陳忠恕，王曉聞

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801)

小米，又名粟米，具有生育期短、適應(yīng)性強(qiáng)且不易腐敗的特點(diǎn)。山西省素有“小雜糧王國”的美稱，有數(shù)據(jù)顯示，在2014年之后，山西省擁有全國最大的小米種植面積；在2017年達(dá)到311.8萬畝，約占全國小米種植面積的1/7，總產(chǎn)量占全國的1/3(58.7萬噸)[1]。小米是一種優(yōu)質(zhì)的藥食同源雜糧，具有很高的營養(yǎng)價值和功能特性。《本草綱目》中這樣描述小米：“治反胃熱痢，補(bǔ)虛損，開腸胃”[2]。古書《靈柩經(jīng)》則認(rèn)為小米除“補(bǔ)氣、養(yǎng)胃”這些功能外，還能預(yù)防和治療某些婦科疾病[3]?，F(xiàn)代中醫(yī)研究發(fā)現(xiàn)，小米有清熱解毒、健胃安眠的功效，能夠成為孕婦和傷病患者在康復(fù)過程中以及嬰幼兒在斷乳食期的主要食物之一[4]。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是一類革蘭氏陽性、兼性異型發(fā)酵乳酸菌，呼吸方式為厭氧或兼性厭氧，是被廣泛應(yīng)用于食品中的益生菌之一且極耐酸[5-6]和膽鹽[7-8]，因此在運(yùn)用搭配食品及加工中發(fā)揮了巨大的作用，如發(fā)酵酸奶、泡菜及肉類等。發(fā)酵食品擁有其獨(dú)特的風(fēng)味，同時也是讓益生菌進(jìn)入體內(nèi)的良好方式。植物乳桿菌能夠增強(qiáng)人體免疫力[9-10]；調(diào)節(jié)人體腸道菌群[11]；吸附有害物質(zhì)，如鉛[12]、鎘[13]和鋁[14]。

植物乳桿菌還能清除塑化劑[15]、展青霉素。

頂空氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS)是一項(xiàng)新興檢測手段，于大氣壓下就能開始檢測。在氣相色譜和離子迀移譜綜合運(yùn)用下，對得到的化學(xué)信息及測定特征對比能得到更好的結(jié)果[16]。目前，GC-IMS技術(shù)在食品中的應(yīng)用主要是在食品的安全控制及過程分析等方面，如檢測摻假油樣[17]、綠茶品種[18]、茶葉質(zhì)量[19]及區(qū)分白酒香型[20]等。但利用GC-IMS檢測小米粉發(fā)酵過程中的風(fēng)味物質(zhì)變化的研究鮮有報(bào)道。

本研究以植物乳桿菌發(fā)酵制得發(fā)酵0，12，24，36，48，60，72 h的小米粉，利用GC-IMS技術(shù)測定不同時間其揮發(fā)性成分，利用與儀器配套的分析軟件Vocal對物質(zhì)進(jìn)行定性分析；利用插件Reporter建立三維圖譜、二維俯視圖譜；利用Gallery Plot插件建立指紋圖譜；通過HemI軟件建立熱圖進(jìn)行聚類分析；通過SIMCA 14.1對樣品進(jìn)行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)；利用OriginPro 2019處理PLS-DA得到的樣品VIP值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小米(晉谷21號)：產(chǎn)自山西省晉中市太谷區(qū)；植物乳桿菌(CICC20265)：由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)試劑

高溫α-淀粉酶(食品級)、糖化酶、MRS肉湯：均由北京索來寶科技有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)儀器

BS210S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；HSJ-4恒溫水浴攪拌器 江蘇科析儀器有限公司；QJ-06磨粉機(jī) 上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；YSQ-LS-S高壓滅菌鍋、BJ-ICD無菌操作臺 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；DHP-500恒溫培養(yǎng)箱 北京永光明醫(yī)療儀器廠；Flavour Spec?風(fēng)味分析儀 德國G.A.S公司；CTC-PAL自動頂空進(jìn)樣器 瑞士CTC Analytics公司；SE-54毛細(xì)管柱 德國CS-Chromatographie Service設(shè)備供應(yīng)商。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 小米預(yù)處理

