日孜萬古力·艾山 努爾古麗·熱合曼 麥日艷古·亞生 伊力米熱·熱夏提

(1.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054)

吐魯番的坎兒井已有2 000多年的歷史，是吐魯番盆地生產(chǎn)、生活的重要水源[1-2]?？矁壕揽康叵掳登斔?，不受季節(jié)風(fēng)沙影響、蒸發(fā)量小、流量穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)為整個(gè)水系提供獨(dú)特的水質(zhì)和穩(wěn)定的微生物菌群的自然環(huán)境的同時(shí)[3-4]，這一相對(duì)封閉的環(huán)境有利于這一寶貴的水資源遠(yuǎn)離污染。有研究[5]表明，長(zhǎng)期飲用坎兒井水對(duì)人體有益。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于坎兒井的研究主要集中在對(duì)其水質(zhì)分析[6-7]及對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[8-9]和生態(tài)環(huán)境[10-11]的影響等方面，但對(duì)坎兒井微生物多樣性方面的研究尚未見報(bào)道。阿爾菲婭[12]研究表明，用坎兒井水和面不添加酵母粉也可以烤制出具有特殊風(fēng)味的馕，而且其品質(zhì)顯著優(yōu)于用自來水或其他飲用水制備的。但這一特殊的味道來自于面粉中的微生物還是坎兒井水中的微生物，坎兒井水質(zhì)能否影響面團(tuán)發(fā)酵過程，這方面還未見相關(guān)研究報(bào)道。研究擬以新疆吐魯番坎兒井水為研究對(duì)象，通過Illumina Miseq測(cè)序分析坎兒井水中的微生物群落多樣性，為坎兒井水的合理應(yīng)用及食用安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣本來源

于2020年9月11日，樣品分別采自阿木爾坎兒井(位于吐魯番市托克遜縣夏鄉(xiāng)喀格恰克村)，沙依坎兒井(位于吐魯番市葡萄鄉(xiāng)達(dá)甫散蓋村)，奧吾提坎兒井(位于吐魯番市葡萄鄉(xiāng)英薩村)，米依木阿吉坎兒井(位于吐魯番市亞爾鄉(xiāng)亞爾村)(樣品特點(diǎn)見表1)。每個(gè)樣點(diǎn)取10 L裝入無菌的水樣瓶?jī)?nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于4 ℃。每個(gè)樣品做3個(gè)平行，通過抽濾法在0.22 μm的纖維濾膜上富集微生物，抽濾完成后再將濾膜裝于無菌離心管中，用封口膜緊密地包裝并立即存放在-80 ℃冰箱凍存，用于檢測(cè)微生物多樣性。

表1 樣本信息

1.1.2 主要儀器設(shè)備

離心機(jī)：Eppendorf 5430R型，合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；

超微量分光光度計(jì)：NanoDrop2000型，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；

酶標(biāo)儀：BioTek ELx800型，美國(guó)Biotek公司；

微型熒光計(jì)：QuantiFluorTM-ST型，美國(guó)Promega公司；

電泳儀：DYY-6C型，北京六一儀器廠；

PCR儀：ABI GeneAmp?9700型，美國(guó)ABI公司；

測(cè)序儀：Illumina Miseq型，美國(guó)Illumina公司。

1.2 高通量測(cè)序及分析

1.2.1 高通量測(cè)序流程

取樣→環(huán)境樣品DNA抽提→設(shè)計(jì)合成引物接頭→PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物純化→PCR產(chǎn)物定量與均一化→構(gòu)建PE文庫(kù)→高通量測(cè)序

1.2.2 DNA提取、擴(kuò)增 樣品總DNA提取完成后，檢測(cè)利用1%瓊脂糖凝膠電泳提取的基因組DNA。在后續(xù)操作之前，應(yīng)將其貯藏在-20 ℃[13]。

采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)，真菌26S rRNA的ITS區(qū)，細(xì)菌和真菌所使用的正向引物和反向引物分別為338F和806R、ITS1F和ITS2R。細(xì)菌和真菌引物列表如表2所示，用ABI GeneAmp.9700型PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如表3所示。

表2 細(xì)菌、真菌特異性引物列表

表3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

PCR擴(kuò)增完成后，全部PCR產(chǎn)物采用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，用Tris-HCl洗脫，QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混勻后完成文庫(kù)制備，將文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。文庫(kù)的構(gòu)建與上機(jī)測(cè)序流程均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.2 生物信息分析 使用fastp(https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0)軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7)軟件對(duì)每個(gè)樣品的Reads進(jìn)行拼接，得到的序列為原始Tags數(shù)據(jù)；拼接得到的原始Tags數(shù)據(jù)，經(jīng)過過濾得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)。參照Qiime(V1.9.0，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags質(zhì)量控制流程，進(jìn)行Tags截取、長(zhǎng)度過濾后進(jìn)行去除嵌合體序列的處理，使用UPARSE軟件(http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類并剔除嵌合體。

