劉福泉，郝麗嬌，王 維，柳 凈，劉 尊，董珊珊

(1.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校健康管理與服務(wù)系，河北 滄州 061001；2.滄州市婦幼保健院手術(shù)室，河北 滄州 061001)

竇房結(jié)是心臟正常的起搏位點(diǎn)，對心功能起著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，長期高脂飲食可造成脂肪過度向心內(nèi)浸潤，當(dāng)脂肪浸潤到竇房結(jié)會使其結(jié)構(gòu)功能發(fā)生變化，神經(jīng)受損，動脈狹窄，影響心臟功能，嚴(yán)重時(shí)可致死亡[2]。有研究報(bào)道，通過長期有規(guī)律的有氧運(yùn)動能夠降低體內(nèi)脂肪含量[3]，但有關(guān)運(yùn)動能否抑制脂肪向心臟浸潤鮮有報(bào)道?；诖?，本研究從竇房結(jié)組織形態(tài)變化、脂肪浸潤量及竇房結(jié)神經(jīng)變化，探討不同強(qiáng)度運(yùn)動對長期高脂飲食引發(fā)的不良心臟功能的保護(hù)作用，旨在為健身鍛煉提供科學(xué)的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物無特定病原級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只，體質(zhì)量(191.23±9.84)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大鼠于無特定病原級動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飲用雙蒸水，室溫為(23±2)℃，空氣濕度為40%～70%，分籠飼養(yǎng)，每籠 3只，共8籠。

1.2 試劑與儀器蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gene product 9.5,PGP 9.5)抗體購自北京博奧森生物科技有限公司，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染液、油紅O染液購自南京建成生物工程研究所；Vevo2100型小動物彩色多普勒超聲診斷儀購自加拿大VisualSonics公司，石蠟包埋機(jī)、冰臺、石蠟切片機(jī)、攤片機(jī)、全自動組織脫水機(jī)購自德國萊卡公司，光學(xué)顯微鏡、彩色數(shù)碼CCD攝像頭購自德國麥克奧迪公司，電子天平購自上海天平儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組與處理將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)(國家標(biāo)準(zhǔn)顆粒型固體大鼠飼料)1周后，隨機(jī)分為A、B、C、D組，每組6只。A組大鼠給予普通飼料飼養(yǎng)；B組、C組和D組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]配制(質(zhì)量分?jǐn)?shù)):普通飼料 54.5%、蔗糖20.0%、蛋黃粉15.0%、豬油9.0%、膽固醇1.0%、膽酸鈉0.5%。C組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)給予運(yùn)動訓(xùn)練，運(yùn)動方法采用游泳訓(xùn)練法[5-6]：水深為大鼠身體長度的2倍，水溫控制在(33±2)℃，每次放入水中3只大鼠，保證每只大鼠至少占有 0.05 m2的水面。實(shí)驗(yàn)過程中為保持運(yùn)動強(qiáng)度以小棍驅(qū)趕大鼠運(yùn)動，每天確保在同一時(shí)間進(jìn)行訓(xùn)練。正式訓(xùn)練前，第1周進(jìn)行適應(yīng)性游泳，每天逐漸增加游泳時(shí)間，第1周末游泳時(shí)間達(dá)到1 h；第2周開始正式實(shí)驗(yàn)，每日60 min，每周6 d，持續(xù)訓(xùn)練8周。D組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)給予運(yùn)動訓(xùn)練，第1周適應(yīng)性游泳訓(xùn)練后，逐漸增加負(fù)重進(jìn)行5%體質(zhì)量負(fù)重游泳，其余運(yùn)動訓(xùn)練方法同C組，每日60 min，每周6 d，持續(xù)訓(xùn)練8周。

1.3.2 大鼠心功能測試干預(yù)8周后，清除各組大鼠胸部毛發(fā)，使用體積分?jǐn)?shù)2%異氟烷吸入麻醉，應(yīng)用Vevo2100型小動物彩色多普勒超聲診斷儀測量大鼠左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVDS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVDD)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume，LVVS)、每搏輸出量(stroke volume，SV)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fractions，LVEF)、左心室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular shortening fraction，LVSF)。