取潔凈的小米籽粒于研磨機(jī)中充分研磨，過80目篩備用。

1.4.2 菌種活化

取配制好的MRS培養(yǎng)基10 mL于試管中，121 ℃滅菌15 min。在無菌操作臺上用接菌環(huán)挑取少量乳酸菌菌粉置于培養(yǎng)基中振蕩混合，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h(活化好的乳酸菌菌液呈現(xiàn)渾濁狀態(tài))。

將試管中活化好的乳酸菌菌液接入裝有100 mL培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。以同樣步驟再進(jìn)行兩次擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)，最后一次擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液放到4 ℃冰箱中儲存。

1.4.3 小米粉的糊化、糖化、液化

糊化：取20 g小米粉，按1∶10料液比于紫外照射下浸泡12 h后加熱50 min至80 ℃。

液化：在糊化后的料液中加入高溫α-淀粉酶18 U/g，80 ℃加熱60 min。

糖化：在液化后的料液中加入糖化酶180 U/g，50 ℃加熱60 min。

1.4.4 發(fā)酵試驗(yàn)

按3%(W/W)添加發(fā)酵劑，設(shè)0(空白)，12，24，36，48，60，72 h 7組樣品，凍干成粉并在-18 ℃下保存待測。

1.4.5 風(fēng)味分析儀測定

1.4.5.1 樣品處理

取發(fā)酵完成的各小米粉樣品各1 g，置于20 mL頂空瓶中，80 ℃孵育15 min后進(jìn)樣100 μL。

1.4.5.2 GC條件

設(shè)置氣相色譜柱溫度為 60 ℃，測定過程中的載氣為高純N2；載氣流速為小米粉風(fēng)味物質(zhì)分離最適流速：初流速為2 mL/min，保持20 min，然后升至 100 mL/min，保持10 min，總分析時間為30 min。

1.4.5.3 IMS檢測條件

設(shè)置IMS漂移管溫度為45 ℃，測定過程中的漂移氣為高純N2，漂移氣的流速保持在150 mL/min不變；漂移管內(nèi)的電離源為氘放射，即β射線，離子化模式為正離子模式。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用與儀器配套的分析軟件Vocal對物質(zhì)進(jìn)行定性分析；利用插件Reporter建立三維圖譜、二維俯視圖譜；利用Gallery Plot插件建立指紋圖譜；通過HemI軟件建立熱圖進(jìn)行聚類分析；通過SIMCA 14.1對樣品進(jìn)行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)；利用OriginPro 2019處理PLS-DA得到的樣品VIP值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時間小米粉樣品中VOCs的定性

樣品經(jīng)過氣相色譜分離，然后基于保留時間和遷移時間通過離子遷移譜分析。檢測出的小米發(fā)酵粉揮發(fā)性成分的定性分析以圖1中的編號表示，縱坐標(biāo)為保留時間，橫坐標(biāo)為遷移時間。GC-IMS共檢測出50個信號峰，通過軟件內(nèi)置的NIST GC數(shù)據(jù)庫及G.A.S的IMS數(shù)據(jù)庫，確定了40種揮發(fā)性成分，一共包括12種醛類、10種醇類、6種酮類、11種酯類和1種呋喃類物質(zhì)，鑒定出的組分見表1，包括化合物名稱、CAS號、分子量、保留指數(shù)、保留時間、遷移時間。其他有信號峰但無法檢測出的VOCs未列出。當(dāng)穿過遷移區(qū)域時，由于分析的離子和中性分子之間形成聚合物(如二聚體和三聚體)，因此某些VOCs[21]檢測到多個信號峰。由于單體和二聚體的存在，戊醛、己醛、反式-2-戊烯醛反式-2-庚烯醛、丁醇、1-戊醇、正己醇、反式-2-己烯-1醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸丙酯、己酸乙酯均表出雙峰。

