王 娟,高澤中,蔣一婷,萬冬梅

遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院,遼寧省動物資源與疫病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽 110036

腸道微生物是動物機(jī)體內(nèi)最重要的“微生物器官”,參與個(gè)體的營養(yǎng)吸收、代謝調(diào)節(jié)及免疫功能,在維持生物體健康和適應(yīng)性進(jìn)化等方面均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-3]。鳥類是生態(tài)系統(tǒng)重要的指示生物,具有豐富的物種多樣性和遺傳多樣性。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對鳥類種群的日益重視,對于鳥類腸道微生物組成及功能等的研究也呈指數(shù)增長[4- 5]。然而,受到野外條件下取樣困難、DNA提取量低等因素的限制,研究主要以家禽的研究為主,對于野生鳥類腸道微生物的研究報(bào)道則相對較少[3,6-7]。

復(fù)雜的生活史特征、多樣化的食性、交配系統(tǒng)、生理特征、飛翔生活、長距離遷徙等使鳥類的生理活動面臨更強(qiáng)的選擇性壓力,使其腸道微生物菌群的變化更加復(fù)雜。鳥類腸道微生物組成及多樣性受物種、環(huán)境、生活史階段、消化道區(qū)域等多種因素的影響[1,4,7-8],特別是食物組成對鳥類腸道微生物的形成具有極其重要的作用[9]。鳥類的食性復(fù)雜,如森林鳥類根據(jù)食性可分為食果鳥、食蜜鳥、食谷鳥、食蟲鳥、食肉鳥、雜食鳥等類群[10]。其中,食果鳥、食谷鳥、食蜜鳥等均以植物性食物為食；食蟲鳥、食肉鳥、食腐鳥等均以肉食性食物為主要食物來源。而海洋及濕地中的鳥類多為肉食性或雜食性飲食[11]。復(fù)雜的食物組成導(dǎo)致鳥類腸道微生物更加復(fù)雜多樣。

為了更好的了解不同食性野生鳥類腸道微生物特點(diǎn),在本研究中,將分別從植食性鳥類、肉食性鳥類和雜食性鳥類的角度出發(fā),對前人的文獻(xiàn)進(jìn)行全面梳理,分析不同食性的鳥類腸道微生物的組成、特點(diǎn)、影響因素及鳥類腸道微生物研究方法,以期為野生鳥類腸道微生物研究提供參考。

1 野生鳥類腸道微生物與食性關(guān)系

1.1 植食性鳥類的腸道微生物研究現(xiàn)狀

目前,關(guān)于植食性鳥類腸道微生物研究主要集中于鸮面鸚鵡(Strigopshabroptilus)[12]、北非橙簇花蜜鳥(Cinnyrisosea)[13]、麝雉(Opisthocomushoazin)[14]、安氏蜂鳥(Calypteanna)[15]等種群。

植食性鳥類食物組成較為單一,腸道微生物多樣性相對較低,以高豐富度的變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為主。此外,在以煙草花蜜為食的北非橙簇花蜜鳥[13]和安氏蜂鳥[15]糞便樣品中均發(fā)現(xiàn)了低豐度的放線菌門(Actinobacteria)細(xì)菌。

食物組成對植食性鳥類腸道微生物菌群具有重要影響,外源性增加北非橙簇花蜜鳥食物中尼古丁和新煙堿等毒性物質(zhì)濃度后,其腸道微生物中尼古丁及新煙堿降解菌屬的細(xì)菌豐度顯著升高[13]。麝雉具有與反芻動物相似的前腸發(fā)酵結(jié)構(gòu),其腸道內(nèi)形成與食物消化作用相關(guān)的微生物群落,前腸以擬桿菌門(Bacteroidetes)和螺旋體門(Spirochaetes)為主,用于消化纖維素類食物,后腸中以消化蛋白質(zhì)的變形菌門(Proteobacteria)與厚壁菌門(Firmicutes)為主[14]。

