張子悅紀 藝冉 強魏 巍王 宇李 亮蔡 健陳笑蕓

（1.阜陽師范大學生物與食品工程學院，安徽阜陽236037；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，杭州310021；3.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京100081）

柑橘黃龍病又稱黃枯病、青果病，是柑橘行業(yè)最嚴重、最具有毀滅性病害之一，是我國主要植物檢疫對象。致病菌屬于革蘭氏陰性細菌的α－變形菌綱韌皮部桿菌屬[1]。據(jù)報道，該類韌皮部桿菌是一種極難培養(yǎng)的細菌，迄今為止沒有成功培養(yǎng)的先例[2]，為柑橘黃龍病的有效防治增添了巨大的阻礙。植物一旦感染黃龍病，葉片出現(xiàn)斑駁型黃化，淀粉的積累量是其他逆境脅迫的20倍，果實呈畸形，果小味酸，嚴重影響生理營養(yǎng)品質[3]，使得柑橘品質顯著下降。

為了及時切斷感染源，應當進一步推進和加強黃龍病菌的快速檢疫和診斷工作。黃龍病病原菌的檢驗主要基于分子生物學水平，有核酸分子雜交檢疫技術，基因芯片技術，常規(guī)PCR、巢式PCR、半巢式PCR、定量PCR檢測技術等。

實時熒光PCR（qPCR）與傳統(tǒng)的PCR技術相比具有特異性強、敏感度高、重復性好的優(yōu)點，是1996年美國首次推出的一種核酸檢測技術。2004年，廖曉蘭等[4]首創(chuàng)基于柑橘黃龍病病原菌16S rDNA的qPCR檢測方式，為黃龍病的定量快速檢測開創(chuàng)了先河。2006年，LI等[5]針對黃龍病病原菌的16S rDNA首次開發(fā)了定量、多重、實時、熒光PCR反應，可同時檢測亞洲、非洲、美洲3種黃龍病，可在不到1h的時間內檢測病原體。2007年，胡浩[6]又利用qPCR探究了柑橘病原菌在宿主體內結構的分布情況，得出病原菌會集中在富含篩管組織的部分，如種皮、橘絡、葉脈等都是韌皮部桿菌聚集地的結論。2011年，肖遠輝等[7]根據(jù)黃龍病病原菌的secE基因的保守序列設計引物探針，建立了黃龍病的qPCR鑒定技術，并對所建立的方法在田間進行實際檢驗，最低檢測限達0.01 ng。2014年，高玉霞等[8]將不同基因上設計的兩種引物探針進行qPCR靈敏度的比較，結果顯示李文斌設計的HLBaspr探針靈敏度高于王浩設計的CQULAP探針，證明了HLBaspr探針更加適用于實際的檢測。2016年，趙培婭等[9]針對qPCR兩組探針法和一組染料法的引物進行靈敏度比較和實檢，結果和高玉霞等人的研究結論一致。

數(shù)字PCR（dPCR）是VOGELSTEIN、KINZLER[10]在1999年提出的一種無需標準曲線和對照標準樣品就可實現(xiàn)絕對定量分析的新型技術。2018年，ZHONG等[11]首次提出應用dPCR來完成對黃龍病病原菌的檢疫實驗。但是由于其操作費時費力，使用儀器也相對昂貴，之后在黃龍病檢測方面再無報道。

近幾年由于對植物疫病現(xiàn)場檢測的迫切需要，各種快速檢測技術興起。2005年，OKUDA等[12]首次將環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）運用在黃龍病的快速檢測上，只需一個水浴鍋即可完成檢測過程。2018年，QIAN等[13]建立了與染料法結合的重組酶介導等溫擴增技術 （recombinese polymerase amplification，RPA）檢測黃龍病的現(xiàn)場可視化方法，并且發(fā)明了避免污染的一體化裝置，整個過程控制在10 min之內，方便快捷。

對于實驗室的分子檢測，選擇特異性強、靈敏度高的引物探針非常重要。為滿足黃龍病大規(guī)?？焖贆z測的需求，本研究開發(fā)比較了6組引物和探針組合，擴增片段大多在亞洲黃龍病菌16S rDNA上，該基因長度約1.5kb，含有高度保守的基因片段[14]，是進行檢測引物開發(fā)和設計的絕佳片段。將自行設計的一對引物和前人已報道的引物進行特異性、靈敏度的比較，致力于尋找出一對優(yōu)質的引物探針，為柑橘黃龍病的檢疫工作提供參考，使及時鏟除黃龍病感染源、提升柑橘質量及其營養(yǎng)品質成為可能。

