朱畇昊　彭淑萍　趙樂　董誠明

摘要：通過高通量測序分析1株能夠促進(jìn)地黃生長及次生代謝產(chǎn)物積累的內(nèi)生尖孢鐮刀菌的基因組結(jié)構(gòu)，推測其內(nèi)生及促生機(jī)制。使用Illumina Hiseq X ten雙端測序技術(shù)對(duì)內(nèi)生真菌GG22進(jìn)行基因組測序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。分析結(jié)果，共得到17 296個(gè)預(yù)測的基因，其中基因的總長度26 937 813 bp，平均基因長度為1 557.4 bp。與KOG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr及Pfam常用功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，共有17 202個(gè)基因得到功能注釋，注釋率為99.46%，其中有3 801個(gè)基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中;7 431個(gè)基因注釋到KOG數(shù)據(jù)庫中;11 548個(gè)基因注釋到 Pfam 數(shù)據(jù)庫中;9 007個(gè)基因注釋到 Swissprot數(shù)據(jù)庫中;17 201個(gè)基因注釋到TrEMBL數(shù)據(jù)庫中，且分別有881、5 247、158個(gè)基因被注釋到CAZyme、PHI、TCDB數(shù)據(jù)庫?；蚬δ芊诸惙治霭l(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌GG22的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)不發(fā)達(dá)，這可能是其成為地黃塊根寄生內(nèi)生菌的原因之一。基因簇分析得出，GG22可能能夠產(chǎn)生碧卡維林等化合物而抑制其他微生物的生長，同時(shí)保護(hù)寄主植物免受其他病原菌的侵害，成為地黃促生內(nèi)生真菌。通過對(duì)GG22基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，初步獲得了其內(nèi)生性生物學(xué)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步闡明其促進(jìn)地黃生長及次生代謝產(chǎn)物積累奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：地黃;內(nèi)生真菌;尖孢鐮刀菌;基因組;次生代謝

中圖分類號(hào)：S567.23+9.01;S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2021）19-0072-06

地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）是玄參科地黃屬多年生草本植物，常以干燥塊根入藥，是中醫(yī)常用的中藥材之一。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期從野生地黃中分離出1株內(nèi)生真菌GG22，經(jīng)鑒定其為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。有研究報(bào)道，尖孢鐮刀菌可作為土傳性病原真菌侵染三七[1]、半夏[2]、大黃[3]等多種藥用植物，造成藥用植物的枯萎病或腐爛病，嚴(yán)重影響藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。本研究所使用的GG22為地黃植株內(nèi)分離獲得的內(nèi)生真菌，不會(huì)引起地黃病害，與地黃共生后能顯著提高地黃的株高、株幅，且可顯著提高地黃植株中次生代謝產(chǎn)物的積累[4]。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，多個(gè)病原性尖孢鐮刀菌菌株已經(jīng)完成了基因組測序[5-6]，從基因組水平鑒定獲得了一系列致病相關(guān)的基因，為深入研究其致病的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。GG22作為內(nèi)生型尖孢鐮刀菌，其基因組結(jié)構(gòu)等信息還未見報(bào)道，這已經(jīng)成為深入了解GG22的內(nèi)生特性及其與寄主互作的障礙。因此，本研究選取地黃內(nèi)生尖孢鐮刀菌GG22進(jìn)行基因組測序并組裝，從基因組結(jié)構(gòu)及基因組成角度，對(duì)GG22基因組進(jìn)行注釋，了解GG22基因組的組成特點(diǎn)，尋找細(xì)胞壁降解酶、病原菌-寄主互作相關(guān)基因、次生代謝合成相關(guān)基因等，分析GG22內(nèi)生性的遺傳基礎(chǔ)，以期為后續(xù)研究GG22促進(jìn)地黃生長及次生代謝產(chǎn)物合成積累的機(jī)制提供良好的基因組學(xué)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