作為新西蘭特有的瀕臨滅絕的植食性鳥類,鸮面鸚鵡腸道微生物組成受到廣泛關(guān)注,研究發(fā)現(xiàn),鸮面鸚鵡腸道微生物以費(fèi)格森埃希菌(Escherichiafergusonii)為主,其分離株具有廣泛的碳水化合物代謝基因,能夠代謝腸道內(nèi)多種營養(yǎng)物質(zhì)；該菌株與其他腸道微生物間幾乎無關(guān)聯(lián),在不同的環(huán)境條件下,均保持鸮面鸚鵡穩(wěn)定的腸道生態(tài)系統(tǒng)[12,16- 17]。為了降低人工喂養(yǎng)的雛鳥的死亡率,養(yǎng)護(hù)人員將冷凍的健康成年鸮面鸚鵡糞便懸浮液喂養(yǎng)給圈養(yǎng)的雛鳥。然而,測定發(fā)現(xiàn),冷凍減少了糞便懸浮液中99.86%的菌群豐富,采用冷凍成鳥糞便補(bǔ)充雛鳥腸道微生物豐度的方法是需要進(jìn)一步考慮的[18]。

1.2 肉食性鳥類的腸道微生物研究現(xiàn)狀

關(guān)于肉食性鳥類腸道微生物的研究目前主要集中于王企鵝(Aptenodytespatagonicus)[19]、紋頰企鵝(Pygoscelisantarctica)、白眉企鵝(Pygoscelispapua)[20-21]、小企鵝(Eudyptulaminor)、短尾鸌(Ardennatenuirostris)[22]、家燕(Hirundorustica)[23- 24]、黑頭美洲鷲(Coragypsatratus)、紅頭美洲鷲(Cathartesaura)[25- 26]及部分水鳥[27- 28]。

肉食性鳥類腸道微生物組成中優(yōu)勢菌集中于厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。此外,在黑頭美洲鷲、紅頭美洲鷲、小企鵝、王企鵝、紅頸濱鷸(Calidrisruficollis)等肉食性鳥類腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)較高含量的梭桿菌(Fusobacteria)。

目前,肉食性鳥類腸道微生物的研究集中在兩方面內(nèi)容。一是關(guān)于腸道微生物的組成與功效的研究。以腐肉為食的黑頭美洲鷲和紅頭美洲鷲腸道微生物組成和結(jié)構(gòu)異常穩(wěn)定,以梭菌(Clostridia)和梭桿菌(Fusobacteria)為主要類群,此外,其腸道內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了斯特菌抗性細(xì)菌等有益微生物基因以及噬菌體、蛭型輪蟲等基因,體現(xiàn)了其腸道微生物對極端飲食的適應(yīng)[25- 26]。與以野生獵物為食的種群相比,采食牲畜腐肉的赤鳶(Milvusmilvus)種群腸道微生物中沙門氏菌(Salmonellasp.)感染率升高[29]。家燕是重要的食蟲益鳥,在家燕種群中,同巢雛鳥之間、配偶對之間腸道微生物相似性較高,且雛鳥的微生物多樣性高于成鳥[24]；腸道微生物組成與種群“平均腸道微生物”差異較大的成年個(gè)體往往具有較低的生存率[23]；種群水平上,具有相似腸道微生物組成的個(gè)體,對植物血凝素誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的相似度較高[30]。

