李青，魚海鵬，張子豪，孫正文，張艷，張冬梅，王省芬，馬峙英，閻媛媛

棉花真葉原生質(zhì)體分離及瞬時表達體系的優(yōu)化

李青，魚海鵬，張子豪，孫正文，張艷，張冬梅，王省芬，馬峙英，閻媛媛

河北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室/河北省作物種質(zhì)資源重點實驗室，河北保定 071001

【】真葉細胞能模擬植物內(nèi)源條件，建立基于棉花真葉原生質(zhì)體的高效瞬時表達體系，為快速有效研究棉花基因功能提供方法。以陸地棉TM-1真葉為材料，采用常用的纖維素酶和離析酶組合分離原生質(zhì)體，探究影響原生質(zhì)體分離的葉齡、滲透壓、酶解液成分和酶解時間，及滲透壓和酶解時間對原生質(zhì)體活力的影響，并分析滲透壓、PEG濃度和培養(yǎng)液種類對原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化的影響，進而優(yōu)化棉花真葉原生質(zhì)體瞬時表達體系。構(gòu)建表達載體，對比融合蛋白在擬南芥、棉花原生質(zhì)體和煙草表皮細胞中的亞細胞定位，驗證該體系。不同于棉花子葉，酶解液中高濃度CaCl2會顯著抑制真葉細胞壁的酶解，含10 mmol·L-1CaCl2的酶解液能有效分離棉花真葉原生質(zhì)體。甘露醇顯著影響原生質(zhì)體得率，含0.5 mol·L-1甘露醇的酶解液分離原生質(zhì)體得率最高，且細胞形態(tài)維持較好，而0.4 mol·L-1甘露醇條件下原生質(zhì)體活力降低一倍，表明0.5 mol·L-1甘露醇能較好維持棉花真葉原生質(zhì)體滲透壓。陸地棉剛展平的真葉分離所得原生質(zhì)體大小合適，而展平后的嫩葉分離得到的原生質(zhì)體細胞較大，得率降低一倍。酶解處理7 h前，原生質(zhì)體游離緩慢，酶解9 h原生質(zhì)體產(chǎn)量達到高峰，繼續(xù)酶解原生質(zhì)體將破裂，得率降低。在等滲條件下用40% PEG4000轉(zhuǎn)化所得原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化效率最高，而普遍采用的低滲條件不利于棉花真葉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后，用WI溶液繼續(xù)培養(yǎng)原生質(zhì)體，會引起原生質(zhì)體的大量破裂，用含0.5 mol·L-1甘露醇的W5溶液繼續(xù)培養(yǎng)，有利于原生質(zhì)體形態(tài)的維持，轉(zhuǎn)化率提高到90%。表達載體35S:分別轉(zhuǎn)入棉花、擬南芥原生質(zhì)體和煙草表皮細胞，GFP信號在細胞中的定位結(jié)果一致。建立的棉花真葉原生質(zhì)體瞬時表達體系，可獲得8.10×106個/mL活力在95%以上的高質(zhì)量原生質(zhì)體，原生質(zhì)體得率提高8倍，轉(zhuǎn)化效率達到90%，可用于亞細胞定位、蛋白互作，以及代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究等。

棉花；TM-1；原生質(zhì)體分離；瞬時表達

0 引言

【研究意義】棉花是世界上最重要的經(jīng)濟作物之一，在國民經(jīng)濟中占據(jù)重要地位。隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，多個野生棉和栽培棉（）基因組陸續(xù)完成測序與組裝，并被升級[1-5]。這些高質(zhì)量的基因組序列為解析棉花許多重要的進化事件與機制提供了便利，更加快了重要農(nóng)藝性狀相關(guān)位點的挖掘。然而，四倍體栽培棉種基因組較大，陸地棉遺傳標準系TM-1（L. acc. TM-1）基因組包含74 350個編碼蛋白的基因[5]，大量重要基因的功能急需解析。但棉花突變體資源稀少，遺傳轉(zhuǎn)化周期長且轉(zhuǎn)基因效率不高，制約著基因功能研究。利用基因的時空表達特征和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，建立一套快速高通量驗證棉花基因功能的方法，是加速棉花功能基因組學研究進程，并能快速獲得目標性狀的候選功能基因，從而進行基因組精準改良的基礎(chǔ)[6]。原生質(zhì)體無細胞壁障礙，是進行基因遺傳轉(zhuǎn)化操作、研究基因表達調(diào)控和功能的優(yōu)良材料，為進行高通量的基因功能研究提供了一種經(jīng)濟、有效的方法。【前人研究進展】原生質(zhì)體瞬時表達體系因其快速、高效的優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于亞細胞定位、分子互作及代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等研究。目前，已在擬南芥[7]、煙草[8]、小麥[9]、水稻[10-11]等植物中建立了高效的原生質(zhì)體瞬時表達體系，并廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。Xiong等[12]利用大豆葉肉原生質(zhì)體瞬時表達體系揭示了細胞質(zhì)類光體結(jié)構(gòu)的形成。結(jié)合葉肉原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化和HPLC-MS技術(shù)，Gao等[13]鑒定了調(diào)控和合成玉米苯丙噁嗪的相關(guān)基因，為改良玉米抗蟲能力提供了理論依據(jù)。原生質(zhì)體還被用于挖掘植物抗病相關(guān)基因及識別病原菌的效應(yīng)子[14-15]。棉花原生質(zhì)體首先從陸地棉纖維游離出，之后從多個棉種的多種外植體分離出有活力的原生質(zhì)體[16]。孫玉強[17]詳細分析了影響棉花原生質(zhì)體分離的酶液組合，從下胚軸、幼根和葉片中分離出原生質(zhì)體。李妮娜等[18]進一步分析了葉齡、甘露醇濃度和酶解時間對棉花幼嫩子葉原生質(zhì)體分離效率的影響，并利用PEG介導的棉花原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，對棉花鋅指蛋白GhZFP2進行了亞細胞定位研究。【本研究切入點】盡管已有較為高效的分離棉花子葉原生質(zhì)體的方法[18]，但子葉細胞以薄壁組織為主，不同于真葉的海綿組織，真葉才是植物與環(huán)境發(fā)生互作的主要部位。因此，利用真葉原生質(zhì)體進行基因的同源瞬時表達，避免了異源表達可能造成的差異結(jié)果，提高基因功能研究的準確性。但目前未見分離棉花真葉原生質(zhì)體的報道，且已報道的棉花原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化效率較低，尚不能滿足高通量研究基因功能的需要?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究運用酶解法分離與純化棉花真葉葉肉原生質(zhì)體，對比分析影響原生質(zhì)體分離與目標基因瞬時轉(zhuǎn)化的因素，優(yōu)化棉花真葉原生質(zhì)體瞬時表達體系，為開展高通量基因功能研究提供可靠方法。

