史珂慧 王彥兵 高菊林 張 歡 宮永寬 蔣紅利

血液透析是終末期腎病患者賴以生存的主要治療方式。膜材料是血液透析的核心部分,由于生物不相容性,當(dāng)膜與血液接觸后體外循環(huán)(ECC)會(huì)發(fā)生凝血和機(jī)體炎癥反應(yīng),不僅影響透析治療效果,而且會(huì)降低患者的生存率[1]。對(duì)膜材料表面進(jìn)行改性是提高生物相容性的一個(gè)重要策略。2甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿(MPC)是含有磷酰膽堿基團(tuán)的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)磷脂聚合物,將MPC聚合物涂敷在材料表面可以提高材料的血液相容性[2-4],但是既往的MPC聚合物涂層由于不穩(wěn)定性在使用的過(guò)程中可能會(huì)脫落[5]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在MPC聚合物中加入多巴胺合成仿細(xì)胞膜和仿貽貝結(jié)構(gòu)的“雙仿生”聚合物,可以增加MPC聚合物涂層的黏附性,提高材料的抗污性能[6-10]。然而目前該類聚合物涂層還沒(méi)有被用于透析器膜材料的改性。本研究將仿細(xì)胞膜和仿貽貝結(jié)構(gòu)的MPC/對(duì)硝基苯氧羰基聚乙二醇甲基丙烯酸酯/多巴胺(PMNC)聚合物涂敷在醋酸纖維素(CA)透析器膜表面,通過(guò)體外、體內(nèi)序貫性實(shí)驗(yàn)研究該聚合物涂層對(duì)透析器生物相容性的影響。

材料和方法

PMNC聚合物合成參照Gong等[6]合成方法合成PMNC聚合物。

涂層構(gòu)建將10 mg PMNC聚合物溶解在10 ml蒸餾水中,用飽和碳酸鈉溶液將pH值調(diào)整至8.5,配置成1 mg/ml的PMNC聚合物溶液,將CA膜浸泡在上述溶液中120 min,80℃加熱交聯(lián)8h,然后蒸餾水洗滌。

將1 mg/ml PMNC聚合物水溶液注入透析器[容積75 ml、面積1.3 m2、超濾系數(shù)10 ml/(h·mmHg)],浸涂2h,抽出溶液后加熱干燥(80℃,24h),蒸餾水洗滌后真空干燥,改性后的透析器用環(huán)氧乙烷消毒后備用。

涂層穩(wěn)定性評(píng)估將不同量的PMNC聚合物溶解于3.5%倫拿靈溶液中,檢測(cè)液體表面張力,并繪制倫拿靈溶液表面張力隨PMNC聚合物濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將PMNC涂層改性后的CA膜在倫拿靈溶液中浸泡12h后檢測(cè)溶液表面張力,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖計(jì)算溶液中的PMNC聚合物含量,觀察PMNC聚合物涂層是否從CA膜表面脫落到倫拿靈溶液里。

體外蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn)將蛋白質(zhì)工作液與BCA工作試劑等體積混勻,60℃顯色60 min;紫外分光光度計(jì)測(cè)量各溶液的吸光度值(562 nm),繪制蛋白質(zhì)工作曲線;將無(wú)涂層與PMNC聚合物涂層CA膜樣品置于PBS溶液中平衡120 min;PBS洗滌;濾紙吸掉多余的PBS;將樣品分別浸入4.5 mg/ml牛血清白蛋白(BSA)溶液及0.3 mg/ml 纖維蛋白原(Fib)溶液中;二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)120 min;依次用PBS和蒸餾水洗滌;將樣品置于裝有2 ml 1%SDS水溶液的燒杯中超聲解吸附20 min;取1.5 ml解吸液,加入等體積BCA工作試劑,60℃顯色60 min;紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液在562 nm處的吸光度值,代入蛋白質(zhì)工作曲線,通過(guò)解吸液中蛋白質(zhì)濃度計(jì)算蛋白質(zhì)在樣品上的吸附量。

