杜孟茹 張麗華 吳曉梅 劉志紅 謝紅浪

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種累及多個組織和器官的自身免疫疾病,狼瘡性腎炎(LN)是SLE常見的并發(fā)癥之一。免疫復(fù)合物沉積,補體系統(tǒng)、免疫細胞、細胞因子的變化及基因調(diào)控異常等因素共同導(dǎo)致LN的發(fā)生發(fā)展[1]。T細胞亞群的失衡包括Th1細胞、Th2細胞等都可影響LN的進展[2]。“雙陰性”(double negative,DN)-T細胞是外周血中表達αβT細胞受體(TCR)但缺乏CD4、CD8和自然殺傷(NK)細胞標(biāo)記的T細胞[3],約占正常人外周血CD3+T淋巴細胞的1%～3%[4],而在自身免疫性淋巴增殖綜合征(ALPS)、SLE、干燥綜合征等自身免疫疾病中會顯著擴增。El-Sayed等[5]發(fā)現(xiàn)SLE患者DN-T細胞與疾病活動相關(guān),胡偉等[6]發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血中DN-T細胞可分泌多種細胞因子,但相關(guān)研究和納入研究的病例數(shù)均相對較少。因此,本研究進一步分析LN患者外周血DN-T細胞比例與疾病活動和預(yù)后的關(guān)聯(lián),為LN的疾病活動監(jiān)測提供新途徑。

對象和方法

研究對象回顧性分析2010年1月至2017年12月于國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心首次住院治療的LN患者。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],并伴有腎臟損害的臨床表現(xiàn)者。(2)在我院行腎活檢者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并嚴(yán)重活動性感染、結(jié)核病等;(2)合并原發(fā)性心、肝等器質(zhì)性病變以及造血系統(tǒng)疾病;(3)治療1年時失訪或檢驗項目不全(圖1)。

圖1 研究對象篩選流程

臨床資料收集患者性別,腎活檢年齡、SLE病程、腎臟損害病程、腎外器官受累情況等,使用SLE疾病活動性指數(shù)(SLE-DAI)對疾病活動評分。

研究指標(biāo)收集腎活檢及治療1年時尿蛋白定量、尿沉渣紅細胞計數(shù)、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖甘酶(NAG)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP); 血紅蛋白(Hb)、白細胞計數(shù)(WBC)、淋巴細胞計數(shù)、血小板計數(shù)(PLT)、血清白蛋白(Alb) 、血清肌酐(SCr)、尿酸、總膽固醇、三酰甘油、抗雙鏈DNA、補體C3、補體C4、抗C1q抗體。采用流式細胞儀法檢測新鮮EDTA抗凝外周血中不同淋巴細胞亞群[外周血CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)],采用雙平臺法計算不同淋巴細胞亞群的細胞數(shù)。

DN-T細胞數(shù)量(個/μl)=CD3+T淋巴細胞計數(shù)-CD4+T淋巴細胞計數(shù)-CD8+T淋巴細胞計數(shù)

DN-T比例(%)=DN-T細胞計數(shù)/CD3+T淋巴細胞計數(shù)×100%

病理資料所有患者均行腎臟穿刺病理檢查,常規(guī)行光鏡、免疫熒光及電鏡染色。病理切片按2003年國際腎臟病學(xué)會/腎臟病理學(xué)會(INS/RPS2003)分型方案進行分型[8]。對多種病理學(xué)征象采用半定量計數(shù),進行活動性指數(shù)(AI)及慢性指數(shù)(CI)評分。

治療方案結(jié)合患者的疾病特征及腎活檢病理類型選擇治療方案,包括甲潑尼龍(MP)沖擊,口服激素、他克莫司(FK506)、嗎替麥考酚酯(MMF)及MMF聯(lián)合FK506,和靜脈環(huán)磷酰胺等,部分患者采用雙重濾過血漿置換(DFPP)或血漿置換。

主要療效指標(biāo)及相關(guān)定義本研究主要隨訪治療1年時在我院復(fù)查的患者,以面對面形式訪問患者,觀察隨訪1年時療效。完全緩解(CR):尿蛋白定量<0.4 g/24h,無活動性尿沉渣,SCr正常或上升不超過基礎(chǔ)值15%,Alb≥35 g/L;部分緩解(PR): 尿蛋白定量下降至基線50%以下,且<3g/d,Alb≥30 g/L,SCr正?；蛏仙怀^基礎(chǔ)值15%。未緩解(NR):不符合PR或CR標(biāo)準(zhǔn)。隨訪截止2020-12-31,隨訪終點定義為進入終末期腎病(ESRD)[根據(jù)CKD-EPI公式估算的腎小球濾過率(eGFR)<15 ml/(min·1.73 m2)或接受腎臟替代治療3個月以上]或死亡。

