胡林義 張春花 吳 玲 魏善闖 劉 英 方 芳

(江蘇省淮安市婦幼保健院婦科，淮安市 223002，電子郵箱：hulinyi223002@163.com)

子宮內(nèi)膜異位癥是指有活性的內(nèi)膜細(xì)胞種植在子宮內(nèi)膜以外的位置而引起的婦科疾病，是中青年婦女的常見病之一，主要臨床癥狀為痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、慢性盆腔疼痛，嚴(yán)重者可影響生殖系統(tǒng)功能，造成不孕。子宮內(nèi)膜異位癥一般為良性病變，但具有惡性腫瘤的生物學(xué)特性，如浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等[1]。因此，尋找能特異性地評(píng)估子宮內(nèi)膜異位患者病情發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)標(biāo)志物，具有重要的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA)通過靶向調(diào)控mRNA表達(dá)，參與機(jī)體病理生理的各個(gè)過程[2]。有研究顯示，miRNA-92a在卵巢癌中異常表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡[3]，而子宮內(nèi)膜異位癥惡變后約有80%進(jìn)展為卵巢癌[4]。人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 gene，PTEN)可參與細(xì)胞周期的調(diào)控，在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等婦科疾病中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[5]。本研究通過檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥患者血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平、PTEN水平，探討其與患者預(yù)后之間的關(guān)系，以期為臨床評(píng)估子宮內(nèi)膜異位癥患者的預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2019年12月于本院婦產(chǎn)科行腹腔鏡手術(shù)的200例子宮內(nèi)膜異位癥患者為研究組，均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診，年齡26～43(34.57±5.63)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)月經(jīng)規(guī)律，無內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病；(2)術(shù)前3個(gè)月內(nèi)無內(nèi)分泌類、激素類或抗生素類藥物治療史；(3)非妊娠患者；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他子宮疾??；(2)哺乳期患者；(3)有精神類疾?。?4)合并惡性腫瘤。另選擇同期于我院行腹腔鏡子宮肌瘤切除術(shù)的120例患者為對(duì)照組，年齡25～41(33.83±4.27)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均確診為子宮肌瘤；(2)臨床資料完整；(3)符合腹腔鏡手術(shù)指征。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他婦科或內(nèi)分泌疾病者；(2)妊娠、哺乳或絕經(jīng)期者；(3)有精神類疾病者。兩組患者的年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有患者均對(duì)本研究知情同意，本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集及處理:所有患者于入院后次日清晨抽取空腹靜脈血4 mL，4℃下3 000 r/min離心15 min后取上層清液于干凈EP管，-20℃保存待測(cè)。

1.2.2 血清miRNA-92a水平檢測(cè)：采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)患者血清miRNA-92a水平。利用TRIzol(Sigma公司，批號(hào)：20171205、20181024)提取血清總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度，以吸光度260/吸光度280值在1.8～2.0之間為純度較好，以純度較好的總RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用PrimeScript RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，批號(hào)：20171228、20181219)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格按照說明書操作步驟執(zhí)行。循環(huán)參數(shù)：95℃，預(yù)變性5 min；90℃，變性15 s；60℃，退火20 s；72℃，延伸30 s；共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，miRNA-92a上游引物為5′-ACAGGCCGGGGACAAGTGCAATA-3′，下游引物為5′-GCTGTCAACGATACGCTACGCTACGTA-3′；U6上游引物為5′-GGGCTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-GAGCGTGCAGATAATTGACAAGG-3′。利用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-92a的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 血清PTEN水平的檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)患者血清PTEN水平，試劑盒購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司(批號(hào)：20180514)，操作步驟按試劑盒說明書執(zhí)行。

1.2.4 血清雌二醇、孕酮、促卵泡激素水平的檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)患者血清雌二醇、孕酮、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)水平，試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(批號(hào)：20180107、20180625、20180316)，檢測(cè)方法參照試劑盒說明書。