1 材料與方法

試驗于2018—2021年在河北農(nóng)業(yè)大學教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點實驗室進行。

1.1 試驗材料

植物材料選取陸地棉遺傳標準系（TM-1）飽滿的種子播種于營養(yǎng)土與蛭石質(zhì)量比為3﹕1的土壤中，置光照培養(yǎng)室自然生長（28℃ 12 h光/12 h暗）至第5片真葉時，選取剛展平的第5片真葉與展平后5 d的第4片真葉，對比其原生質(zhì)體分離效果。

含有綠色熒光蛋白基因的植物表達載體pGreen0229-GFP用于原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化，該載體包含花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）35S啟動子、綠色熒光蛋白（GFP）基因等元件。在大腸桿菌DH5α菌株中擴增質(zhì)粒，大量提取純化制備質(zhì)粒DNA，以電泳鑒定。測定質(zhì)粒DNA的純度和濃度，OD260/OD280=1.6—1.8，濃度為1 μg·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗試劑：纖維素酶Cellulase Onzuka R10、離析酶Macerozyme R10、PEG4000等主要國產(chǎn)生化試劑均購于北京蘭博利德商貿(mào)有限公司，甘露醇、MES均購于Sigma公司。

1.2 棉花原生質(zhì)體的分離與純化

酶的種類是酶解法分離植物細胞原生質(zhì)體的關(guān)鍵，通常纖維素酶+離析酶組合能獲得理想的原生質(zhì)體分離效果[19]，因此，采用纖維素酶和離析酶分離原生質(zhì)體。配制含有1.5%纖維素酶、0.4%離析酶、0.5 mol·L-1甘露醇、20 mmol·L-1KCl、20 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1CaCl2、1.0 g·L-1BSA的混合酶液10 mL，經(jīng)0.45 μm纖維素微孔濾膜過濾待用。選取生長健壯的棉花真葉，去掉葉片主葉脈后，平展于培養(yǎng)皿上，將其切為寬度為0.5—1.0 mm的均勻細絲。取1.0 g葉片細絲與酶液充分混合，28℃避光，50 r/min輕搖7—12 h，使葉肉基本完全酶解，至酶解混合液呈現(xiàn)綠色或黃綠色為止。

酶解終止后，用槍頭吸取酶解混合液至孔徑為30 μm的尼龍網(wǎng)過濾至50 mL離心管中，加入等體積的W5溶液（4mmol·L-1MES、154 mmol·L-1NaCl、125 mmol·L-1CaCl2、5 mmol·L-1KCl，pH6.0）輕柔沖洗濾渣，1 000 r/min離心2 min。輕輕棄上清，加入2 mL W5重懸，1 000 r/min離心1 min，清洗，加入2 mL W5溶液輕輕懸浮，冰上放置30 min，沉淀原生質(zhì)體備用。

1.3 葉肉原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活力檢測

用0.1 mm血球計數(shù)板統(tǒng)計棉花原生質(zhì)體數(shù)目，用0.02%熒光素雙醋酸（Fluorescein Diacetate，F(xiàn)DA）測定原生質(zhì)體活力。吸取100 μL分離純化后的原生質(zhì)體懸浮液，加入濃度0.02% FDA溶液（FDA母液：5 mg·L-1FDA丙酮），取10 μL混合液滴在16×25的血球計數(shù)板上，加蓋18 mm×18 mm的蓋玻片，在熒光顯微鏡（MODEL BX51TF）40倍物鏡下鏡檢，如果原生質(zhì)體濃度過高，需稀釋到合適的濃度后再鏡檢。原生質(zhì)體數(shù)（個/mL）=（80小格內(nèi)細胞個數(shù)/80）×400×104×稀釋倍數(shù)。統(tǒng)計視野中每一中格總原生質(zhì)體數(shù)，共統(tǒng)計5個中格里原生質(zhì)體數(shù)，重復3次。立刻調(diào)熒光顯微鏡，熒光激發(fā)光波長為450—490 nm，發(fā)射波長250 nm。此時，活力高的原生質(zhì)體具有黃綠色熒光。統(tǒng)計視野中每一中格中總原生質(zhì)體數(shù)及具有活力的原生質(zhì)體數(shù)，計算原生質(zhì)體活力（%）=發(fā)黃綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)/觀察的原生質(zhì)體總數(shù)×100%。每個試驗設(shè)置3個重復，分別統(tǒng)計原生質(zhì)體的數(shù)量與活力。圖片由MODEL U-LH100HG采集。