另一方面研究主要集中于生長、發(fā)育、換羽、遷徙等生活史過程對鳥類腸道微生物結(jié)構(gòu)的影響[7]。黑腹濱鷸(Calidrisalpina)、半蹼濱鷸(Calidrispusilla)雛鳥出雛前胚胎中微生物數(shù)量極少,出雛后腸道微生物發(fā)生快速定植,推斷胚胎的內(nèi)臟很可能沒有微生物存在,腸道微生物很可能是通過環(huán)境接種而建立的[31]。短尾鸌發(fā)育過程中,腸道微生物群相對較穩(wěn)定,而小企鵝腸道微生物組成存在顯著的波動,厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)細(xì)菌豐度呈顯著上升趨勢,這兩種海鳥的成鳥與雛鳥間腸道微生物區(qū)系相似性均較低[22]。換羽禁食期間,王企鵝腸道微生物中梭桿菌門(Fusobacteria)豐富度增加,變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐富度下降；小企鵝腸道中厚壁菌門(Firmicutes)豐富度下降,擬桿菌門(Bacteroidetes)豐富度增加[19]；白眉企鵝細(xì)菌多樣性顯著增加,不同種群形成不同的細(xì)菌群落,腸道微生物的變化受鳥種的影響較大[20]。通過細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)隱鹮(Geronticuseremita)微生物樣本,顯示微生物的定植具有明顯的組織趨向性,不同組織間微生物群落差異顯著[32]。對紅頸濱鷸和彎嘴濱鷸(Calidrisferruginea)等遷徙水鳥的研究發(fā)現(xiàn),遷徙個(gè)體腸道內(nèi)放線菌(Actinobacteria)豐度始終高于未遷徙個(gè)體,特別是棒狀桿菌屬(Corynebacterium)細(xì)菌,其在遷徙個(gè)體腸道內(nèi)豐富度顯著提高[33]。

1.3 雜食性鳥類的腸道微生物研究現(xiàn)狀

目前,對雜食性鳥類腸道微生物的研究多集中于雀形目鳥類[7,34- 35]、雁形目鳥類[36- 37]以及紅嘴山鴉(Pyrrhocoraxpyrrhocorax)[38],翻石鷸(Arenariainterpres)[27]等種群。

雜食性鳥類的食物組成多樣,部分種群食性隨季節(jié)發(fā)生改變,其腸道微生物組成也相對復(fù)雜,以厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)細(xì)菌為主[7]。在大山雀(Parusmajor)[39]、加拿大黑雁(Brantacanadensis)[40]、白冠帶鹀(Zonotrichialeucophrys)[41]、針尾鴨(Anasacuta)、綠眉鴨(A.americana)、琵嘴鴨(A.clypeata)、綠頭鴨(A.platyrhynchos)[42]等的腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了豐富度大于1%的軟壁菌門(Tenericutes)。在斑頭雁(Anserindicus)[43]、白頭鶴(Grusmonachac)[44]、針尾鴨[42]中發(fā)現(xiàn)了豐富度大于1%的梭桿菌門(Fusobacteria)細(xì)菌。

雜食性鳥類腸道微生物的研究主要集中于三方面內(nèi)容。首先是人類活動對鳥類腸道微生物的影響。在加拉帕戈斯群島達(dá)爾文雀的研究中發(fā)現(xiàn),人類活動地點(diǎn)內(nèi)的中地雀(Geospizafortis)腸道微生物多樣性降低,與小地雀(Geospizafuliginosa)之間微生物多樣性差異增加[45]。白冠帶鹀腸道微生物多樣性與城市環(huán)境中的樹木覆蓋度、防水能力等相關(guān),城市環(huán)境中雄性白冠帶鹀腸道微生物多樣性顯著增加[41]。而在家麻雀(Passerdomesticus)的研究中發(fā)現(xiàn),城市化顯著改變了家麻雀腸道微生物的組成,城市環(huán)境中的家麻雀腸道內(nèi)含有更多來自變形菌門(Proteobacteria)的綱級和目級微生物,這些微生物與哺乳動物腸道內(nèi)多種疾病有關(guān)[35]。