利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，通過Mothor方法比對(duì)Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(設(shè)置比對(duì)閾值為70%)，獲得在各個(gè)分類水平上的信息。通過Qiime軟件計(jì)算Sobs、Chao、Shannon、Simpson、coverage等多樣性指數(shù)，用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線及Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。通過Qiime軟件(Version 3.3.1)計(jì)算Unifrac，并通過R軟件進(jìn)行物種組成分析及Beta多樣性指數(shù)組間差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌和真菌序列豐度及多樣性分析

通過測(cè)序，對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行拼接、質(zhì)控、優(yōu)化后共獲得細(xì)菌16S rRNA和真菌26S rRNA有效基因序列。無抽平得到的細(xì)菌原始序列為細(xì)菌583 710條，真菌716 621條。原始序列進(jìn)行過濾、優(yōu)化、拼接后總共獲得有效序列為細(xì)菌446 700條，真菌407 376條。基于97%一致性對(duì)OTUs進(jìn)行注釋，共得到2 586個(gè)OTUs。其中細(xì)菌1 456個(gè)OTUs、真菌1 130個(gè)OTUs。稀釋曲線趨于平緩，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，再增加測(cè)序量已不太可能檢測(cè)到新的微生物種[14]。如圖1所示，隨著樣本量的增加，細(xì)菌和真菌sobs曲線急劇上升，說明樣品群落中大量的物種被檢測(cè)到，隨后曲線逐漸平穩(wěn)，說明可以進(jìn)行以后的數(shù)據(jù)分析。

圖1 Sobs稀釋曲線

如圖2(a)所示，樣品T在橫坐標(biāo)上的寬度要比其他組寬度較寬，橫坐標(biāo)上的范圍也大，表明樣品T物種豐度高；其他樣品的垂直曲線逐漸平坦，表明物種分布均勻。如圖2(b)所示，樣品T的物種多樣性高，而其他樣品中優(yōu)勢(shì)菌群的所占比例很高，多樣性較低。

圖2 Rank-Abundance曲線

如表4所示，細(xì)菌的測(cè)序深度遠(yuǎn)高于真菌。細(xì)菌和真菌樣品A和M 的Sobs指數(shù)與Chao指數(shù)最低，說明樣品A和樣品M 的微生物群落豐富度最低。樣品T的Sobs指數(shù)與Chao指數(shù)最高，說明該樣品的微生物群落豐富度最高，多樣性也高。但是各樣品之間微生物群落多樣性無顯著性差異。Coverage指數(shù)對(duì)所有樣本的覆蓋率均在0.99以上，表明該測(cè)序水平可識(shí)別各樣本中所有的細(xì)菌和真菌系統(tǒng)類型，所得數(shù)據(jù)可靠。

表4 Alpha多樣性指數(shù)

2.2 物種組成分析

由圖3(a)可知，細(xì)菌4組樣品共有173個(gè)核心OTUs，樣品A獨(dú)有105個(gè)OTUs、樣品S獨(dú)有91個(gè)OTUs、樣品M獨(dú)有45個(gè)OTUs、樣品T獨(dú)有487個(gè)OTUs。表明樣品T中細(xì)菌微生物群落較其余組豐富。

由圖3(b)可知，真菌4組樣品共有13個(gè)核心OTUs，樣品A獨(dú)有48個(gè)OTUs、樣品S獨(dú)有56個(gè)OTUs、樣品M獨(dú)有52個(gè)OTUs、樣品T獨(dú)有868個(gè)OTUs。表明樣品T中真菌微生物群落較其余組豐富。

圖3 OTU水平上的Venn圖分析

2.3 不同樣品在細(xì)菌和真菌屬水平上的差異性分析

由圖4(a)可知，4組樣品細(xì)菌物種豐度均獨(dú)立，各樣品組內(nèi)聚在一起，組外距離較遠(yuǎn)，未出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，表明這些樣品在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上具有顯著差異。

