:常染色體顯性遺傳性多囊腎病;PC:多囊蛋白;CFTR:囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白; PKA:蛋白激酶A;ERK:細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶;MEK:ERK激酶;mTOR:雷帕霉素靶蛋白;LKB1:肝激酶B1;AMPK:腺苷酸活化蛋白激酶;MFN:線粒體融合蛋白; MAPK:絲裂原活化蛋白激酶;NOS:一氧化氮合酶;PPAR:過氧化物酶體增殖物激活受體;PGC-1α:PPARγ共激活因子1α; HIF1α:缺氧誘導(dǎo)因子1α;AC6:腺苷酸環(huán)化酶6;V2R:血管加壓素2型受體;SSTR:生長抑素受體;TCA:三羧酸循環(huán);FAO:脂肪酸β氧化;ROS:活性氧

干預(yù)ADPKD能量代謝改變是具有前景的治療措施。但ADPKD代謝重編程的全貌、多囊蛋白丟失觸發(fā)代謝重編程的機(jī)制、能量代謝轉(zhuǎn)換靈活性低下的原因,仍需要進(jìn)一步的研究。