1.3.3 大鼠竇房結(jié)取材及形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察末次游泳24 h后，各組大鼠用體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛(0.04 mL·g-1)麻醉，取心臟，右心耳側(cè)朝上固定，以界溝為中心左右各5 mm平行剪開，上下腔靜脈處平行剪開，得一條形組織即為竇房結(jié)。取竇房結(jié)用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇固定15 min，自來水沖洗1 min，蘇木精染色15 min，自來水沖洗1 min，伊紅染色35 s，自來水沖洗1 min，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片，顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.4 油紅O染色法檢測大鼠竇房結(jié)脂肪細(xì)胞分布及含量采用油紅O染色法測量竇房結(jié)區(qū)脂肪細(xì)胞分布[7-8]：取竇房結(jié)組織，冰凍切片機(jī)切取15 μm 厚組織并貼于載玻片上，待組織恢復(fù)室溫，蒸餾水沖洗2 s，體積分?jǐn)?shù)60%異丙醇浸洗2 s，油紅O染液浸染10 min，體積分?jǐn)?shù)60%異丙醇浸染分色2 s；蒸餾水洗滌1 s，蘇木精復(fù)染2 min，自來水水洗10 min，蒸餾水沖洗 1 s，濾紙吸干水分，甘油封片，光鏡下觀察竇房結(jié)脂肪細(xì)胞分布，紅色為脂肪細(xì)胞，應(yīng)用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行竇房結(jié)脂肪細(xì)胞染色陽性面積定量分析，計(jì)算整個(gè)視野內(nèi)選定對象的面積總和[9-10]。

1.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠竇房結(jié)神經(jīng)標(biāo)志物PGP 9.5表達(dá)應(yīng)用ABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：取竇房結(jié)組織，使用全自動脫水機(jī)脫水、浸蠟、包埋，采用Leica石蠟切片機(jī)對組織蠟塊進(jìn)行厚度為 5 μm 連續(xù)切片，每隔10張選1張，連續(xù)取4張，置于60 ℃ 恒溫干燥箱烘片1 h，乙醇脫蠟水化后將組織放入含有修復(fù)液的高壓鍋中加熱，有蒸汽冒出時(shí)開始計(jì)時(shí)3 min，修復(fù)完成后，自然冷卻至37 ℃左右，磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)反復(fù)清洗，滴加山羊血清，靜置20 min，滴加PGP 9.5 一抗，4 ℃過夜，PBS清洗，滴加二抗(SAB),PBS清洗，滴加DAB顯色劑，顯微鏡觀察，判斷顯色程度，自來水沖洗，蘇木精染色，溫水反藍(lán)，二甲苯透明，顯微鏡觀察，應(yīng)用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行PGP 9.5染色陽性面積定量分析，計(jì)算整個(gè)視野內(nèi)選定對象的面積總和[9-10]。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠心臟功能比較結(jié)果見表1。4組大鼠LVDS、LVDD、LVVS、SV、LVEF、LVSF比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.840、6.698、4.884、15.333、17.293、41.025，P<0.05)。B組大鼠LVDS、LVDD、LVVS顯著高于A組，SV、LVEF、LVSF顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組大鼠LVDS、LVDD、LVVS、SV、LVEF與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);C組大鼠LVSF顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組大鼠LVDS、LVDD、LVVS顯著低于B組，SV、LVEF、LVSF顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D組大鼠SV顯著低于A組，LVSF顯著高于A組，LVEF、LVSF顯著高于B組，SV顯著低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組大鼠其余心功能指標(biāo)分別與A組、B組及C組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 4組大鼠心功能指標(biāo)比較

2.2 4組大鼠竇房結(jié)組織結(jié)構(gòu)變化結(jié)果見圖1。A組大鼠竇房結(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)豐富染色均勻，細(xì)胞間隙正常。B組大鼠竇房結(jié)結(jié)構(gòu)缺失，細(xì)胞間隙明顯增寬、肌纖維排列混亂。C組大鼠竇房結(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)良好，細(xì)胞間隙均勻較窄，細(xì)胞質(zhì)染色均勻。與C組相比，D組大鼠竇房結(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)欠佳，細(xì)胞間隙略增寬。

圖1 4組大鼠竇房結(jié)組織結(jié)構(gòu)(HE染色，×40)