圖1 不同發(fā)酵時間的小米粉離子遷移譜圖譜Fig.1 Ion migration spectra of millet flour at different fermentation time

表1 小米粉中檢測出的VOCs信息Table 1 The VOCs information detected in millet flour

續(xù) 表

2.2 不同發(fā)酵時間小米粉揮發(fā)性成分三維譜圖差異分析

圖2 不同發(fā)酵時間的小米粉中VOCs成分三維譜圖Fig.2 Three-dimensional spectra of VOCs in millet flour at different fermentation time

為了便于直觀地觀察和比較，采用三維譜圖對不同小米粉在不同發(fā)酵時間產(chǎn)生的VOCs進(jìn)行了表征。由圖2可明顯看出，隨著發(fā)酵時間的增大，一些VOCs的含量降低，形成新的物質(zhì)。其中，A部分的峰高在0～36 h內(nèi)持續(xù)降低，48 h出現(xiàn)新的峰高，然后又降低。B部分的峰高隨著發(fā)酵時間的增加不斷降低。而在C部分可以觀察出小米粉發(fā)酵后比0 h的小米粉樣品出現(xiàn)了很多新的峰值，由此斷定小米粉在植物乳桿菌發(fā)酵的影響下產(chǎn)生了新的風(fēng)味物質(zhì)且可能主要集中在這個保留時間和遷移時間段，由于此處的信號峰較為密集，不易判斷和分析，因此利用俯視圖作不同發(fā)酵時間的差異對比(見圖3)。

2.3 不同發(fā)酵時間小米粉揮發(fā)性成分二維俯視譜圖差異分析

圖3 小米粉不同發(fā)酵時間的二維譜圖Fig.3 Two-dimensional spectra of millet flour at different fermentation time

由于三維譜圖能觀察到VOCs信號峰出現(xiàn)的位置，但如果出現(xiàn)信號峰分布比較密集的情況，不利于觀察比較樣品間的差異，且信號峰之間的峰高差異不顯著，因此利用二維俯視圖進(jìn)行比較，見圖3。橫坐標(biāo)1.0處的線是反應(yīng)離子峰(reaction ion peak,RIP)。RIP峰兩側(cè)的每個點(diǎn)分別為一種揮發(fā)性有機(jī)物，顏色越深表示此化合物濃度越高[22]。以發(fā)酵0 h的小米粉為參照，對比其他樣品中所有的揮發(fā)性物質(zhì)的差異。可以觀察小米粉所含的VOCs主要集中在遷移時間100～300 ms之間，且與發(fā)酵0 h的小米粉相比，在此保留時間范圍內(nèi)，VOCs有明顯變化。這一發(fā)現(xiàn)表明，小米粉在乳酸菌發(fā)酵的作用下生成了小米粉自身不含的揮發(fā)性物質(zhì)且本身含有的某些揮發(fā)性物質(zhì)含量降低。

2.4 不同發(fā)酵時間小米粉揮發(fā)性有機(jī)化合物指紋圖譜分析

圖4 小米粉樣品揮發(fā)性化合物的指紋譜圖Fig.4 Fingerprint spectra of volatile compounds in millet flour samples

雖然三維及二維譜圖能體現(xiàn)出小米粉樣品在發(fā)酵過程中的變化趨勢，但很難對圖中密集區(qū)域的VOCs作出準(zhǔn)確的判斷分析，而指紋譜圖很好地解決了這個問題。以三維譜圖的峰值信號，形成的小米粉樣品揮發(fā)性化合物的指紋譜圖(見圖4)，每一行代表一個樣品的全部信號峰，每一列代表不同樣品中的同一VOCs。指紋譜圖上的每個點(diǎn)代表一種VOC的含量，點(diǎn)的顏色越亮，說明該VOC在此樣品中的含量越高。指紋圖譜中名稱相同的兩種化合物為單體及其二聚體。二聚體的質(zhì)子親和力強(qiáng)及含量的增多使它們的遷移時間增長。通過指紋譜圖能夠直觀地比較不同樣品之間的VOCs種類及含量的區(qū)別，揭示了小米粉在發(fā)酵過程中各VOCs的動態(tài)變化。指紋譜圖上的數(shù)字代表了未定性揮發(fā)性物質(zhì)。對比整個發(fā)酵過程，小米粉中的VOCs含量有明顯的變化，這是基于植物乳桿菌生長代謝過程中利用小米粉中的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生的代謝物導(dǎo)致的，同時使小米粉具有了特殊的風(fēng)味。