地黃內(nèi)生真菌GG22保存于4 ℃冰箱。

1.2方法

1.2.1內(nèi)生真菌GG22的DNA提取2018年12月，于河南中醫(yī)藥大學(xué)河南省道地藥材生態(tài)種植工程技術(shù)中心組織實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開展相關(guān)試驗(yàn)。內(nèi)生真菌GG22接種于PDA固體培養(yǎng)基活化3～4 d。挑取菌絲轉(zhuǎn)入PDB液體培養(yǎng)基中搖培2～3 d（轉(zhuǎn)速120 r/min，28 ℃）即得內(nèi)生真菌GG22的種子液。以2%接種量接種于液體PDA中，培養(yǎng)3～4 d 即可，培養(yǎng)條件同上。過濾得GG22菌絲，洗凈菌絲，立即冷凍送至北京百邁克生物科技有限公司。用試劑盒提取GG22基因組DNA，并檢測濃度及質(zhì)量。

1.2.2基因組DNA測序及組裝超聲波隨機(jī)打斷提取GG22樣品的DNA，獲得插入270 bp的片段，從而構(gòu)建測序文庫。構(gòu)建文庫進(jìn)行橋式 PCR 后，通過Illumina Hiseq X ten雙端測序。SOAP denovo軟件對(duì)GG22菌株測序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝。

1.2.3基因組組分分析與功能注釋EVM、Augustus、GlimmerHMM及SNAP2.2.2中組裝好的基因組進(jìn)行預(yù)測和整合，其中包括重復(fù)序列、編碼基因、非編碼RNA及假基因。所有預(yù)測基因的編碼蛋白與KEGG、TrEMBL、Nr等通用功能數(shù)據(jù)庫和CAZy、PHI等專用功能數(shù)據(jù)庫做比對(duì)，即得基因相關(guān)的功能注釋結(jié)果。利用SignalP 4.0和TMHMM可在所有預(yù)測到的蛋白序列中分別找出含有信號(hào)肽的蛋白和跨膜蛋白。利用anti-SMASH對(duì)GG22次生代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行預(yù)測。

2結(jié)果與分析

2.1基因組測序及組裝

對(duì)GG22構(gòu)建1個(gè)270 bp文庫，共得到約 9.04 Gb 的原始數(shù)據(jù)。測序質(zhì)量值在30以上的堿基比例不小于94.81%，Contig N90 的長度為 4 629 bp，G+C含量為47.49%。

2.2基因組組分分析

應(yīng)用EVM、Augustus和GlimmerHMM等軟件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)預(yù)測，共得到17 296個(gè)預(yù)測的基因，其中基因的總長度26 937 813 bp，平均基因長度為 1 557.4 bp。tRNAscan-SE預(yù)測基因組中有52種tRNA，數(shù)量為337個(gè);Infernal1.1分析得到159個(gè)rRNA，并以其功能進(jìn)行劃分即分為3類，其他ncRNA有46個(gè)，分為33類。在GG22基因序列中利用Gene Wise尋找不成熟的終止密碼子及移碼突變，得到147個(gè)假基因，假基因總長度為172 834 bp，平均每個(gè)長度1 175.74 bp。

2.3基因組功能注釋

與KOG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr及Pfam常用功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，共有17 202個(gè)基因得到功能注釋，注釋率為99.46%。其中有 3 801 個(gè)基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中;7 431個(gè)基因注釋到KOG數(shù)據(jù)庫中;11 548個(gè)基因注釋到 Pfam 數(shù)據(jù)庫中;9 007個(gè)基因注釋到 Swissprot數(shù)據(jù)庫中;17 201個(gè)基因注釋到TrEMBL數(shù)據(jù)庫中。碳水化合物相關(guān)酶數(shù)據(jù)庫（CAZyme）可對(duì)碳水化合物酶類基因進(jìn)行功能注釋，其中包括供糖類化合物合成、碳水化合物活性酶分解的研究和信息。病原體-宿主互作因子數(shù)據(jù)庫（Pathogen Host Interactions，簡稱PHI）收錄多數(shù)具有毒力和效應(yīng)基因的細(xì)菌、卵菌、真菌及其宿主信息，可從中尋找某菌株中與致病性相關(guān)的基因。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類數(shù)據(jù)庫（Transporter Classification Database，簡稱TCDB）包含了生物體運(yùn)輸系統(tǒng)的分類、結(jié)構(gòu)、功能等信息。分別有881、5 247、158個(gè)基因被注釋到CAZy、PHI及TCDB這3個(gè)數(shù)據(jù)庫。軟件SignalP 4.0和 tmhmm在所預(yù)測到的基因的蛋白序列中，分別找出1 654個(gè)含有信號(hào)肽的蛋白、3 362個(gè)跨膜蛋白及1 238分泌蛋白。