1.3 子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)的判定 術(shù)后隨訪3個(gè)月，觀察子宮內(nèi)膜異位癥患者的復(fù)發(fā)情況，分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組。子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：(1)術(shù)后病灶縮小或消失，臨床癥狀緩解，但3個(gè)月后再次出現(xiàn)臨床癥狀，且恢復(fù)到治療前水平，甚至加重；(2)再次出現(xiàn)盆腔陽性癥狀，甚至加重；(3)再次出現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥病灶。符合其中之一者即判定為子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Pearson法分析復(fù)發(fā)組患者血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平、PTEN水平與內(nèi)分泌指標(biāo)之間的相關(guān)性，以及血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平與PTEN水平之間的相關(guān)性；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平、PTEN水平及二者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)的價(jià)值，曲線下面積的比較采用Z檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究組和對(duì)照組患者血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平、PTEN水平的比較 研究組患者血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，血清PTEN水平低于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 研究組和對(duì)照組患者血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平、PTEN水平的比較(x±s)

2.2 子宮內(nèi)膜異位癥患者血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平與PTEN水平之的相關(guān)性分析 子宮內(nèi)膜異位癥患者血清miRNA-92a的相對(duì)表達(dá)水平與PTEN水平之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.455，P<0.001)。

2.3 復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組患者血清miRNA-92a的相對(duì)表達(dá)水平、PTEN水平及內(nèi)分泌指標(biāo)水平的比較 術(shù)后隨訪3個(gè)月，子宮內(nèi)膜異位癥患者復(fù)發(fā)64例。復(fù)發(fā)組患者血清miRNA-92a的相對(duì)表達(dá)水平及雌二醇、孕酮、FSH水平均高于未復(fù)發(fā)組，PTEN水平低于未復(fù)發(fā)組(均P<0.05)。見表2。

表2 復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組患者血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平、PTEN水平及內(nèi)分泌指標(biāo)水平的比較(x±s)

2.4 子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)患者血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平、PTEN水平與內(nèi)分泌指標(biāo)水平的相關(guān)性分析 子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)患者血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平與雌二醇、孕酮、FSH水平均呈正相關(guān)(均P<0.05)，PTEN水平與雌二醇、孕酮、FSH水平均呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，見表3。

表3 復(fù)發(fā)組患者血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平、PTEN水平與內(nèi)分泌指標(biāo)水平的相關(guān)性分析

2.5 血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平、PTEN水平對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平、PTEN水平預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)的曲線下面積分別為0.831(95%CI：0.785，0.870；P=0.025)、0.867(95%CI：0.824，0.902；P=0.024)，最佳截?cái)嘀捣謩e為1.77、0.80 ng/mL，對(duì)應(yīng)的靈敏度分別為85.00%、91.00%，特異度分別為77.50%、73.33%；二者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)的曲線下面積為0.965(95%CI：0.932，0.987；P=0.007)，靈敏度和特異度分別為92.00%、90.71%。二者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)的曲線下面積高于血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平和血清PTEN水平單獨(dú)檢測(cè)(Z=4.492，P<0.001；Z=3.121，P=0.002)。見圖1。

圖1 血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平、PTEN水平及二者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)的ROC曲線

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥的病因和發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為在其病灶形成過程中，黏附性血管的形成是其病理生理基礎(chǔ)[7]。miRNA是一類非編碼內(nèi)源性小RNA分子，通過轉(zhuǎn)錄后降解mRNA或與3′端非翻譯區(qū)結(jié)合來抑制翻譯，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程[8]。研究表明，miRNA-92a在血管生成、器官發(fā)育及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用[9]。王利娟等[10]發(fā)現(xiàn)，miRNA-92a在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平升高，其可能通過靶向下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2和Survivin蛋白的表達(dá)水平，參與腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。黃曉艷等[11]的研究證實(shí)，miRNA-92a對(duì)宮頸癌有一定的診斷價(jià)值，推測(cè)miRNA-92a可作為宮頸癌篩查和監(jiān)測(cè)的潛在標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，研究組患者血清miRNA-92a的相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，且復(fù)發(fā)組患者的血清miRNA-92a的相對(duì)表達(dá)水平高于未復(fù)發(fā)組(P<0.05)，提示miRNA-92a在子宮內(nèi)膜異位癥患者中異常高表達(dá)，其高表達(dá)可能通過促進(jìn)黏附性血管增生和病灶形成，參與病情的發(fā)生發(fā)展過程，對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生不良影響。