小米粉的VOCs在發(fā)酵過程中不斷發(fā)生變化，通過比較VOCs在不同階段的譜點(diǎn)強(qiáng)度，可以確定該物質(zhì)在發(fā)酵過程中的變化(增加、減少、消失或波動)。圖4中A區(qū)域內(nèi)的VOCs在0 h時含量豐富，但在發(fā)酵之后含量急劇減少甚至消失，有壬醛、正庚醛、正己醛、正戊醛、正戊醇、庚醇、正丁醇、丁酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯及甲酸乙酯，這些物質(zhì)是小米粉自身的風(fēng)味物質(zhì)，可能在植物乳桿菌生長代謝過程中被降解或者轉(zhuǎn)化成其他的VOC物質(zhì)。B區(qū)域中的3-羥基-2-丁酮、丙酮酸乙酯及兩種未檢測出的VOCs含量在發(fā)酵過程中不斷增大。C區(qū)域的VOCs含量在發(fā)酵24 h達(dá)到最高值且在36 h減少而48 h時有一定上升趨勢，總體在發(fā)酵過程中含量呈波動趨勢，如反式-2-庚烯醛、反式-2-辛烯醛、正丙醇、己酸乙酯及編號為2，5，7的未檢測出的VOCs。而反式-2-己烯-1-醇、反式-2-戊烯醛、2-丁酮、2-戊基呋喃、甲基庚烯酮、環(huán)己烯-2-酮、正己醇、2-庚酮在12 h時含量最大，隨著發(fā)酵時間的增長不斷減少。綜合已檢測出的VOCs，通過指紋圖譜初步判斷，雖然小米粉中2-庚酮、己醇、環(huán)己烯-2-酮、甲基庚烯酮、2-戊基呋喃、2-丁酮、反式-2-戊烯醛、反式-2-己烯-1-醇的含量在12 h達(dá)到最高值，但在發(fā)酵24 h后仍有較高含量，而3-羥基-2-丁酮和丙酮酸乙酯在發(fā)酵24 h后也已有較高含量且3-羥基-2-丁酮具有令人愉快的奶油香味；丙酮酸乙酯具有新鮮甜潤的花果香氣，不難看出在發(fā)酵24 h時風(fēng)味物質(zhì)含量最高且種類最豐富，可能在發(fā)酵24 h時小米粉樣品的感官最佳。

2.5 基于熱圖對不同發(fā)酵時期的小米粉樣品聚類分析

為了進(jìn)一步分析小米在發(fā)酵過程中VOCs的差異，將不同樣品中的VOCs含量作熱圖進(jìn)行聚類分析，見圖5。

圖5 不同發(fā)酵時間的小米粉熱圖及聚類分析Fig.5 Heat map and cluster analysis of millet flour at different fermentation time

由圖5可知，所有樣品可以分為發(fā)酵0 h的樣品和其他發(fā)酵時間的樣品兩大類，因此可以說明植物乳桿菌發(fā)酵對小米粉的VOCs含量產(chǎn)生了巨大的影響。同時，發(fā)酵48 h和發(fā)酵60 h的樣品、發(fā)酵36 h和發(fā)酵72 h的樣品聚集到一起，說明它們之間的VOCs具有一定的相似度，發(fā)酵12 h的樣品又和48 h及60 h的樣品有一定的相似度，24，36，72 h的樣品有一定的相似度，說明小米粉在發(fā)酵過程中VOCs含量的變化是不斷波動的，此發(fā)現(xiàn)與指紋譜圖結(jié)論一致。