1.4 原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化

將沉淀后的原生質(zhì)體重懸浮于MMg溶液（4 mmol·L-1MES、0.5 mol·L-1甘露醇和10 mmol·L-1MgCl2）中，濃度稀釋至1.0×106個/mL。將濃度為1 μg·μL-1質(zhì)粒DNA 15 μL加入2 mL離心管，與200 μL原生質(zhì)體-MMg懸混液混合，輕彈管底混勻，室溫放置5—10 min。加入215 μL 40% PEG4000（40% PEG4000、0.5 mol·L-1甘露醇、100 mmol·L-1CaCl2，pH8.0），輕彈管底混勻，室溫放置15 min。用W5溶液430 μL重新懸浮，輕彈管底混勻，終止轉(zhuǎn)化。1 000 r/min心2 min，棄上清。加入WI溶液（4 mmol·L-1MES、0.5 mol·L-1甘露醇、20 mmol·L-1KCl）1 mL重懸浮，并轉(zhuǎn)移至經(jīng)5% BSA預(yù)沖洗過的六孔板中，24℃培養(yǎng)12—16 h。用激光共聚焦顯微鏡（MODEL FV10C-PSU）觀察鑒定。熒光下轉(zhuǎn)化成功的原生質(zhì)體顯綠色熒光，分別統(tǒng)計熒光下和白光下視野中原生質(zhì)體數(shù)，統(tǒng)計方法同1.3，計算原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率（%）=發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)/總原生質(zhì)體數(shù)×100%。

1.5 融合蛋白表達載體構(gòu)建

根據(jù)已克隆的棉花LTP基因（，其ORF長度為324 bp）序列，設(shè)計兩端帶有dⅢ和HⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點的引物（F：5′- TTggatccATGGCTTTCAAGGTTTCAGCAATCC-3′；R：5′-TCaagcttTTAGCAGTAGTAGGTTCTGGT TGGC-3′），特異性擴增LTP基因序列，酶切后與pGreen0229-GFP載體連接，構(gòu)建融合蛋白表達載體35S:。

2 結(jié)果

2.1 棉花真葉原生質(zhì)體制備體系的優(yōu)化

參照棉花子葉原生質(zhì)體分離體系[18]進行預(yù)試驗，但無法獲得有活力的真葉原生質(zhì)體，因此對棉花子葉原生質(zhì)體分離方法進行了優(yōu)化，以獲得高活力真葉原生質(zhì)體。

2.1.1 不同濃度氯化鈣對棉花原生質(zhì)體分離的影響 首先對比擬南芥[20]和棉花原生質(zhì)體[18]酶解體系，發(fā)現(xiàn)CaCl2濃度相差10倍，而其他組分差異不大。因此，在酶解液其他組分不變的情況下，首先對比100 mmol·L-1和10 mmol·L-1CaCl2濃度酶解液酶解效果。發(fā)現(xiàn)酶解液含100 mmol·L-1CaCl2時，葉片酶解效果差，大量完整的葉片細絲無法被分解（圖1-A）；而CaCl2濃度為10 mmol·L-1酶解液能充分降解細胞壁，酶解混合液顏色明顯變綠（圖1-A），原生質(zhì)體濃度高達7.6×106個/mL。因此，選用10 mmol·L-1CaCl2為最佳酶解液成分，能獲得較理想的酶解效果。

2.1.2 滲透壓對棉花原生質(zhì)體分離的影響 滲透壓是原生質(zhì)體提取的關(guān)鍵影響因素，不同物種和組織部位所需滲透壓均不同[19]。結(jié)合前人報道，本研究對比了不同濃度甘露醇提取幼嫩真葉原生質(zhì)體效果。甘露醇為0.5 mol·L-1時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高（圖1-B），而高濃度的甘露醇條件下無法獲得理想數(shù)量的原生質(zhì)體。因此，進一步對比了0.4和0.5 mol·L-1甘露醇濃度下獲得的原生質(zhì)體的活力，發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體在0.5 mol·L-1的甘露醇溶液中活力達到90%，較0.4 mol·L-1甘露醇濃度下原生質(zhì)體活力（58%）提高近一倍（圖1-C）。所以0.5 mol·L-1甘露醇能較好地維持棉花真葉原生質(zhì)體滲透壓。

A：不同濃度CaCl2酶解液酶解效果；B：甘露醇對原生質(zhì)體得率的影響（不同小寫字母表示在P＜0.05水平差異顯著。下同）；C：甘露醇對原生質(zhì)體活力的影響

2.1.3 葉齡對原生質(zhì)體分離的影響 一般嫩葉是分離原生質(zhì)體較為理想的材料，因此在棉苗第5片真葉剛展平時，同時對比第5片真葉和第4片真葉產(chǎn)生原生質(zhì)體的得率，2片葉的葉齡相差5 d（圖2-A）。利用含10 mmol·L-1CaCl2和0.5 mol·L-1甘露醇的酶解液充分酶解后，發(fā)現(xiàn)以第5片真葉為材料產(chǎn)生的原生質(zhì)體濃度是以第4片真葉為材料時的2倍以上（圖2-B），且幼嫩葉片獲得的原生質(zhì)體較老葉大小合適、細胞碎片少（圖2-C—圖2-D）。因此，剛展平的真葉為最佳外植體材料，能獲得高質(zhì)量原生質(zhì)體濃度6.0×106個/mL以上。

A：取樣真葉；B：不同葉齡原生質(zhì)體產(chǎn)量；C：老葉原生質(zhì)體；D：幼葉原生質(zhì)體

2.1.4 酶解時間對棉花原生質(zhì)體分離的影響 為探究合適的酶解時間，在上述條件下，分別酶解5、7、9、10和12 h后檢測原生質(zhì)體的產(chǎn)量及活力。結(jié)果表明，酶解7 h內(nèi)原生質(zhì)體緩慢從葉肉組織分離，產(chǎn)量變化不大（圖3-A和圖3-B），酶解9 h時原生質(zhì)體的產(chǎn)量達到最高，為7.60×106個/mL，且細胞形態(tài)良好，極少有破碎細胞（圖3-A和圖3-C），酶解時間繼續(xù)延長，前期酶解的原生質(zhì)體開始破碎（圖3-D和圖3-E），原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著下降（圖3-A）。因此，選擇9 h作為適合的酶解時間。