2.3.1KOG注釋從表1可以看出，選擇利用KOGs（EuKaryotic Orthologous Groups）進(jìn)行基因注釋與功能分類， 共注釋基因7 431個(gè)， 可分為25個(gè)功能組和4大類，分別為細(xì)胞過程及信號(hào)、信息儲(chǔ)存及加工、代謝過程、功能特點(diǎn)不明顯，分別注釋基因數(shù)為1 660、1 164、2 817、1 736個(gè)基因，另有903個(gè)基因功能類別未知。尤其注意到的是，尖孢鐮刀菌GG22的功能分類N（細(xì)胞運(yùn)動(dòng)）和W（細(xì)胞外結(jié)構(gòu)），基因數(shù)量分別只有3個(gè)和8個(gè)，相比之下不是很多，可以分析出，尖孢鐮刀菌GG22的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)不發(fā)達(dá)，這可能是其成為地黃塊根寄生內(nèi)生菌的內(nèi)在原因之一。

2.3.2KEGG注釋KEGG總共注釋得到的物質(zhì)代謝通路有111個(gè)（圖1）。尖孢鐮刀菌GG22中預(yù)測代謝通路在新陳代謝、細(xì)胞過程、遺傳信息加工和環(huán)境信息加工等4大類中涉及的基因比較多。新陳代謝分類中，共有2 576個(gè)基因，細(xì)胞過程分類中，共有508個(gè)基因，遺傳信息加工分類中，共有550個(gè)基因，環(huán)境信息加工分類中，共有189個(gè)。

2.3.3CAZyme注釋真菌可以產(chǎn)生大量的碳水化合物活性酶，而該類物質(zhì)是與真菌的生活方式可能緊密相關(guān)，同時(shí)也是真菌降解纖維素、果膠等植物細(xì)胞壁成分，從而與植物建立共生或寄生關(guān)系的重要酶類系統(tǒng)。CAZymes分為糖苷水解酶類（GHs）、糖基轉(zhuǎn)移酶類（GTs）、多糖裂解酶類（PLs）、糖酯酶類（CEs）、糖結(jié)合模塊（CBMs）等。本研究發(fā)現(xiàn)，GG22基因組中，GHs數(shù)量最多，共有375個(gè);CEs共有205個(gè);GTs共有121個(gè);碳水CBMs共有118個(gè);PLs共有26個(gè)（表2）。

植物的細(xì)胞壁是病原菌或內(nèi)生真菌建立侵染關(guān)系的主要障礙，而CEs、PLs和GHs 3個(gè)家族的酶類被稱為細(xì)胞壁降解酶，這些酶可能有助于真菌侵入宿主細(xì)胞，在真菌對(duì)于宿主的滲透和成功感染具有重要的作用。這些酶在尖孢鐮刀菌侵染過程中的作用是當(dāng)前研究的熱門。從表3可以看出，GG22能分泌出幾種不同的細(xì)胞壁裂解酶，如角質(zhì)酶、果膠甲酯酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等，這些酶的發(fā)現(xiàn)可為進(jìn)一步探索GG22的侵染過程奠定基礎(chǔ)。

2.3.4PHI注釋PHI為病原宿主互作數(shù)據(jù)庫，主要收錄與病原菌相關(guān)基因包括致病基因、毒力基因和效應(yīng)蛋白基因。GG22基因組中有5 247條病原菌-寄主互作（PHI）相關(guān)基因，歸屬于90個(gè)PHI類型。對(duì)GG22基因組中基因缺失后引起真菌毒力增加的PHI類型進(jìn)行了初步分析（表3），并對(duì)包含3條及以上基因的PHI類型進(jìn)行了總結(jié)。PHI：4194共有45條，這些基因的存在可能是GG22維持內(nèi)生生活的關(guān)鍵所在。