動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)該實(shí)驗(yàn)由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)比格犬共6只,體重9～12 kg,分為PMNC聚合物涂層組和無(wú)涂層組,采用交叉實(shí)驗(yàn)方法,洗脫期為2周。3%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉,經(jīng)股靜脈留置雙腔中心靜脈導(dǎo)管(8.5Fr)。羥乙基淀粉130/0.4氯化鈉注射液預(yù)充管路及透析器,股靜脈導(dǎo)管動(dòng)脈端引血,血液在壓力泵的作用下流經(jīng)透析器經(jīng)股靜脈導(dǎo)管靜脈端輸回體內(nèi)。ECC時(shí)間為120 min,若有部分凝血?jiǎng)t提前結(jié)束。血流速度90 ml/min,血液保存液(4%枸櫞酸鈉)在透析器前180 ml/h持續(xù)泵入,葡萄糖酸鈣溶液經(jīng)外周靜脈補(bǔ)充,檢測(cè)透析器前、后血液的鈣離子濃度,使透析器后的鈣離子濃度為透析器前的30%左右。ECC結(jié)束后拔除股靜脈插管,局部按壓至少30 min直至傷口不滲血。分別于ECC 0 min、5 min、15 min、30 min、60 min及120 min采集血樣,檢測(cè)血液中血小板(PLT)、白細(xì)胞(WBC)和紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)及Fib、β血小板球蛋白(β-TG)、白細(xì)胞介素8(IL-8)、凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(TAT)、補(bǔ)體片段5a(C5a)和凝血酶原片段1+2(F1+2)等濃度。ECC 120 min后,用2 000 ml生理鹽水沖洗循環(huán)管路和透析器,觀察透析器的凝血情況。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用《IBM SPSS Statistics 24》軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量數(shù)據(jù),使用t檢驗(yàn)比較兩組計(jì)量數(shù)據(jù)之間的差異,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

涂層穩(wěn)定性圖1A所示為倫拿靈溶液表面張力隨PMNC聚合物濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將PMNC聚合物涂層CA膜在倫拿靈溶液中浸泡12h,結(jié)果顯示浸泡前后液體的表面張力無(wú)明顯變化(P>0.05),提示PMNC聚合物涂層具有優(yōu)異的生物穩(wěn)定性見(jiàn)圖1B。

圖1 PMNC聚合物涂層醋酸纖維素膜在倫拿靈中浸泡前后液體表面張力

蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果在4.5 mg/ml BSA溶液中浸泡120 min后,無(wú)涂層CA膜與PMNC聚合物涂層CA膜BSA吸附量分別為(0.31±0.08) μg/mg和(0.06±0.02) μg/mg,兩者相比有明顯差異(P<0.01)(圖2A)。同樣,在0.3 mg/ml FIB溶液中浸泡120 min后,無(wú)涂層CA膜FIB吸附量為(0.45±0.03) μg/mg,而PMNC涂層CA膜僅為(0.08±0.01) μg/mg(P<0.01)(圖2B)。PMNC聚合物涂層使CA膜對(duì)BSA和FIB的吸附量分別下降了81%和82%。

圖2 無(wú)涂層CA膜和PMNC聚合物涂層CA膜對(duì)BSA及FIB的吸附CONTROL:無(wú)涂層組；CA:醋酸纖維素；BSA：牛血清白蛋白；Fib:纖維蛋白原；**:無(wú)涂層組和PMNC聚合物涂層組比較,P<0.01

透析器凝血情況ECC 120 min后,無(wú)涂層透析器可見(jiàn)較多紅色的凝血纖維束,而PMNC聚合物涂層改性透析器則為白色幾乎沒(méi)有血栓形成(圖3)。以上結(jié)果表明,PMNC聚合物涂層可以減輕CA膜表面的凝血現(xiàn)象。

圖3 體外循環(huán)120 min后透析器凝血情況A：無(wú)涂層透析器；B：PMNC聚合物涂層透析器

纖維蛋白原吸附與凝血激活如圖4A所示,ECC 5 min時(shí)無(wú)涂層組和PMNC聚合物涂層組FIB濃度較ECC前分別下降了25%和7%(除去血液稀釋影響16%),兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),而且ECC 120 min時(shí)這種差異依然存在。F1+2和TAT都是凝血反應(yīng)的早期產(chǎn)物。ECC后兩組TAT濃度和F1+2濃度均較ECC前有所增加,而無(wú)涂層組上述指標(biāo)增加幅度更明顯。120 min時(shí)無(wú)涂層組TAT濃度達(dá)峰值(6.70±0.50)ng/ml,是ECC前的2.45倍,而PMNC聚合物涂層組TAT濃度為(3.84±0.73) ng/mL,兩組間比較有顯著性差異(P<0.001)(圖4B)。在整個(gè)ECC過(guò)程中,雖然無(wú)涂層組F1+2濃度上升的趨勢(shì)比PMNC聚合物涂層組更明顯,但是兩組之間比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖4C)。