統(tǒng)計學(xué)方法本研究使用《IBM SPSS 21.0》軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。以單樣本Kolmogorov-SmirnovZ檢驗對計量資料進行正態(tài)性檢驗。計量資料若符合正態(tài)分布,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差做描述性分析,兩組間比較應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗,相關(guān)性使用 Pearson 相關(guān)分析;若不符合正態(tài)分布,以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)做描述性分析,兩組間比較應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗,相關(guān)性使用 Spearman 相關(guān)分析。相關(guān)系數(shù)r的絕對值>0.8認為兩者強相關(guān)，0.5～0.8為中等相關(guān)，若<0.3則認為基本無相關(guān)。計數(shù)資料以百分率表示,組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗;兩配對樣本比較采用Wilcoxon符號秩檢驗。腎累積生存曲線應(yīng)用Kaplan-Meier曲線分析及Log-Rank檢驗。單因素分析采用COX回歸分析,將結(jié)果中P<0.1的變量進入多因素COX回歸模型,分析影響不良預(yù)后的危險因素。檢驗均采用雙側(cè)檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

基線資料275例LN患者中男性43例(15.6%),女性232例(84.4%),中位年齡27(21,37)歲。所有患者DN-T細胞比例為5.11%±3.58%,范圍為0～23.49%。194例(70.5%)患者DN-T細胞比例>3%。根據(jù)DN-T細胞比例中位數(shù)4.60%,將患者分為DN-T細胞低比例組與DN-T細胞高比例組兩組。兩組患者腎外器官受累情況如累及血液、皮膚、關(guān)節(jié)、神經(jīng)等無差異,DN-T細胞高比例組的年齡更小、SLE和LN病程更短、SLE-DAI評分更高,淋巴細胞比例、尿酸、血鉀水平、抗C1q抗體等指標(biāo)明顯高于DN-T細胞低比例組,年齡、補體C3、補體C4明顯低于DN-T細胞低比例組。兩組間WBC、PLT、Hb、Alb、SCr、尿RBC、尿蛋白定量等無統(tǒng)計學(xué)差異(表1)。

表1 兩組LN患者基線資料和療效比較

兩組腎小球病理類型分布無差異。與DN-T細胞低比例組相比,高比例組患者腎臟病變的CI、球性硬化和新月體比例更低(P<0.05),毛細血管袢血栓發(fā)生率更高(P<0.05)(表2)。

表2 275例LN患者病理特征比較

治療與療效兩組患者誘導(dǎo)期免疫抑制劑治療無差異(表3)。隨訪1年時,81例患者CR(29.5%),104例患者PR(37.8%),90例患者NR(32.7%),兩組患者的治療效果無差異(χ2=2.425,P=0.297)(表1)。

表3 兩組誘導(dǎo)治療方案資料[n(%)]

DN-T比例與疾病活動和療效的關(guān)系基線時DN-T細胞百分比與SLE-DAI評分(r=0.203,P=0.001)、抗C1q抗體滴度(r=0.232,P<0.001),Plt(r=-0.161,P=0.007)、補體C3(r=-0.171,P=0.004)、補體C4(r=-0.152,P=0.012)等指標(biāo)無顯著線性相關(guān)關(guān)系。

對比基線資料發(fā)現(xiàn),緩解組與未緩解組的尿RBC計數(shù)、抗dsDNA陽性比例及補體C3、補體C4、AI、CI、球性硬化比例、節(jié)段硬化比例、新月體比例及袢壞死等有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),兩組基線DN-T細胞比例無差異(P=0.872)。治療1年后,緩解組DN-T細胞比例較基線時顯著下降(P=0.001),而未緩解組治療前后DN-T細胞比例無差異,治療1年后的緩解組DN-T細胞比例低于未緩解組,但無統(tǒng)計學(xué)差異(圖2)。

圖2 治療前、后“雙陰性”(DN)-T細胞比例對比

腎臟存活遠期預(yù)后及影響因素中位隨訪時間62(48,88)月,18例患者進入ESRD,與DN-T細胞低比例組相比,高比例組患者的腎存活率較低,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.365),而治療1年后未緩解組患者的腎存活率更低(P<0.001)(圖3)。COX單因素分析顯示男性、腎臟損害病程長、Alb低、BUN高、SCr高、低補體C4、低Treg、腎臟的球性硬化、節(jié)段硬化比例高是影響患者腎臟預(yù)后的風(fēng)險因素。將上述P<0.1的變量納入多因素COX回歸模型,結(jié)果顯示男性、Treg<23個/μl、腎臟球性硬化>10%、節(jié)段硬化>10%是影響患者進入ESRD的獨立危險因素(表4)。

圖3 LN患者預(yù)后DN-T細胞:“雙陰性”T細胞;LN:狼瘡性腎炎;A:基線DN-T細胞比例<4.6%組與DN-T細胞比例≥4.6%組患者腎存活曲線對比;B:治療1年時緩解組與未緩解組腎存活曲線對比