由圖4(b)可知，來自吐魯番市內(nèi)的3組樣品交叉聚集在一起，來自托克遜縣的樣品與其余組存在一定的差異。樣品A與其他3組樣本雖距離較近，但未相互重疊，群落組成相互獨(dú)立。4組樣品的群落組成結(jié)構(gòu)可以分為2種類型：樣品M、T、S 3組相互重疊，表明3組樣品的真菌群落組成較相似。這3種樣品都有大豐富度油壺菌屬(Olpidium)分別占31.84%，16.38%，15.77%為主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，真菌的菌群組成和豐富度的區(qū)別較小。此外樣品A分布相互獨(dú)立，未出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，組內(nèi)分布較散，表明該組的真菌群落組成結(jié)構(gòu)差異較大。

圖4 基于加權(quán) Uni Frac 距離的不同樣品 PCoA圖

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析及優(yōu)勢(shì)菌屬

2.4.1 不同樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析及優(yōu)勢(shì)菌屬 為了研究樣品的物種組成多樣性信息，對(duì)所有樣品有效序列進(jìn)行聚類，以97%的序列相似性將序列聚類成為OTU(可操作分類單元，相當(dāng)于種水平)再深度分析。結(jié)果顯示，4種樣品細(xì)菌16S rRNA共涉及到40個(gè)門，變形菌門(Proteobacteria)是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，占據(jù)87.48%～94.90%，其次是擬桿菌門(Bacteroidota)占據(jù)0.49%～3.70%，詳見表5。

表5 門水平上各樣品細(xì)菌相對(duì)含量(序列所占比例)

基于16S rRNA分析，從4種樣品中共測(cè)出537個(gè)細(xì)菌屬，其中嗜氫菌屬(Hydrogenophaga)為優(yōu)勢(shì)菌屬，其次是未鑒定的絲毛單胞菌屬(unclassified_f_Comamonadaceae)、曲桿菌屬(Curvibacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(詳見圖5)。

圖5 細(xì)菌屬水平群落Bar圖

樣品A中特有的優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜氫菌屬(Hydrogenophaga)占34.31%；樣品S中特有的優(yōu)勢(shì)菌屬為曲桿菌屬(Curvibacter)占36.33%；樣品M中特有的優(yōu)勢(shì)菌屬為未鑒定的絲毛單胞菌屬(unclassified_f_Comamonadaceae)占34.84%；樣品T中特有的優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜氫菌屬(Hydrogenophaga)占57.66%。優(yōu)勢(shì)菌可能來自地下坎兒井水附近的土壤中的微生物，其成為優(yōu)勢(shì)的原因可能是坎兒井依靠地下暗渠輸水環(huán)境相對(duì)封閉，不受外界及四季變化的影響，其溫度常年幾乎是恒定的，這些優(yōu)良自然特征仍待進(jìn)一步研究。

對(duì)4種坎兒井水中的細(xì)菌進(jìn)行分析結(jié)果表明，在16S rRNA門水平上，樣品A、S、M、T中的優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門(Proteobacteria)，分別占87.48%，94.90%，94.87%，93.22%。在屬水平上，樣品A、T中優(yōu)勢(shì)菌屬是嗜氫菌屬(Hydrogenophaga)，分別占34.31%，57.66%；樣品S中優(yōu)勢(shì)菌屬是曲桿菌屬(Curvibacter)，占36.33%；樣品M中優(yōu)勢(shì)菌屬是不可鑒定的絲毛單胞菌屬(unclassified_f_Comamonadaceae)，占34.84%。在種水平上，樣品A、S、T中優(yōu)勢(shì)菌種是不可鑒定的嗜氫菌種(unclassified_g_Hydrogenophaga)，分別占32.02%，23.69%，57.53%；樣品M中優(yōu)勢(shì)菌種是未鑒定的絲毛單胞菌種(unclassified_f_Comamonadaceae)，占34.84%。

2.4.2 不同樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)分析及優(yōu)勢(shì)菌屬 基于ITS測(cè)序門水平，4種樣品共涉及12個(gè)門，子囊菌門(Ascomycota)是主要優(yōu)勢(shì)菌門，占據(jù)44.59%～61.07%，其次是油壺菌門(Olpidiomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、未鑒定的真菌門(unclassified_k_fungi)、其他真菌門豐富度<5%(詳見表6)。

表6 門水平上各樣品真菌相對(duì)含量(序列所占比例)

基于ITS分析，4種樣品共涉及568個(gè)真菌屬，其中油壺菌屬(Olpidium)為優(yōu)勢(shì)菌屬，其次是未鑒定的真菌屬(unclassified_k_fungi)、枝孢屬(Cladosporium)(詳見圖6)。