2.1.5 原生質(zhì)體分離及活力檢測結(jié)果 根據(jù)以上試驗結(jié)果，棉花真葉原生質(zhì)體分離的最優(yōu)體系為：剛展平的真葉，含有1.5%纖維素酶、0.4%離析酶的W5溶液（0.5 mol·L-1甘露醇、20 mmol·L-1KCl、20 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1CaCl2和1.0 g·L-1BSA），28℃避光，50 r/min輕搖9 h。利用離心法將原生質(zhì)體收集后加W5溶液重懸得到濃度為（8.10±1.30）×106個/mL的棉花原生質(zhì)體。分離后的原生質(zhì)體采用FDA法檢測原生質(zhì)體的活力，在倒置顯微鏡下觀察，對原生質(zhì)體總數(shù)和發(fā)熒光的原生質(zhì)體數(shù)分別計數(shù)，計算出原生質(zhì)體的活力高達95%（圖3-F和圖3-G）。

2.2 棉花原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化

以優(yōu)化的棉花真葉原生質(zhì)體分離體系為基礎(chǔ)，參照棉花子葉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系[18]，利用PEG介導法將35S:質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到棉花原生質(zhì)體，其轉(zhuǎn)化率低于60%，大量細胞死亡和破碎，為進一步提高轉(zhuǎn)化效率，分別探究了原生質(zhì)體培養(yǎng)液、滲透壓和PEG4000濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響。

2.2.1 生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化 因轉(zhuǎn)化后大量原生質(zhì)體破碎，首先分析用40% PEG4000、0.4 mol·L-1甘露醇轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后，用WI溶液和添加0.5 mol·L-1甘露醇的W5溶液培養(yǎng)的效果。結(jié)果表明，用W5培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體盡管細胞碎片減少，但不能顯著提高轉(zhuǎn)化效率（圖4-A和圖4-B）。因此，轉(zhuǎn)化后用W5溶液繼續(xù)培養(yǎng)原生質(zhì)體有利于維持細胞活力。

A：不同酶解時間下原生質(zhì)體產(chǎn)量；B—E：酶解7—12 h得到的原生質(zhì)體；F—G：原生質(zhì)體活力檢測

為選擇轉(zhuǎn)化時合適的滲透壓，設(shè)置0.4 mol·L-1甘露醇低滲透壓和0.5 mol·L-1甘露醇等滲透壓條件下進行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率分別為（63.72±1.42）%和（90.16±3.70）%（圖4-C），等滲條件能顯著促進棉花原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率。

為確定合適的PEG4000濃度，對比了等滲條件下，30%、40%和50%的PEG4000對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響，發(fā)現(xiàn)30%和50%較40% PEG4000顯著降低了遺傳轉(zhuǎn)化效率（圖4-D），PEG4000濃度為40%是轉(zhuǎn)化的最佳選擇。

根據(jù)結(jié)果，用40% PEG4000在等滲（0.5 mol·L-1甘露醇）條件下進行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后，用添加0.5 mol·L-1甘露醇的W5溶液繼續(xù)培養(yǎng)12—16 h，能獲得轉(zhuǎn)化效率高達90%的棉花原生質(zhì)體。

2.2.2 棉花原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系驗證 為了驗證上述棉花真葉原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系，本研究對比了一個棉花基因在擬南芥和棉花原生質(zhì)體及煙草表皮細胞內(nèi)的表達情況。河北省種質(zhì)資源重點實驗室棉花遺傳育種組前期克隆了一個編碼棉花脂轉(zhuǎn)運蛋白的基因（），預(yù)測該蛋白表達部位為細胞質(zhì)和細胞膜。構(gòu)建35S:融合蛋白表達載體后，分別在棉花原生質(zhì)體（圖5-A）、擬南芥原生質(zhì)體（圖5-B）和煙草表皮細胞（圖5-C）中瞬時表達，熒光顯微鏡下GFP信號均定位在細胞質(zhì)和細胞膜，且細胞膜上GFP信號略強，說明建立的棉花真葉原生質(zhì)體分離和轉(zhuǎn)化體系可模擬棉花蛋白的體內(nèi)表達情況，可應(yīng)用于棉花功能基因組學研究。

3 討論

突變體庫、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)錄組和基因組序列的綜合利用使研究者能夠在細胞和分子水平認識植物生命活動過程。近年來，棉花基因組學迅猛發(fā)展，多個高質(zhì)量棉花參考基因組序列相繼公布，推動棉花基礎(chǔ)研究進入了以基因功能研究為標志的后基因組階段，大量基因的功能有待挖掘，基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待深入解析。受限于遺傳轉(zhuǎn)化率低和突變體庫的匱乏，棉花功能基因組研究進展緩慢，亟待一種高通量快速研究基因功能的方法。植物原生質(zhì)體被廣泛用于體細胞雜交[21-23]、植物細胞生理研究和基因功能分析[24]等。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，原生質(zhì)體的優(yōu)勢更加突出[25-27]。此外，Jin等[28]利用葉片原生質(zhì)體建立了快速篩選γ射線誘導突變體的方法，并培育了耐鹽煙草突變株。原生質(zhì)體還被用于探究玉米代謝產(chǎn)物合成及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[13]，以及大豆轉(zhuǎn)錄因子全基因組調(diào)控位點的篩選[29]。但目前缺少棉花真葉原生質(zhì)體高效瞬時轉(zhuǎn)化的方法，限制了棉花原生質(zhì)體在功能基因組學研究中的應(yīng)用。本研究在李妮娜等[18]棉花子葉原生質(zhì)體分離和瞬時轉(zhuǎn)化體系基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化CaCl2濃度、葉齡、滲透壓、酶解時間和PEG4000濃度，建立了高效分離棉花真葉原生質(zhì)體和瞬時轉(zhuǎn)化的方法，原生質(zhì)體得率提高近10倍，活力高達95%，轉(zhuǎn)化效率顯著提高到90%。