PTEN作為一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，參與調(diào)控細(xì)胞周期，在抑制細(xì)胞過度增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用[12]，但其抑制細(xì)胞增殖的具體機(jī)制尚不明了。有學(xué)者猜測(cè)，抑癌基因PTEN可能是一種促凋亡因子[13]，可誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)正?；虍惓５募?xì)胞凋亡。子宮內(nèi)膜異位癥常發(fā)生于卵巢，具有惡變傾向，可發(fā)展為子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)卵巢癌。苗蕓等[14]發(fā)現(xiàn)，PTEN在卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率明顯低于卵巢交界性腫瘤組織，而PTEN陽性患者的總生存時(shí)間長(zhǎng)于PTEN陰性患者，提示PTEN低表達(dá)的卵巢癌患者預(yù)后更差。Russo等[15]的研究顯示，PTEN缺失可導(dǎo)致細(xì)胞遷移、侵襲作用加強(qiáng)及關(guān)鍵調(diào)控因子WNT4表達(dá)上調(diào)，該發(fā)現(xiàn)有助于明確卵巢癌早期階段的發(fā)病機(jī)制，具有重要的臨床意義。本研究結(jié)果顯示，研究組患者PTEN水平低于對(duì)照組，復(fù)發(fā)組患者PTEN水平低于未復(fù)發(fā)組(P<0.05)，與陳華等[16]的研究結(jié)果相似。子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能是多個(gè)因素、多條通路相互影響的結(jié)果。趙曦雯等[17]利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)PTEN為miRNA-92a的一個(gè)下游靶點(diǎn)，miRNA-92a通過與PTEN 3′-非翻譯區(qū)結(jié)合來靶向負(fù)調(diào)控PTEN在平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平與PTEN水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示miRNA-92a可能通過靶向負(fù)調(diào)控PTEN的表達(dá)，參與子宮異位癥患者病變細(xì)胞的增殖、凋亡過程，高水平的miRNA-92a抑制PTEN蛋白表達(dá)，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

既往研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生與雌激素水平密切相關(guān)[18]，雌激素分泌紊亂可能誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞分裂異常，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異常增生，進(jìn)而發(fā)生病變。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)組患者的血清雌二醇、孕酮、FSH水平均高于未復(fù)發(fā)組(均P<0.05)，這可能是由于復(fù)發(fā)組患者子宮內(nèi)膜異位病灶重新出現(xiàn)或增多，雌激素不斷累積，導(dǎo)致垂體負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用敏感性減弱，從而使血清雌二醇、孕酮、FSH水平升高。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)患者的血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平與雌二醇、孕酮、FSH水平均呈正相關(guān)，PTEN水平與雌二醇、孕酮、FSH水平均呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，提示血清miRNA-92a、PTEN可能共同參與調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥患者的內(nèi)分泌代謝，促進(jìn)病變的發(fā)展進(jìn)程。本研究采用ROC曲線分析進(jìn)一步探討血清miRNA-92a、PTEN水平對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示，血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平、PTEN水平預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)的曲線下面積分別為0.831、0.867，當(dāng)miRNA-92a>1.77、PTEN<0.80 ng/mL時(shí)，子宮內(nèi)膜異位癥患者術(shù)后復(fù)發(fā)的概率較高，提示血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平和PTEN水平對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥術(shù)后復(fù)發(fā)有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值；二者聯(lián)合預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)的曲線下面積為0.965，高于血清miRNA-92a相對(duì)表達(dá)水平和血清PTEN水平單獨(dú)預(yù)測(cè)時(shí)的曲線下面積，提示聯(lián)合二者的檢測(cè)水平更有利于評(píng)估子宮內(nèi)膜異位癥患者的預(yù)后。

綜上所述，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清miRNA-92a呈高表達(dá)，PTEN呈低表達(dá)，miRNA-92a可能通過靶向負(fù)調(diào)控PTEN的表達(dá)參與患者病情的發(fā)展，二者對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值且二者聯(lián)合預(yù)測(cè)的價(jià)值更高。