2.3 4組大鼠竇房結(jié)區(qū)脂肪細(xì)胞分布及其含量比較結(jié)果見圖2。油紅O染色結(jié)果顯示，竇房結(jié)區(qū)脂肪細(xì)胞呈橘紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。與A組相比，B組、C組、D組大鼠竇房結(jié)區(qū)均出現(xiàn)大面積脂肪浸潤，B組脂肪浸潤最為嚴(yán)重，D組次之，C組較輕。A組、B組、C組、D組大鼠竇房結(jié)區(qū)脂肪細(xì)胞表達(dá)量分別為(675.5±53.16)、(3 263.00±560.53)、(1 007.75±230.88)、(2 227.12±632.43)mm2。4組大鼠竇房結(jié)區(qū)脂肪細(xì)胞陽性表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.657，P<0.05)。B組、C組、D組大鼠竇房結(jié)區(qū)脂肪細(xì)胞陽性表達(dá)量顯著高于A組，B組大鼠竇房結(jié)區(qū)脂肪細(xì)胞陽性表達(dá)量顯著高于C組和D組，D組大鼠竇房結(jié)區(qū)脂肪細(xì)胞陽性表達(dá)量顯著高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 4組大鼠竇房結(jié)區(qū)脂肪細(xì)胞染色結(jié)果(油紅O染色，×10)

2.4 4組大鼠竇房結(jié)區(qū)PGP9.5陽性表達(dá)及表達(dá)量的比較結(jié)果見圖3。PGP9.5免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕灰色，神經(jīng)組織多呈團(tuán)塊狀。A組大鼠神經(jīng)細(xì)胞最多且棕色較重，呈聚集狀；其次依次為C組、D組、B組，且棕色逐漸變淡。A組、B組、C組、D組大鼠竇房結(jié)區(qū)PGP9.5陽性表達(dá)量分別為(3 348.1±429.19)、(698.9±62.24)、(3 198.5±264.17)、(1 895.2±97.28)mm2。4組大鼠竇房結(jié)區(qū)PGP9.5陽性表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.476，P<0.05)。A組大鼠竇房結(jié)區(qū)PGP9.5陽性表達(dá)量顯著高于B組和D組，C組和D組大鼠竇房結(jié)區(qū)PGP9.5陽性表達(dá)量顯著高于B組，C組大鼠竇房結(jié)區(qū)PGP9.5陽性表達(dá)量顯著高于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 4組大鼠竇房結(jié)組織PGP9.5表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×10)

3 討論

脂肪組織是人體最大的旁分泌與內(nèi)分泌器官，能夠分泌多種具有生物活性的脂肪細(xì)胞因子，其分泌的抵抗素、瘦素、內(nèi)脂素、脂聯(lián)素等脂肪細(xì)胞因子可夠促進(jìn)心肌細(xì)胞纖維化，嚴(yán)重影響心臟功能[11-13]。而心外膜脂肪組織是最靠近心臟的脂肪組織，包裹心臟表面的80%[14-15]，隨著年齡的增長，心外膜脂肪組織會逐漸向心臟內(nèi)部浸潤，一旦波及竇房結(jié)，將嚴(yán)重影響竇房結(jié)起搏及傳導(dǎo)功能。長期高脂飲食可造成脂肪過度向心內(nèi)浸潤，影響心臟功能。本研究結(jié)果顯示，B組大鼠心臟功能指標(biāo)中LVDS、LVDD、LVVS顯著高于A組，SV、LVEF、LVSF顯著低于A組，與王全河等[16]和王維敏[17]研究結(jié)果相同，證實(shí)長期高脂飲食可導(dǎo)致心功能顯著下降。本研究結(jié)果顯示，與A組比較，B組大鼠竇房結(jié)結(jié)構(gòu)缺失，細(xì)胞間隙明顯增寬、肌纖維排列混亂；竇房結(jié)區(qū)出現(xiàn)大面積脂肪浸潤，脂肪細(xì)胞陽性表達(dá)量顯著增高，竇房結(jié)區(qū)PGP9.5陽性表達(dá)量顯著降低，說明長期高脂飲食加速了脂肪組織向心內(nèi)浸潤，導(dǎo)致竇房結(jié)結(jié)構(gòu)缺失，細(xì)胞間隙明顯增寬、肌纖維排列混亂，內(nèi)部出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪浸潤，致使竇房結(jié)結(jié)構(gòu)功能發(fā)生變化、神經(jīng)受損、動脈狹窄等，從而影響心臟功能。