A、C、D：培養(yǎng)液類型、甘露醇和PEG濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響；B：熒光顯微鏡下的轉(zhuǎn)化結(jié)果

A：棉花真葉原生質(zhì)體；B：擬南芥葉片原生質(zhì)體；C：煙草表皮細胞

酶解法是常用分離植物原生質(zhì)體的方法，盡管酶種類是分離原生質(zhì)體的關(guān)鍵，但普遍采用纖維素酶+離析酶的組合[19]。本研究采用纖維素酶和離析酶組合的酶解液，獲得了理想的棉花真葉原生質(zhì)體分離效果。研究者們普遍認為分離高質(zhì)量原生質(zhì)體的關(guān)鍵是對滲透壓、酶解時間、葉齡的把控[30-32]，卻忽視了CaCl2對原生質(zhì)體的影響。CaCl2有穩(wěn)定質(zhì)膜的作用，趙嚴偉[33]分析發(fā)現(xiàn)CaCl2處理洗液對原生質(zhì)體活力無顯著影響，CaCl2對原生質(zhì)體數(shù)量的影響取決于洗液種類和濃度。而朱俊等[34]發(fā)現(xiàn)低濃度和高濃度CaCl2均會抑制煙草原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力，而其濃度對原生質(zhì)體活力的影響更顯著。本研究對比了含100和10 mmol·L-1CaCl2的酶解液酶解效果（圖1-A），發(fā)現(xiàn)高濃度CaCl2顯著抑制了酶解，且細胞破碎較多，含10 mmol·L-1CaCl2的酶解液能有效地促進原生質(zhì)體的分離，細胞形態(tài)良好，這一規(guī)律與前人的研究結(jié)果一致[33-34]。此外葉齡在原生質(zhì)體的獲取中也至關(guān)重要，一般認為幼嫩組織是分離原生質(zhì)體的理想材料，前人已從棉花愈傷組織[35]、懸浮細胞[36]和子葉中分離了原生質(zhì)體[18,37]。但這些組織都是特殊時期或狀態(tài)下的細胞，不能代表植株自然生長狀態(tài)下基因和蛋白的時空表達特征。本研究以正常生長的真葉作為制備原生質(zhì)體的材料，結(jié)果表明，剛展平的嫩葉能獲得大量高活力的優(yōu)質(zhì)原生質(zhì)體。所得原生質(zhì)體可以模擬棉花細胞的基因和蛋白水平，利用特定時期或處理下葉片獲得的原生質(zhì)體進行基因功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究，能夠極大地縮短研究時間和提高研究的準確性。

PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化具有經(jīng)濟便捷的優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于多種植物。高分子量的PEG溶液對原生質(zhì)體有毒害作用，而低濃度的PEG會降低轉(zhuǎn)化效率。對于大多數(shù)植物的原生質(zhì)體，分子量4 kD的PEG在20%—40%的濃度下就能打開細胞膜上足夠數(shù)量的通道，使外源遺傳物質(zhì)進入細胞內(nèi)，而不同植物的原生質(zhì)體細胞膜對PEG的耐受性差異不大[38]。本研究選擇分子量適中的PEG4000進行轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，40%的PEG4000轉(zhuǎn)化效果最佳（圖4-D）。低滲條件下細胞處于吸水狀態(tài)，此時外源物質(zhì)更易進入細胞內(nèi)，因此，很多植物的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時都使用了低滲溶液，如擬南芥[39]、水稻[40]、玉米[13]、楊樹[41]等，李妮娜等[18]在轉(zhuǎn)化子葉原生質(zhì)體時也采用了0.4 mol·L-1甘露醇的低滲溶液。但本研究對比了等滲和低滲條件下轉(zhuǎn)化效率的差別，發(fā)現(xiàn)等滲條件更適合棉花真葉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，提高了原生質(zhì)體的存活率，能獲得更好的轉(zhuǎn)化效果。此外，轉(zhuǎn)化后原生質(zhì)體的培養(yǎng)大多采用WI溶液，本研究用WI溶液培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)細胞破碎，活力下降。前人對比發(fā)現(xiàn)W5溶液維持細胞活性最優(yōu)[31]，本體系改用含0.5 mol·L-1甘露醇的W5溶液培養(yǎng)后，原生質(zhì)體活力及細胞形態(tài)維持良好。對比兩種溶液，W5溶液含Ca2+，能更好地維持原生質(zhì)體質(zhì)膜的穩(wěn)定性。本研究在最優(yōu)組合條件下，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率達到90%，同擬南芥90%的轉(zhuǎn)化率一致[38]，獲得的轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體是進行棉花功能基因組學研究的良好材料。

4 結(jié)論

建立了棉花真葉原生質(zhì)體的分離與瞬時表達體系。選取剛展平的棉花真葉為外植體材料，在1.5%纖維素酶和0.4%離析酶液組合，0.5 mol·L-1甘露醇滲透壓下、10 mmol·L-1CaCl2、1 g·L-1小牛血清蛋白，28℃黑暗振蕩酶解9 h，獲得大小均勻、產(chǎn)量達8.10×106個/mL、活力達95%以上的棉花葉肉原生質(zhì)體。通過40% PEG4000介導15 μg目的質(zhì)粒DNA等滲條件下轉(zhuǎn)化上述原生質(zhì)體，24℃ W5溶液（添加0.5 mol·L-1甘露醇）培養(yǎng)過夜，可得到高轉(zhuǎn)化率的原生質(zhì)體。