2.6 小米發(fā)酵粉樣品的PLS-DA分析

目前多數(shù)對GC-IMS結(jié)果的分析方法采用PCA主成分分析法[23-25]，PCA可以清晰明了地展示數(shù)據(jù)組內(nèi)的重復(fù)性和組間的差異性，評估數(shù)據(jù)的可重復(fù)性，發(fā)現(xiàn)可能存在的異常值，比如明顯離群的樣本點(diǎn)。但PCA是一種無監(jiān)督的模式，屬于探索性分析。由于樣品間VOCs含量數(shù)據(jù)的復(fù)雜性，對于組間差異不夠明顯的樣品，單純的無監(jiān)督分析不能很好地區(qū)分樣本的組間差異，PLS-DA是有監(jiān)督的模式，屬于模型的方法，使用偏最小二乘回歸建立VOCs表達(dá)量與樣品之間的關(guān)系模型，對數(shù)據(jù)降維，這種監(jiān)督模式通常可以更好地確立樣本關(guān)系。

經(jīng)PLS-DA分析，R2X=0.995，R2Y=0.978，Q2=0.919，R2X和R2Y分別表示模型所能解釋X和Y矩陣信息的百分比，R2X-R2Y<0.3代表該模型較可靠。使用置換檢驗(yàn)的方法對PLS-DA進(jìn)行驗(yàn)證，次數(shù)為200次，得到檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量來評估模型擬合的質(zhì)量。PLS-DA置換檢驗(yàn)結(jié)果見圖6，右側(cè)是原始值，左側(cè)是模擬值，所有左側(cè)的R2值和Q2值均比右側(cè)低，R2和Q2的回歸線斜率大于1，且Q2的回歸線截距為負(fù)值，說明該模型穩(wěn)定性較好，未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，具有較好的預(yù)測能力[26]。

圖6 小米粉樣品PLS-DA得分圖Fig.6 PLS-DA score scatter plot of millet flour samples

由圖6可知，發(fā)酵不同時間段的小米粉樣品通過PLS-DA得到了較好的區(qū)分，且發(fā)酵0 h的小米粉樣品與其他樣品表現(xiàn)出巨大差異，且發(fā)酵36 h的樣品與發(fā)酵72 h的樣品距離較近，24 h的樣品與36 h及72 h的樣品距離較近，表現(xiàn)出較高的相似度，與聚類分析結(jié)果一致。

圖7 模型置換檢驗(yàn)圖Fig.7 Model permutation test diagram

圖8 小米粉樣品中不同VOCs的VIP得分圖Fig.8 VIP score plot of different VOCs in millet flour samples

變量投影重要度(variable importance for the projection, VIP)表征了分類過程中各個變量的重要性，通常VIP值大于1的變量在不同樣本組(即不同發(fā)酵時間的小米粉樣品)之間的區(qū)分中起著重要作用。通過VIP值篩選出15個差異標(biāo)記物：己酸乙酯二聚體、乙酸乙酯二聚體、正丙醇、己酸乙酯、3-羥基丁烷-2-酮、2-庚酮、反式-2-庚烯醛、正己醛二聚體、反式-2-庚烯醛二聚體、苯甲醛、正己醇二聚體、反式-2-戊烯醛、正丁醇二聚體及編號為1和10的兩種未鑒定的VOCs，這些VOCs的VIP值較高，說明這些物質(zhì)在小米粉的發(fā)酵過程中含量變化顯著。