長期系統(tǒng)有規(guī)律的運(yùn)動能夠改變心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)，并使其功能發(fā)生一系列的適應(yīng)性變化，從而進(jìn)一步增強(qiáng)心臟泵血功能。本研究結(jié)果顯示，與B組相比，C組、D組大鼠LVDS、LVDD、LVVS顯著低于H組，SV、EF顯著高于B組；D組大鼠僅LVSF顯著高于B組；D組大鼠心臟功能指標(biāo)LVDS、LVDD、LVVS略高于C組，EF、LVSF略低于C組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D組大鼠SV顯著低于C組。這一結(jié)果說明，通過有規(guī)律的運(yùn)動能夠抑制高脂飲食造成的心功能下降現(xiàn)象，且有氧運(yùn)動對心功能改善的效果要好于高強(qiáng)度運(yùn)動。運(yùn)動可增加能量消耗，降低體內(nèi)脂肪含量。馬伏英等[18]研究認(rèn)為，有氧運(yùn)動能夠調(diào)節(jié)脂肪代謝，減少脂肪堆積；BAE等[19]和劉子銘等[20]研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動能夠降低體內(nèi)脂肪含量；MATSUNAGE等[21]和CHIU等[22]研究發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度運(yùn)動能夠降低體內(nèi)脂肪含量。本研究結(jié)果顯示，與B組相比，C組、D組大鼠脂肪浸潤現(xiàn)象顯著減輕，竇房結(jié)脂肪含量顯著降低；與C組相比，D組大鼠竇房結(jié)區(qū)脂肪含量顯著降低，D組大鼠竇房結(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)欠佳，細(xì)胞間隙略增寬；這證實(shí)長期有規(guī)律的有氧運(yùn)動能加速體內(nèi)脂肪消耗，減輕體內(nèi)脂肪過多堆積，阻止脂肪向竇房結(jié)的浸潤，且其效果好于高強(qiáng)度運(yùn)動。

竇房結(jié)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量直接影響竇房結(jié)搏動及傳導(dǎo)功能，進(jìn)而影響心臟功能。有關(guān)運(yùn)動對神經(jīng)影響的研究已證實(shí)，有氧運(yùn)動可以通過促使心內(nèi)神經(jīng)體積變大且數(shù)量增加來抵抗由于年齡增加導(dǎo)致的神經(jīng)退行性變化[23]，有規(guī)律的運(yùn)動能夠通過調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞因子的分泌及表達(dá)，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)[24]；但長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，且神經(jīng)元細(xì)胞周圍空泡增多[25]。PGP9.5是神經(jīng)標(biāo)志物，其特異性染色為神經(jīng)系統(tǒng)研究提供了高質(zhì)量的技術(shù)，可特異性標(biāo)志神經(jīng)纖維及神經(jīng)細(xì)胞，因此，本研究采用PGP9.5免疫組織化學(xué)來標(biāo)記竇房結(jié)內(nèi)部神經(jīng)的變化，分析高脂飲食及運(yùn)動對竇房結(jié)神經(jīng)的影響。本研究結(jié)果顯示，C組和D組大鼠竇房結(jié)PGP9.5陽性表達(dá)量顯著高于B組，空泡程度減輕，說明有規(guī)律的運(yùn)動消耗了體內(nèi)脂肪，同時(shí)增加了細(xì)胞的抗氧化性，使竇房結(jié)神經(jīng)損害得到改善；C組大鼠竇房結(jié)PGP9.5陽性表達(dá)量顯著高于D組，說明長期有規(guī)律的有氧運(yùn)動更能有效抑制脂肪浸潤造成的竇房結(jié)神經(jīng)纖維化、促使竇房結(jié)神經(jīng)重塑。

綜上所述，長期有規(guī)律的有氧運(yùn)動能夠顯著減輕高脂飲食引起的竇房結(jié)脂肪浸潤，促使竇房結(jié)神經(jīng)重塑，維持正常竇房結(jié)組織結(jié)構(gòu)及心臟功能。