其次,宿主遺傳、發(fā)育過程、不同腸道區(qū)域、食物組成等對鳥類腸道微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著性影響。寄生于喜鵲(Picapica)巢中的大斑鳳頭鵑(Clamatorglandarius)雛鳥腸道微生物結(jié)構(gòu)與巢內(nèi)喜鵲雛鳥顯著不同,其腸道中含有喜鵲雛鳥與大斑鳳頭鵑親鳥的混合微生物種群[46]。寄生于其它繁殖巢的斑胸草雀(Taeniopygiaguttata)雛鳥腸道微生物與養(yǎng)父母腸道微生物群落結(jié)構(gòu)相似度更高,而人工喂養(yǎng)的斑胸草雀雛鳥腸道微生物的多樣性較低,表明了鳥類雙親在塑造雛鳥腸道微生物多樣性中的重要性[47]。野生家麻雀雛鳥腸道微生物組成隨日齡的增加發(fā)生變化,在雛鳥第九天左右,腸腔內(nèi)變形菌門(Proteobacteria)的豐富度下降,厚壁菌門(Firmicutes)豐富度增加[48]。采用抗生素處理后,家麻雀雛鳥的生長速度和食物轉(zhuǎn)化效率提高[49]。斑頭雁成鳥泄殖腔微生物組成及多樣性均顯著高于雛鳥,成鳥與雛鳥間微生物結(jié)構(gòu)顯著不同[50]。在加拿大黑雁的研究中發(fā)現(xiàn),同一個(gè)體內(nèi)不同腸道區(qū)域微生物區(qū)系在豐富度、組成上顯著不同,結(jié)腸內(nèi)微生物豐度最高；不同個(gè)體間結(jié)腸微生物群落相似性最高,反映了消化道下游微生物群落的物理混合,這也是腸道內(nèi)不同微生物家族共存的主要原因之一[40]。長江中下游流域越冬的白額雁(Anseralbifrons)、豆雁(Anserfabalis)、鴻雁(Ansercygnoides)的腸道微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)、微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)等均存在顯著差異,但不同個(gè)體腸道微生物中均存在大量參與物質(zhì)和能量代謝的基因[51]。

此外,一些馴化鳥類的腸道微生物正在得到越來越多的關(guān)注[52]。野生西方松雞(Tetraourogallus)腸道微生物以互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、放線菌門(Actinobacteria)及梭菌目(Clostridiales)為主,但圈養(yǎng)的個(gè)體以γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)細(xì)菌為主。人工飼養(yǎng)的斑頭雁腸道微生物中擬桿菌門(Bacteroidetes)豐富度增加,腸道內(nèi)與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、能量代謝、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)等功能相關(guān)的微生物基因濃度顯著升高[43]。鴻雁是一種重要的經(jīng)濟(jì)型鳥類,與野生種群相比,養(yǎng)殖鴻雁腸道微生物中梭菌(Clostridium)豐富度降低,SMB53、腸球菌(Enterococcus)、類芽孢桿菌(Paenibacillus)豐富度升高[53]；其血液宏基因組和腸道宏基因組在糖酵解/糖異生、丙酸代謝、檸檬酸循環(huán)、淀粉和蔗糖代謝等功能基因上存在廣泛的富集共享[3]。

2 研究方法

野外條件下樣品獲取困難是導(dǎo)致野生鳥類腸道微生物研究較少的主要原因之一[6]。鳥類腸道微生物樣品獲取方法包括致死性采樣和非致死性采樣兩種。致死性采樣是指通過解剖,獲取鳥類不同腸道組織內(nèi)容物,測定其微生物的組成。該方法可以準(zhǔn)確反映鳥類不同腸道區(qū)域微生物的組成。但基于對鳥類種群保護(hù)的策略,致死性采樣僅用于實(shí)驗(yàn)室條件下樣本的獲取。如在鵪鶉(Coturnixjaponica)的研究中,通過解剖獲得腸道內(nèi)容物,分析其腸道微生物組成,并探究腸道微生物組成與宿主壓力應(yīng)激反應(yīng)間的關(guān)系[54]。

泄殖腔拭子、糞便等非致死性樣本是目前鳥類腸道微生物研究的主要樣本來源[1, 4,7,9]。如Corl等[55]采用無菌拭子采集獲得倉鸮(Tytoalba)泄殖腔內(nèi)微生物樣本。Teyssier等采用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗獲得家麻雀泄殖腔微生物樣本[8]。Fu等直接在白頭鶴活動地收集新鮮糞便,分析其腸道微生物組成[56]。非致死性樣本獲取方法簡單,對鳥類個(gè)體傷害較小,目前被越來越多的用于野生鳥類腸道微生物研究。但糞便、泄殖腔拭子只能反映鳥類大腸內(nèi)微生物組成,對個(gè)體不同腸道區(qū)域微生物組成的反映較差[9]。