2.4次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析

本研究使用anti-SMASH對(duì)基因組進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物合成分析預(yù)測，基因組中共預(yù)測得到42個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇，在預(yù)測到的基因簇中，萜烯類基因簇（Terpene）共有10個(gè)，占預(yù)測總基因數(shù)的23.80%;聚酮合酶基因簇（Polyketide synthase，簡稱PKS）共9個(gè)，占預(yù)測總基因簇的21.42%，其中T1pks含有8個(gè)，T3pks含有1個(gè);非核糖體多肽合成酶基因簇（non-ribosomal peptide synthase，簡稱NRPS）共8個(gè)，占預(yù)測總基因簇的19.04%;T1pks-Nrps混合和吲哚類（Indole）基因簇各有3個(gè)，各占預(yù)測總基因簇的7.14%;其他類共有9個(gè)，占預(yù)測總基因數(shù)的21.43%（圖2）。

將所有GG22基因簇與已知次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，從表4可以看出，GG22的基因組中暗示著其具有合成Fusarubin、Alternapyrone等化合物及其衍生物的能力。碧卡維林（Bikaverin）[14]、白僵菌素（Beauvericin）[15]、Aspyridone[16]和Equisetin[17]類化合物都具有一定的抗真菌、細(xì)菌、病毒及抑制根結(jié)線蟲的能力，而GG22基因組中具有合成上述化合物的相似基因簇，推測GG22可能能夠產(chǎn)生碧卡維林等化合物，從而抑制其他微生物的生長，保護(hù)寄主植物免受其他病原菌的侵害，為其寄主提供一定的保護(hù)。鐮紅菌素（Fusarubin）類化合物是腐皮鐮刀菌的特征次生代謝產(chǎn)物[18]，也能在腐皮鐮刀菌與某些植物形成互利共生關(guān)系的過程中發(fā)揮作用。GG22基因組中1個(gè)T1pks基因簇（129182-176252）與Fusarubin合成基因組相似度為87%，說明GG22可能也具有合成Fusarubin類化合物的能力，而該類化合物可能與其能夠與植物進(jìn)行共生有一定的關(guān)系。 GG22中含

有合成 alternapyrone 類的相似基因，推測其具有代謝該類化合物的能力，而 alternapyrone 類化合物在相關(guān)生物酶作用下進(jìn)一步合成萘并吡喃酮類化合物的是一種新型昆蟲拒食素[19]。因此，GG22合成alternapyrone可保護(hù)其自身及寄主減少昆蟲取食的風(fēng)險(xiǎn)。地普?。―epudecin）是一種11碳線性聚酮化合物，是組蛋白脫乙酰基酶（HDAC）的抑制，也是病原菌與寄主之間相互作用的毒力因子，但其毒力中的作用較輕[20]。白僵菌素（Beauvericin）[15]和鐮刀菌酸（Fusaric acid）[21]是病原菌產(chǎn)生的非寄主特異性致病毒素，可促進(jìn)病原菌的侵染。GG22基因組中與白僵菌素和鐮刀菌酸合成基因簇相似度分別為20%、13%，相似度均較低，說明GG22可能具有合成類似化合物的能力，從而幫助自身完成對(duì)寄主植物的侵染，但GG22合成的類似化合物其毒力可能較輕，不足以使寄主致病。

根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室之前的研究，體外液體培養(yǎng)GG22可以產(chǎn)生GA、IAA等植物激素，從而促進(jìn)寄主植物的生長及次生代謝產(chǎn)物的積累。本研究在通過KEGG對(duì)萜類化合物合成途徑分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在GG22中注釋到參與萜類化合物合成途徑的有32個(gè)基因，主要為泛醌和其他萜類醌的生物合成（ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis，ko00130）途徑12個(gè)，萜類骨架生物合成（terpenoid backbone biosynthesis，ko00900）途徑18個(gè)，但是缺乏二萜類生物合成相關(guān)基因。因此，GG22產(chǎn)生二萜類化合物GA的途徑還并不清晰，這可能是與基因組序列拼接長度不夠、注釋不完全有關(guān)。在參與IAA生物合成的色氨酸代謝途徑（ko00380）中，共發(fā)現(xiàn)57個(gè)基因編碼的19個(gè)酶參與其中，這些基因可能參與GG22 GA、IAA等植物激素及其類似物的生物合成。