圖4 體外循環(huán)中Fib、TAT、F1+2變化Fib:纖維蛋白原；TAT：凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物；FH2：凝血酶原片段H2；CONTROL:無(wú)涂層組；PMNC聚合物涂層組和無(wú)涂層組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

PLT吸附與激活如圖5A所示,ECC 5 min時(shí)兩組PLT均出現(xiàn)下降,30 min時(shí)無(wú)涂層組和PMNC聚合物涂層組PLT下降率分別為13%和1%(除去血液稀釋影響),兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ECC 30 min后兩組PLT計(jì)數(shù)逐漸達(dá)到平臺(tái)期。β-TG是血小板活化的標(biāo)志物之一,無(wú)涂層組β-TG濃度在ECC 5 min時(shí)開(kāi)始上升,30 min時(shí)達(dá)峰值(為ECC前的1.95倍),之后則逐漸下降,而PMNC聚合物涂層組β-TG濃度僅輕度上升,兩組比較有顯著性差異(圖5B)。

圖5 體外循環(huán)中PLT下降率和β-TG濃度變化PLT：血小板；β-TG：β血小板球蛋白；CONTROL:無(wú)涂層組；PMNC聚合物涂層組和無(wú)涂層組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

白細(xì)胞吸附與激活如圖6A所示,ECC開(kāi)始后兩組WBC計(jì)數(shù)均下降,30 min時(shí)無(wú)涂層組和PMNC聚合物涂層組WBC下降率分別為41%和8%,組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,120 min時(shí)兩組WBC均基本恢復(fù)至ECC前水平。C5a和IL-8分別是補(bǔ)體和WBC激活的標(biāo)志物之一,ECC 15 min時(shí),無(wú)涂層組C5a和IL-8濃度急速上升達(dá)峰值,分別是ECC前的3.71倍和4.99倍,而PMNC聚合物涂層組C5a和IL-8濃度則無(wú)明顯變化,兩組比較有明顯差異(圖6B、C)。

圖6 體外循環(huán)中WBC、C5a、IL-8變化WBC:白細(xì)胞計(jì)數(shù)；C5a：補(bǔ)體片段5a；IL-8：白細(xì)胞介素8；CONTROL:無(wú)涂層組；PMNC聚合物涂層組和無(wú)涂層組比較，*P<0.05,**P<0.01,***:P<0.001

紅細(xì)胞及血紅蛋白(Hb)吸附在整個(gè)ECC過(guò)程中, PMNC聚合物涂層組RBC變化率、紅細(xì)胞壓積(HCT)、Hb等相關(guān)指標(biāo)均無(wú)明顯變化,與無(wú)涂層組相比亦沒(méi)有差異(圖7)。以上說(shuō)明PMNC聚合物涂層并不增加紅細(xì)胞消耗或者不會(huì)引起溶血,安全性較好。

圖7 ECC中紅細(xì)胞及相關(guān)指標(biāo)變化ECC：體外循環(huán);Hct:紅細(xì)胞壓積;Hb:血紅蛋白;MCV:平均紅細(xì)胞體積;MCH:平均血紅蛋白含量;RDW-CV:紅細(xì)胞寬度CV值

討 論

透析器膜接觸血液后,會(huì)迅速激活凝血反應(yīng)、補(bǔ)體反應(yīng)和炎癥反應(yīng),在膜表面形成血栓并堵塞透析膜微孔,嚴(yán)重影響透析效果甚至使血液透析無(wú)法順利進(jìn)行。本研究將仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)PMNC聚合物涂敷在CA膜表面,并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)揭示了PMNC聚合物涂層具有優(yōu)異的穩(wěn)定性,可以顯著抑制纖維蛋白原吸附,并減少血小板和白細(xì)胞的黏附及激活,從而提高CA膜透析器的血液相容性。