[1] WAND K B, WAND Z W, LI F G, YE W W, WANG J Y, SONG G L, YUE Z, CONG L, SHANG H H, ZHU S L, ZOU C S, LI Q, YUAN Y L, LU C R, WEI H L, GOU C Y, ZHENG Z Q, YIN Y, ZHANG X Y, LIU K, WANG B, SONG C, SHI N, Russell J K, Richard G P, John Z Y, ZHU Y X, WANG J, YU S X. The draft genome of a diploid cotton.Nature Genetics, 2012, 44(7052): 1098-1103.

[2] WANG K, WAND D H, ZHENG X M, Qin A, Zhou J, Guo B Y, Chen Y j, Wen X P, Ye W, Zhou Y, Zhu Y X. Multi-strategic RNA-seq analysis reveals a high-resolution transcriptional landscape in cotton. Nature communications, 2019, 10(1): 4714-4729.

[3] Zhang T Z, Hu Y, Jiang W K, Fang L, Guan X Y, Chen J D, Zhang J B, Saski C A, Scheffler B E, Stelly D M, Hulse-Kemp A M, Wan Q, Liu B L, Liu C X, Wang S, Pan M Q, Wang Y K, Wang D W, Ye W X, Chang L J, Zhang W P, Song Q X, Kirkbride R C, Chen X Y, Dennis E, Llewellyn D J, Peterson D G, Thaxton P, Jones D C, Wang Q, Xu X Y, Zhang H, Wu H T, Zhou L, Mei G F, Chen S Q, Tian Y. Sequencing of allotetraploid cotton (L. acc. TM-1) provides a resource for fiber improvement. Nature biotechnology, 2015, 33(5): 531-537.

[4] Wang M J, Tu L L, Yuan D J, Zhu D, Shen C, Li J Y, Liu F Y, Pei L L, Wang P C, Zhao G N, Ye Z X, Huang H, Yan F L, Ma Y Z, Zhang L, Liu M, You J Q, Yang Y C, Liu Z P, Huang F, Li B Q, Qiu P, Zhang Q H, Zhu L F, Jin S X, Yang X Y, Min L, Li G L, Chen L L, Zheng H K, Lindsey K, Lin Z X, Udall J A, Zhang X L. Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons,and. Nature genetics, 2019, 51(2): 224-229.

[5] Huang G, Wu Z G, Richard G. P, Bai M Z, Li Y, James E. F, Hu J, Wang k, John Z. Y, Zhu Y X. Genome sequence ofand genome updates ofandprovide insights into cotton A-genome evolution. Nature Genetics, 2020, 52(5): 516-524.

[6] JASON G W, ELI R, EDWARD S B. On the road to breeding 4.0: unraveling the good, the bad and the boring of crop quantitative genomics. Annual Reveiew of Genetics, 2018, 52(26): 1-24.

[7] Zou J J, Wei F J, Wang C, Wu J J, Ratnasekera D, Liu W X, Wu W H.calcium dependent protein kinase CPK10 functions in abscisic acid and Ca2+mediated stomata regulation in response to drought stress. Plant Physiology, 2010, 154: 1232-1243.

[8] Jiang L, Wang J, Liu Z, Wang L, Zhang F, Liu G C, Zhong Q. Silencing induced by inverted repeat constructs in protoplasts of. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2010, 100: 139-148.

[9] 孫鶴, 郎志宏, 朱莉, 黃大昉. 玉米、小麥、水稻原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化. 生物工程學報, 2013, 29(2): 224-234.

Sun H, Lang Z H, Zhu L, Huang D F. Optimized condition for protoplast isolation from maize, wheat and rice leaves. Chinese Journal of Biotechnology, 2013, 29(2): 224-234. (in Chinese)

[10] Zhang H, Ni L, Liu Y P, Wang Y F, Zhang A Y, Tan M P, Jiang M Y. The C2H2-type zinc finger protein ZFP182 is involved in abscisic acid-induced antioxidant defense in rice. Journal of Integrative Plant Biology, 2012, 54: 500-510.

[11] Zhang Y, Xiao W K, Luo L J, Pang J H, Rong W, He C Z. Down regulation of OsPK1, a cytosolic pyruvate kinase, by T-DNA in sertion causes dwar?sm and panicle enclosure in rice. Planta, 2012, 235: 25-38.

[12] Xiong L, Li C, Li H y, Lyu X g, Zhao T, Liu J, Zuo Z c, Liu B.A transient expression system in soybean mesophyll protoplasts reveals the formation of cytoplasmic GmCRY1 photobody-like structures. Science China Life Sciences, 2019, 62(8): 1070-1077.

[13] Gao L, Shen G j, Zhang L d, Qi J f, C Zhang C p, Ma c r, Li J, Wang L, Saif U M, Wu J q. An efficient system composed of maize protoplast transfection and HPLC-MS for studying the biosynthesis and regulation of maize benzoxazinoids. Plant Methods, 2019, 15(1): 144-157.

[14] patience c, marie e c r. A cassava protoplast system for screening genes associated with the response to South African Cassava Mosaic Virus. Virology Journal, 2020, 17(1): 184-199.

[15] Su Y Y, Chen Y E, Chen J, Zhang Z J, Guo J Y, Cai Y, Zhu C Y, Li Z Y, Zhang H Y. Effectors off. sp. tritici suppressing the pathogenic-associated molecular pattern-triggered immune response were screened by transient expression of wheat protoplasts. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(9): 4985-5003.