3 結(jié)論

此研究首次采用GC-IMS技術(shù)研究小米粉在發(fā)酵過程中的風(fēng)味變化情況，無需復(fù)雜的前處理及萃取過程，充分利用了GC高分離效率和IMS高靈敏度的特點(diǎn)，將數(shù)據(jù)以可視化的形式呈現(xiàn)在譜圖中，不同發(fā)酵時間的樣品呈現(xiàn)出的差異更加直觀顯著。以GC-IMS數(shù)據(jù)庫為依據(jù),通過離子遷移譜圖和遷移時間及保留時間，建立了定性表格對分離出的VOCs進(jìn)行定性，得知發(fā)酵小米粉樣品中共分離出28種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醛類、醇類、酮類、酯類和呋喃類。通過對比小米發(fā)酵粉樣品的三維及二維譜圖，可以得知小米粉發(fā)酵前后的VOCs差異較大，且大部分集中在保留時間100～300 ms之間。為了更直觀地分析小米粉樣品中的VOCs，建立了指紋圖譜，由指紋圖譜可知，樣品中含有的VOCs隨著發(fā)酵時間的改變不斷改變，其中壬醛、正庚醛、正己醛、正戊醛、正戊醇、庚醇、正丁醇、丁酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯及甲酸乙酯在0 h時含量最高，發(fā)酵過后基本消失，3-羥基-2-丁酮、丙酮酸乙酯及兩種未檢測出的VOCs含量在發(fā)酵過程中不斷增大，其他VOCs在發(fā)酵過程中的含量變化呈波動趨勢。綜合指紋譜圖結(jié)果分析得到在24 h時，小米粉樣品的風(fēng)味物質(zhì)含量最高且豐富，或擁有花果及奶油等香味，理論上達(dá)到對比其他樣品的感官最佳值，與上前述結(jié)果一致。聚類分析結(jié)果顯示，發(fā)酵48 h和發(fā)酵60 h的樣品相似度高，且這兩個樣品與發(fā)酵12 h的樣品有一定相似度，發(fā)酵36 h和發(fā)酵72 h的樣品相似度高，且發(fā)酵24 h的樣品和這兩個樣品有一定的相似度，此發(fā)現(xiàn)能以側(cè)面反映發(fā)酵過程中某些VOCs含量處于不斷變化的狀態(tài)；所有的樣品都與發(fā)酵0 h的樣品有較大差異，說明植物乳桿菌發(fā)酵對小米粉的VOCs成分有巨大影響，與指紋譜圖分析結(jié)果一致。由PLS-DA分析可得，R2X-R2Y=0.017<0.3說明模型可靠。置換分析結(jié)果說明模型未過擬合，通過PLS-DA得分圖可知，0 h的小米粉樣品與其他樣品差異巨大，發(fā)酵36 h與發(fā)酵72 h的樣品相似度較高，24 h與36 h及72 h的樣品相似度較高，與聚類分析結(jié)果一致。通過VIP得分圖篩選出15個差異標(biāo)記物：己酸乙酯二聚體、乙酸乙酯二聚體、正丙醇、己酸乙酯、3-羥基丁烷-2-酮、2-庚酮、反式-2-庚烯醛、正己醛二聚體、反式-2-庚烯醛二聚體、苯甲醛、正己醇二聚體、反式-2-戊烯醛、正丁醇二聚體及編號為1和10的兩種未鑒定的VOCs在小米粉整個發(fā)酵過程中的變化最為明顯。但由于GC-IMS技術(shù)起步較晚，手段較新，IMS數(shù)據(jù)庫不夠完善，部分VOCs無法進(jìn)行定性，無法定性的VOCs之后可以利用其他分析技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，完善小米發(fā)酵領(lǐng)域的VOCs數(shù)據(jù)庫。

本研究通過探究小米粉在發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的變化，以期在小米產(chǎn)品加工上提供新的思路，開發(fā)出擁有優(yōu)質(zhì)風(fēng)味和良好營養(yǎng)的小米發(fā)酵制品，同時證明了GC-IMS檢測技術(shù)能夠高效準(zhǔn)確地鑒別出不同發(fā)酵時間段的發(fā)酵小米粉樣品，為鑒別不同工藝條件發(fā)酵的小米粉提供新的思路，有望成為新的谷物發(fā)酵工藝優(yōu)化檢測的新技術(shù)。