研究表明,吸附Fib是透析器凝血的始動(dòng)因素[11-14]。本研究發(fā)現(xiàn),PMNC聚合物涂層可以使CA膜對(duì)Fib的吸附量下降82%。TAT是凝血反應(yīng)的早期產(chǎn)物,檢測(cè)血漿中的TAT濃度可以反映ECC的凝血狀態(tài)[15]。在ECC實(shí)驗(yàn)中無(wú)涂層組TAT濃度上升明顯,而PMNC聚合物涂層組TAT始終無(wú)明顯變化。ECC 120 min后無(wú)涂層透析器可見(jiàn)較多凝血纖維束,而PMNC聚合物涂層改性透析器則幾乎沒(méi)有血栓形成。由此推測(cè)PMNC聚合物涂層可能通過(guò)顯著抑制Fib吸附,從而減輕CA膜表面的凝血反應(yīng)。

血小板聚集和活化是凝血過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),β-TG是血小板活化的標(biāo)志物之一。在本研究中無(wú)涂層組PLT計(jì)數(shù)在ECC 30 min時(shí)下降了13%,與Verbeelen等[16]的研究結(jié)果類似,而PMNC聚合物涂層組PLT計(jì)數(shù)僅下降了1%。無(wú)涂層組β-TG濃度在ECC 30 min時(shí)達(dá)峰值較ECC前升高了1.95倍,而PMNC聚合物涂層組β-TG濃度僅輕度上升。既往研究發(fā)現(xiàn)使用聚砜膜透析器透析4h能使血液中β-TG濃度升高至少7.4倍[17]。由此可見(jiàn),聚砜膜對(duì)血小板的活化程度似乎較CA膜更強(qiáng),而PMNC聚合物涂層能夠減輕CA膜表面對(duì)血小板的聚集和活化。

當(dāng)血液與透析膜接觸時(shí),即可發(fā)生補(bǔ)體激活[18]。本研究中PMNC聚合物涂層組C5a濃度較無(wú)涂層組明顯降低,說(shuō)明PMNC聚合物涂層可以顯著抑制CA膜對(duì)補(bǔ)體的激活,然而Cheung等[19]卻發(fā)現(xiàn)肝素涂層能夠增強(qiáng)CA膜對(duì)補(bǔ)體的激活,似乎說(shuō)明在免疫抑制方面PMNC聚合物涂層更優(yōu)于肝素涂層,但是仍需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)支持。研究表明,補(bǔ)體激活后產(chǎn)生的C3a和C5a可以促進(jìn)白細(xì)胞黏附于膜表面并被激活釋放組織因子等影響凝血反應(yīng)[20-25]。IL-8是WBC激活的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn),在ECC中無(wú)涂層組WBC下降和IL-8濃度上升程度均顯著高于PMNC聚合物涂層組。據(jù)此推測(cè)PMNC聚合物涂層可能通過(guò)抑制補(bǔ)體激活從而減少CA膜對(duì)WBC的吸附和激活。

由于透析器膜材料具有生物不相容性,在血液透析過(guò)程中常使用肝素防止凝血,有出血風(fēng)險(xiǎn)的患者則使用枸櫞酸局部抗凝。一項(xiàng)前瞻性研究比較血液透析時(shí)使用肝素和枸櫞酸抗凝對(duì)生物相容性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝素組C5a濃度輕度升高、WBC無(wú)明顯變化,而枸櫞酸組C5a濃度顯著升高、WBC明顯下降[26]。由此可見(jiàn),肝素可以抑制透析膜引起的補(bǔ)體激活及WBC減少,而枸櫞酸對(duì)補(bǔ)體和WBC的影響較小,能夠更客觀地反映膜材料的血液相容性,所以在本研究ECC過(guò)程中使用枸櫞酸抗凝。

小結(jié):仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)PMNC聚合物涂層具有優(yōu)異的穩(wěn)定性,能夠抑制CA膜表面對(duì)纖維蛋白原的吸附、對(duì)血小板和白細(xì)胞的黏附及激活,顯著提高透析器的生物相容性,以上結(jié)果為進(jìn)一步將PMNC聚合物涂層應(yīng)用于醫(yī)療器械的表面改性提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。