3討論與結(jié)論

植物內(nèi)生真菌是指能在植物組織內(nèi)部定殖，但不引起寄主產(chǎn)生病害的一類真菌。有些內(nèi)生真菌能夠通過產(chǎn)生激素、解磷解鉀等方式促進(jìn)植物生長、提高寄主抗逆性和刺激寄主次生代謝產(chǎn)物合成。很多內(nèi)生真菌其同種但不同的菌株卻是病原菌，而與病原菌與植物互作相比，內(nèi)生真菌與植物互作的分子機(jī)制還很不清楚。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的普及， 越來越多的病原真菌基因組被揭示，如稻瘟病菌、玉蜀黍黑粉菌、禾布氏白粉菌等，然而植物內(nèi)生真菌基因組相關(guān)的研究報(bào)道還較少。植物病原真菌的全基因組測序分析可以為內(nèi)生真菌相關(guān)研究提供參考。本研究通過對(duì)地黃內(nèi)生真菌GG22進(jìn)行全基因組測序，拼接得到基因組總長度26 937 813 bp，GC平均含量為47.49%。與KOG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr及Pfam常用功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，共有17 202個(gè)基因得到功能注釋，注釋率為99.46%，這些基因的注釋為進(jìn)一步了解GG22的生物學(xué)特性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

真菌在物質(zhì)代謝和循環(huán)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，不同類型真菌具有不同的營養(yǎng)方式，如腐生真菌、寄生（病原）真菌、內(nèi)生真菌等。真菌可以產(chǎn)生大量的碳水化合物活性酶，該類物質(zhì)是真菌生長發(fā)育過程中極為突出的蛋白家族，與真菌的生活方式可能緊密相關(guān)。 萬仁鵬等比較了97株腐生、病原及內(nèi)生3種不同營養(yǎng)方式的真菌中CAZymes的含量[22]，發(fā)現(xiàn)腐生真菌含有的CAZymes最少，僅有200個(gè)左右，而內(nèi)生真菌中約一半含有的CAZymes超過700個(gè)。本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生尖孢鐮刀菌GG22基因組中共有881個(gè)CAZymes，說明CAZymes可能在內(nèi)生真菌侵染過程中發(fā)揮著重要的作用。

病原體寄主互作的相關(guān)基因是真菌致病的重要決定因子，基因產(chǎn)物直接體現(xiàn)在病原菌對(duì)寄主侵染環(huán)境的適應(yīng)和反應(yīng)，誘導(dǎo)植株發(fā)生病理反應(yīng)。GG22基因組中有5 247條病原菌-寄主互作（PHI）相關(guān)基因，歸屬于90個(gè)PHI類型。與其他病原真菌相比，其PHI類型較少，這可能是與其為植物內(nèi)生真菌，不引起寄主產(chǎn)生病害有關(guān)。PHI：4194，PHI：2393等類型基因失活導(dǎo)致病原菌響應(yīng)寄主致病能力增強(qiáng)，因此推測這些基因在GG22維持生長而不致病的內(nèi)生生活中發(fā)揮著重要的作用。

植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生非常豐富的次生代謝產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物可能在其生長過程中發(fā)揮著一定的作用，其次，內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物很多都具有較好的生物學(xué)活性，有些內(nèi)生真菌甚至能產(chǎn)生與寄主相同或相似的活性物質(zhì)，這些活性產(chǎn)物可以作為新藥開發(fā)重要的化合物庫。GG22基因組中共預(yù)測得到42個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇，包括萜烯類基因簇、聚酮合酶基因簇、非核糖體多肽合成酶基因簇、吲哚類基因簇等，暗示著GG22能夠產(chǎn)生多種類型的次生代謝產(chǎn)物，而其可能產(chǎn)生的Fusarubin、Beauvericin 等物質(zhì)可能對(duì)GG22的侵染、建立共生關(guān)系、保護(hù)寄主植物等發(fā)揮著一定的作用。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81603232）;國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2017YFC1702800）;河南省科技攻關(guān)計(jì)劃（編號(hào)：172102310539）。

作者簡介：朱畇昊（1986—），男，河南鄭州人，博士，副教授，主要從事藥用植物分子生物學(xué)研究。 E-mail：guxinhan123@163.com。

通信作者：董誠明，教授，主要從事中藥材規(guī)范化種植研究。E-mail：dcm371@sohu.com。