[16] 張寶紅. 棉花原生質(zhì)體培養(yǎng)研究進展. 四川農(nóng)業(yè)大學學報, 1995, 13(1): 55-61.

Zhang B H. Research progress on culture of cotton protoplasts. Journal of Sichuan Agricultural University, 1995, 13(1): 55-61. (in Chinese)

[17] 孫玉強. 棉花原生質(zhì)體培養(yǎng)和原生質(zhì)體對稱融合研究. 華中農(nóng)業(yè)大學學報, 2011, 30(6): 784-786.

Sun Y Q. Research on cotton protoplasts culture and fusion. Journal of Huazhong Agricultural University, 2011, 30(6): 784-786. In Chinese.(in Chinese)

[18] 李妮娜, 丁林云, 張志遠. 棉花葉肉原生質(zhì)體分離及目標基因瞬時表達體系的建立. 作物學報, 2014, 40(2): 231-239.

Li N N, Ding L Y, Zhang Z Y. Establishment of isolation of cotton mesophll protoplast and transient expression system of target gene. The Crop Journal, 2014, 40(2): 231-239. (in Chinese)

[19] 李婧瑤, 劉龍飚, 丁兵, 楊海昕, 吳瓊, 張旸. 植物原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)研究進展. 分子植物育種, 2021: 1-20.https://kns.cnki.net/ kcms/detail/46.1068.S.20210308.1639.026.html.

Li J Y, Liu L b, Ding B, Yang H x, Wu Q, Zhang C. Research progress on plant protoplasts isolation and culture. Molecular Plant Breeding, 2021: 1-20.https://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S. 20210308.1639.026.html. (in Chinese)

[20] LI X Y. A transient expression assay usingmesophyll protoplasts. Bio-protocol, 2011, 1(10): e70.

[21] Fu L L, Yang X Y, Zhang X L, Wang Z W, Feng C H, Liu Z X, Jiang P Y, Zhang J L. Regeneration and identification of inter-specific asymmetric somatic hybrids obtained by donor-recipient fusion in cotton. Chinese Science Bulletin, 2009, 54: 2219-2227.

[22] Eeckhaut T, Van H W, Bruznican S, Leus L, Van H J. Somaclonal variation in chrysanthemum × morifolium protoplast regenerants. Frontiers in Plant Science, 2020, 11: 607171-607187.

[23] El?bieta J, Aleksandra N, Anna M. Progress towards sugar beet improvement through somatic hybridization: I. Inactivation of nuclei and cytoplasm in donor and recipient protoplasts. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 1995, 64(4): 341-347.

[24] 謝鑫, 蔣君梅, 王勇, 任明見. 高粱原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化方法研究. 種子, 2019, 38(8): 43-46.

Xie X, Jiang J M, Wang Y, Ren M J. Study on the method of protoplast isolation and transformation of Sorghum bicolor. Seed, 2019, 30(8): 43-46. (in Chinese)

[25] Sandhya D, Jogam P, Allini V R, Abbagani S, Alok A. The present and potential future methods for delivering CRISPR/Cas9 components in plants. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, 2020, 18(1): 25-36.

[26] Nicolia A, F?lt A, Hofvander P, Andersson M. Protoplast-based method for genome editing in tetraploid potato. Methods in Molecular Biology, 2021, 2264(24): 177-186.

[27] Wu S P, Zhu H C, Liu J X, Yang Q S, Shao X H, Bi F C, Hu C H, Huo H Q, Chen K L, Yi G J. Establishment of a PEG-mediated protoplast transformation system based on DNA and CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes for banana. Plant Biology, 2020, 20(1): 1-10.

[28] Jin D M, Choi S H, Lee M H, Jie E Y, Ahn W S, Joo S J, Ahn J W, Jo Y D, Ahn S J, Kim S W. Development of a rapid selection system for salt-resistant mutants of nicotiana benthamiana through protoplast culture after gamma irradiation. Plants, 2020, 9(12): 1720-1733.

[29] Huang M K, Zhang L, Zhou L M, Wang M Z, Yung W S, Wang Z L, Duan S W, Xiao Z X, Wang Q W, Wang X, Li M W, Lam H M. An expedient survey and characterization of the soybean JAGGED 1 (GmJAG1) transcription factor binding preference in the soybean genome by modified ChIP mentation on soybean protoplasts. Genomics, 2021, 113(1): 344-355.

[30] Sahab S, Hayden M J, Mason J, Spangenberg G. Mesophyll protoplasts and PEG-mediated transfections: Transient assays and generation of stable transgenic canola plants. Methods in molecular biology, 2019, 1864: 131-152.

[31] Zhou Q Y, Jiang Z H, LI Y M, Zhang T , ZHU H L, ZHAO F, Zhao Z. Mesophyll protoplast isolation technique and flow cytometry analysis of ancient. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 2019(3): 275-287.

[32] Hu Y F, Song D L, Gao L, Babatope S A, Wang Y B, Huang H H, Zhang J J, Liu H M, Liu Y H, Yu G W, Liu Y J, Li Y P, Huang Y B. Optimization of isolation and transfection conditions of maize endosperm protoplasts. Plant Methods, 2020, 16(1): 1-15.

[33] 趙嚴偉, 黃志剛, 李合松. 洗液對擬南芥葉原生質(zhì)體分離的影響. 中國農(nóng)學通報, 2011, 27(12): 187-190.

Zhao Y W, Huang Z G, Li H S. EffectS of washing solution on protoplast isolation fromleave. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2011, 27(12): 187-190. (in Chinese)

[34] 朱俊, 聶瓊, 楊川龍, 陳茜. 不同質(zhì)膜穩(wěn)定劑對煙草原生質(zhì)體細胞壁再生的影響. 山地農(nóng)業(yè)生物學報, 2012, 31(3): 222-227.