圖6 真菌屬水平群落Bar圖

樣品A特有的優(yōu)勢(shì)菌屬為未鑒定的真菌屬(unclassified_k_fungi)占27.68%；樣品S特有的優(yōu)勢(shì)菌屬為油壺菌屬(Olpidium)占15.77%；樣品M特有的優(yōu)勢(shì)菌屬為油壺菌屬(Olpidium)占31.84%；樣品T特有的優(yōu)勢(shì)菌屬為油壺菌屬(Olpidium)占16.38%。坎兒井飲用水的自我凈化能力、民間流傳的助于消化、消除疲勞等功能等科學(xué)問題，仍待通過進(jìn)一步研究水質(zhì)分析、分離鑒定其中可培養(yǎng)的微生物菌株及其產(chǎn)酶活性檢測(cè)等研究結(jié)果才能得到解析。

對(duì)4種坎兒井水中的真菌進(jìn)行分析結(jié)果表明，在26S rRNA 門水平上，樣品A、S、M、T中優(yōu)勢(shì)菌門均為子囊菌門(Ascomycota)，分別占56.76%，61.07%，46.92%，44.59%。在屬水平上，樣品A中優(yōu)勢(shì)菌屬為未鑒定的真菌屬(unclassified_k_fungi)，占27.68%；樣品S、M、T中優(yōu)勢(shì)菌屬為油壺菌屬(Olpidium)，分別占15.77%，31.84%，16.38%。在種水平上，樣品A中優(yōu)勢(shì)菌種是未鑒定的真菌種(unclassified_k_fungi)，占27.68%；樣品S、M、T中優(yōu)勢(shì)菌種是油壺菌種(Olpidiumsp)，分別占15.77%，31.49%，16.38%。此外還檢出Candida、Pichia、Mortierella、Aspergillus、Alternaria等菌屬，以上屬的占比雖少，但它們能影響傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶風(fēng)味的形成及成熟過程[15-16]。Candida、Pichia等屬還參與傳統(tǒng)發(fā)酵飲料博扎的發(fā)酵過程，而且是博扎發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌屬[17-18]。Candida也是發(fā)酵飲料開菲爾中的酵母之一，它給開菲爾帶來醇味、脂香和CO2的同時(shí)起到改善開菲爾口感的作用[19]。

阿爾菲亞等[12,20]曾采用阿木爾坎兒井水(試驗(yàn)中的樣品A)制成的傳統(tǒng)馕餅酸面團(tuán)進(jìn)行微生物多樣性分析，結(jié)果顯示其優(yōu)勢(shì)菌門為Firmicutes、Ascomycota。該結(jié)果與試驗(yàn)中的相比較，雖然在門水平有共同點(diǎn)，但是在屬水平存在很大的差距。與吐魯番傳統(tǒng)馕餅面團(tuán)相比，用坎兒井水和的面團(tuán)芳香類物質(zhì)種類豐富，相對(duì)百分含量較高[20]。因此推測(cè)：坎兒井水中微生物并非是新疆馕餅傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)中優(yōu)勢(shì)微生物直接來源，可能是坎兒井水中某些成分影響面團(tuán)發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)微生物變化趨勢(shì)，影響了酸面團(tuán)揮發(fā)性物質(zhì)的種類及其變化，從而改善了馕餅風(fēng)味。

變性菌門是細(xì)菌中最大的一個(gè)門，包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等。試驗(yàn)過程中未從坎兒井水中檢測(cè)出對(duì)人體有毒有害的微生物信息，符合GB 8537—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水》和GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)食品加工用水微生物的要求。

3 結(jié)論

采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)新疆吐魯番4種不同坎兒井飲用水進(jìn)行微生物群落組成及多樣性分析。結(jié)果表明：細(xì)菌在屬水平，嗜氫菌屬占優(yōu)勢(shì)，其次為不可鑒定的絲毛單胞菌屬、曲桿菌屬、單胞菌屬；在種水平，不可鑒定的嗜氫菌種占優(yōu)勢(shì)，其次是不可鑒定的絲毛單胞菌種。關(guān)于真菌多樣性方面在屬水平上，油壺菌屬占優(yōu)勢(shì)，其次是不可鑒定的真菌屬；在種水平，油壺菌種占優(yōu)勢(shì)，其次是不可鑒定的真菌種。但關(guān)于坎兒井水質(zhì)的物理化學(xué)等其他指標(biāo)能否符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、當(dāng)?shù)鼐用衲芊癜残娘嬘?、能否滿足于食品加工用水的要求、坎兒井水對(duì)飲食文化及人類健康的貢獻(xiàn)等方面之后再進(jìn)一步深度研究。