野外條件下,樣本的保存同樣是限制鳥類腸道微生物研究的重要因素。為了更準(zhǔn)確的反映鳥類腸道微生物的組成,研究者通常采用-80℃液氮或-20℃冰箱保存鳥類糞便或泄殖腔拭子樣本[7,55]。但液氮或冰箱儲存條件增加了野外條件下的工作難度。近年來,乙醇保存的方法逐漸興起,Bodawatta等通過實(shí)驗(yàn)證明,乙醇保存樣本中細(xì)菌群落組成與新鮮樣品無顯著性差異,證明該方法確實(shí)可行[57]。

此外,基因組DNA的提取和擴(kuò)增是進(jìn)行腸道微生物測定的前提。對于小型鳥類,糞便樣品體積較小,DNA的提取量較低,提高PCR準(zhǔn)確度及深度對于提高測序精確度具有重要意義。Davidson等采用濾紙片吸附大山雀新鮮糞便樣本中的尿液,降低尿素對DNA擴(kuò)增的抑制作用,增加基因擴(kuò)增深度[58]；Luis Víquez-R等采用PNA-DNA夾方法,抑制加島嘲鶇(Mimusparvulus)線粒體DNA或飲食中葉綠體DNA的PCR擴(kuò)增,增加樣品擴(kuò)增序列的精確度[59]。

16S rRNA基因測序技術(shù)是目前常用的腸道微生物多樣性分析方法[5,7]。該方法測定準(zhǔn)確度較高,成本相對較低,被廣泛應(yīng)用于鳥類腸道微生物研究[3,49,53]。宏基因組測序技術(shù)通過對樣品中的全基因組DNA進(jìn)行高通量測序,分析樣本中微生物的群落結(jié)構(gòu)、基因功能、代謝網(wǎng)絡(luò)等信息。目前,該技術(shù)也被應(yīng)用于鳥類腸道微生物分析。如Wang等通過宏基因組測序技術(shù),分析野生及人工養(yǎng)殖的斑頭雁腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及基因功能[43]。腸道微生物的培養(yǎng)同樣是分析鳥類腸道微生物組成的重要手段,Lobato等以無菌拭子收集非洲圣多美島的綠棕鶇(Turdusolivaceofuscus)及相鄰加蓬大陸的非洲鶇(Turdusolivaceofuscus)泄殖腔內(nèi)微生物樣本,采用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)兩者在細(xì)菌組成上差異較大,鑒別的14個(gè)細(xì)菌類群中,僅5種共享,且綠棕鶇種群具有更高豐度的格蘭仕陰性細(xì)菌[60]。

3 總結(jié)與展望

近年來,隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展及腸道微生物研究方法的逐漸完善,野生鳥類腸道微生物相關(guān)研究顯著增加,人們對野生鳥類腸道微生物的組成、結(jié)構(gòu)特征及影響因素有了一定的了解,但目前的研究結(jié)果多為描述性研究,缺乏深入作用機(jī)制探究。

作為機(jī)體內(nèi)最龐大、最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng),腸道微生物與動物代謝、免疫防御等息息相關(guān)。Hologenome理論認(rèn)為,微生物群落與其宿主生物體一起進(jìn)化,在環(huán)境脅迫時(shí),有助于提高宿主的生存、表型可塑性和生殖性能等適應(yīng)參數(shù)。鳥類復(fù)雜的生活史、食性、婚配體制、飛翔生活等使其面臨較強(qiáng)的選擇性壓力,在這些壓力條件下,鳥類腸道微生物會發(fā)生怎樣的調(diào)整？其調(diào)整的策略及生理機(jī)制又是怎樣？在面臨全球氣候變暖的大背景下,野生鳥類腸道微生物又會發(fā)生怎樣的變化,以提高個(gè)體的適應(yīng)能力？這些變化對宿主的生存又產(chǎn)生怎樣的影響？這都需要人們深入探究。