表4 影響LN患者腎臟預(yù)后的危險因素

討 論

DN-T細胞是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一類新的Treg亞群,但其在LN患者外周血中的表達及在疾病進展中作用尚不明確。本研究主要以DN-T細胞/CD3+T細胞即DN-T細胞比例的中位數(shù)分為兩組,結(jié)果顯示高DN-T細胞比例組疾病活動評分更高,腎臟的慢性損害程度低。隨訪1年時,緩解組患者較其活動期時的DN-T細胞比例顯著降低。

研究認為,DN-T細胞可能在胸腺細胞發(fā)育過程中逃避了陰性選擇后在外周血中活化、增殖[9],或直接源自外周血中的CD4+[10]或CD8+T細胞[11-12]。通常認為,健康人外周血DN-T細胞比例很低(約占人CD3+T淋巴細胞的1%～3%)[4],但在自身免疫疾病炎癥的刺激下會顯著上升。El-Sayed等[5]的研究中約有85%的SLE患者的DN-T細胞水平升高,我們也發(fā)現(xiàn)70.5%的LN患者的外周血中DN-T細胞比例升高(>3%)。Alexande等[13]發(fā)現(xiàn),隨著疾病進展SLE患者DN-T細胞數(shù)量增加,并在LN中起重要作用。動物實驗研究顯示,在干擾素α(IFN-α)[14]、白細胞介素(IL)-6和IL-23[15-16]的刺激下,DN-T細胞可在浸潤器官中顯著擴增,分泌大量的IFN-γ、IL-17、IL-4等細胞因子,并降低IL-2的水平,引發(fā)LN及皮膚損傷等。這些都可能與活動期LN患者DN-T細胞比例更高有關(guān)。

DN-T細胞在SLE患者腎臟中浸潤,分泌促炎因子,激活其他免疫細胞并誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生,從而造成腎臟損害[17]。Lai等[18]發(fā)現(xiàn)SLE患者體內(nèi)雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的激活可促進DN-T細胞產(chǎn)生IL-4, 從而激活B細胞、產(chǎn)生dsDNA 抗體,進一步造成組織損傷。研究發(fā)現(xiàn),SLE患者在西羅莫司(mTOR抑制劑)治療后,DN-T細胞產(chǎn)生的IL-4和IL-17明顯減少[18-19],Treg計數(shù)較前增加,有效地改善了SLE疾病活動。本研究發(fā)現(xiàn)大部分患者經(jīng)治療獲得緩解后,DN-T細胞比例較前顯著下降(P=0.018)。有研究發(fā)現(xiàn),DN-T細胞可能與類固醇持續(xù)時間和累積劑量、MMF累積劑量之間存在負相關(guān)[5];但也有研究認為,DN-T細胞與細胞毒性藥物使用無關(guān),在治療8個月內(nèi)保持穩(wěn)定[20]。我們認為DN-T細胞的影響因素可能存在異質(zhì)性或特殊基因背景,部分患者在治療后DN-T細胞比例無明顯下降可能與之相關(guān)。

最近的幾項研究發(fā)現(xiàn)MRL/lpr狼瘡小鼠在接受11a-1[一種有效、可逆和特異的SHP2抑制劑(SHP2:一種非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶)][21]、四硫化四砷(As4S4)[22]、羥甲香豆素(4-Methylumbelliferone,4-MU)(透明質(zhì)酸抑制劑)[23]、隱丹參酮(cryptotanshinone,CTS)(STAT3抑制劑,STAT3:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3)[24]治療后,DN-T細胞數(shù)量明顯降低,炎癥細胞因子如IL-17,IFN-γ等也較前減少,并抑制了靶器官的組織損傷,這進一步說明了DN-T細胞在狼瘡和腎損傷中的重要作用,同時也預(yù)示著DN-T細胞或許是SLE潛在的治療靶點。

本研究尚存在一定局限性:(1)單中心樣本的回顧性研究,缺少對照組;(2)因患者失訪或檢驗資料不全被排除的病例較多,最后入選小部分病例所得結(jié)果可能存在偏差;(3)由于時間、研究條件的限制以及研究目的的需要,我們只將患者以DN-T細胞比例中位數(shù)為界值分為兩組,未觀察不同治療方案對DN-T細胞比例的影響。(4)DN-T細胞比例較低的患者病程較長,可能跟既往接受免疫抑制治療有關(guān),但本文沒有分析既往治療與基線DN-T細胞計數(shù)的關(guān)聯(lián)。

小結(jié):LN患者的外周血中DN-T細胞百分比高于正常水平,可能在整體水平反應(yīng)患者的疾病活動性,或許可作為監(jiān)測疾病活動及療效的候選指標(biāo),但有待進一步擴大樣本研究及前瞻性研究證實。