Zhu J, Nie Q, Yang C L, Chen X. Effects of different plasma membrane stabilizers on cell wall regeneration of tobacco protoplasts. Journal of Mountain Agriculture and Biology, 2012, 31(3): 222-227. (in Chinese)

[35] 王喆之, 張?zhí)K鋒, 胡正海. 陸地棉胚性愈傷組織原生質(zhì)體的制備、培養(yǎng)及植株再生. 植物學報, 1998, 40: 234-240.

Wang Z Z, Zhang S F, Hu Z H. Production, culture and plant regeneration of protoplasts from embryogenic callus of. Journal of Integrative Plant Biology, 1998, 40: 234-240. (in Chinese)

[36] Yang X Y, Zhang X L, Jin S X, Fu L L, Wang L G. Production and characterization of asymmetric hybrids between upland cotton Coker 201 () and wild cotton (). Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2007, 89(2/3): 225-235.

[37] 李仁敬, 張忠新, 石玉瑚. 棉花葉肉原生質(zhì)體的分離初報. 遺傳, 1980, 2(4): 36-37.

Li R J, Zhang Z X, Shi Y H. Reports of isolation of cotton mesophyll protoplast. Heridity, 1980, 2(4): 36-37. (in Chinese)

[38] 曾弓劍, 程云偉, 韓少鵬, 呂陽, 陸業(yè)磊, 周超, 張德春, 沈祥陵. 高粱品種BTx623原生質(zhì)體分離及瞬時表達體系的建立. 生物資源, 2021, 43(1): 42-49.

Zeng G J, Cheng Y W, Han S P, Lü Y, Lu Y L, Zhou C, Zhang D C, Shen X L. The establishment of protoplast isolation and transient expresion system in sorghum cultivar BTx623. Biotic Resources, 2021, 43(1): 42-49. (in Chinese)

[39] Yoo S D, Cho Y, Sheen J.mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature Protocols, 2007(2): 1565-1572.

[40] Zhang Y, Su J B, Duan S, Ao Y, Dai J R, Liu J, Wang P, Li Y G, Liu B, Feng D R, Wang J F, Wang H B. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods, 2011, 7(1): 30-44.

[41] Guo J J, Morrell-Falvey J L, Labbé J L, Muchero W, Kalluri U C, Tuskan G A, Chen J G. Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays. PloS one, 2012, 7(9): 44908-44917.

Optimization of Cotton Mesophyll Protoplast Transient Expression System

LI Qing, YU HaiPeng, ZHANG ZiHao, SUN ZhengWen, ZHANG Yan, ZHANG DongMei, WANG XingFen, MA ZhiYing, YAN YuanYuan

College of Agronomy, Hebei Agricultural University/State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Hebei, Baoding 071001, Hebei

【】Cells of true leaves can well mimic the plant endogenous situation. It is an efficient way for expediting cotton functional study to establish an effective transient expression system using cotton protoplasts obtained from true leaves.【】The enzyme combination of cellulose and macerozyme were used to isolate protoplasts from true leaves ofL. acc. TM-1. The effects of osmotic pressure, components of digestion buffer and digestion time on protoplast yield were studied and the validity of protoplasts were compared under different mannitol concentration and digestion time. To improve the transformation efficiency of cotton protoplast, the effects of mannitol and PEG concentration and buffers for protoplast culture were subsequently studied. In order to verify the optimized transient expression system, the vector 35S:was constructed and transformed into protoplasts ofand cotton and tobacco epidermal cells followed by observation of fusion protein localization.【】High concentration of CaCl2in the digestion buffer significantly inhibited the isolation of protoplast from cotton true leaves, which was opposite of that using cotyledon. 10 mmol·L-1CaCl2was employable for digestion buffer to isolate cotton protoplasts from true leaves. Mannitol concentration significantly affected protoplast yield that peaked under mannitol concentration of 0.5 mol·L-1,and protoplast validity decreased moiety under 0.4 mol·L-1mannitol, suggesting that 0.5 mol·L-1mannitol was most suitable to maintain the osmotic pressure of cotton protoplasts. Cotton protoplasts displayed suitable size when isolated from newly flattened true leaves, while protoplast enlarged and yield decreased when produced from young leaves flattened 5 days. The protoplasts dissociate slowly until being digested 9 h when the yield reached the peak. The transformation efficiency was greatly improved under isotonic condition of 40% PEG buffer. While hypotonic condition that is commonly applied to facilitate transformation was against the entrance of exogenous DNA into cotton protoplasts. After transformation, the protoplast ruptured abundantly in WI buffer，whereas the shape maintained well in W5 buffer adding 0.5 mol·L-1mannitol. The transformation efficiency was improved to 90% using the optimized transient expression system. The subcellular location analysis results showed consistent GFP signal in protoplasts of cotton andtrue leaf and epidermal cells of tobacco leaf.【】Our study has optimized the cotton mesophyll protoplast transient expression system, which could produce 8.10×106·mL-1fine protoplasts with validity above 95% and transformation efficiency reached to 90%. This system is applicable for analysis of subcellular location, protein interaction and research on metabolism and regulation network.

cotton; TM-1; isolation of protoplasts; transient expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.21.003

2021-04-25；

2021-06-24

河北省教育廳科學技術(shù)研究重點項目（ZD2018057）、河北省自然科學基金（C2020204079）、河北農(nóng)業(yè)大學引進留學博士專項（ZD201601）

李青，E-mail：1580321058@qq.com。通信作者閻媛媛，E-mail：selina3001630016@163.com

（責任編輯 李莉）