一、材料與方法

（一）試驗材料感染柑橘黃龍病的柑橘葉片，陰性對照采用本實驗室培養(yǎng)箱種植的無病毒健康柑橘葉片。大腸桿菌DNA、西瓜嗜酸菌DNA、柑橘潰瘍病菌DNA、放線菌DNA、空氣芽孢桿菌DNA。 預 混 液ddPCR Supermix for Probes和Droplet Generation Oil for Probes購自美國Bio－Rad公司。Premix Ex Taq（Probe qPCR）預混液購自TaKaRa公司。

（二）主要儀器研究采用CFX 96熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）進行定量PCR分析。采用QX200微滴式數(shù)字PCR儀（美國Bio-Rad公司）進行數(shù)字PCR分析。使用Nanodrop核酸蛋白測定儀（美國Thermo公司）進行DNA濃度和純度的檢測。采用Qubit 2.0 Q32866熒光計（美國Thermo公司）進行DNA濃度的檢測。

（三）樣品前處理采摘的柑橘葉片置于內存冰塊的保溫泡沫箱中帶入實驗室，去除污垢和腐爛葉片，用蒸餾水清洗，再用巴氏消毒液與蒸餾水1:100的比例混合進行清洗，于通風處晾干，干燥后保存在－70℃的冰箱中備用。柑橘葉片基因組DNA的提取采用CTAB法，參考王春梅等[15]的方法稍作修改。

（四）引物與探針根據(jù)亞洲柑橘黃龍病病原菌16S rDNA（NCBI登錄號：MZ050492.1）的序列設計引物，加上通過查閱相關文獻和國家及地方標準，總共對6組引物探針進行收集比較（見表1）。CLIB 4組合根據(jù)NCBI登錄號EU078703序列設計。引物探針對由生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。

表1 柑橘黃龍病PCR檢測所用引物

續(xù)表1

（五）qPCR和dPCR方法以黃龍病癥狀明顯的柑橘葉片提取的DNA為陽性模板，用連續(xù)3倍濃度稀釋的方法稀釋10次，用上述6對引物進行PCR擴增。采用dPCR法為陽性模板DNA拷貝數(shù)進行定值，可作為qPCR測定的絕對定量標準。此前對qPCR和dPCR的反應體系和反應程序進行了優(yōu)化。最終優(yōu)化選擇的qPCR反應擴增的總體系為25μL，包含2×qPCR Mix 12.5μL、上下游引物各1μL（終濃度為0.4μmol/L）、探針0.5μL（終濃度為0.2μmol/L）、ddH2O8μL、模板DNA 2 μL。擴增程序為：95℃5 min，95℃15 s， 56℃1 min，共40個循環(huán)。最后在CFX 96熒光定量PCR儀上讀取Ct值，每組3個重復。

總dPCR反應體積為20μL，包含2×ddPCR supermix 10μL、上下游引物各1μL（終濃度為0.5μmol/L）、探針0.5 L（終濃度為0.25μmol/L），ddH2O 5.5μL、模板DNA 2μL。反應步驟：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，一共44個循環(huán)，最后98℃持續(xù)10 min使酶滅活。反應結束之后，移到QX200微滴分析儀上對微滴進行計數(shù)，每組4個重復。

二、結果

（一）特異性檢測將提取的柑橘DNA、大腸桿菌DNA、西瓜嗜酸菌DNA、柑橘潰瘍病菌DNA、放線菌DNA、空氣芽孢桿菌DNA分別采用 引 物CLIB 4、CLIB 9、CLIB 11、CLIB 12、Las、rpll進行熒光定量PCR擴增，結果見圖1。如圖1所示，6對引物在陽性柑橘DNA樣品中都有明顯的擴增曲線，且Ct值在25左右，其他供試菌均沒有熒光信號產(chǎn)生。說明6對引物特異性良好，都可用于黃龍病菌的實際檢測。

圖1 6對引物特異性檢測結果

（二）采用dPCR對各稀釋倍數(shù)樣品定值將提取的DNA陽性模板用連續(xù)3倍濃度稀釋的方法稀釋10次，得到1、3、9、27、81、243、729、2 187、6 561、19 683稀釋倍數(shù)的陽性模板DNA。采用dPCR進行各個樣品定值，分別為20 295、7 056.25、2 230、736.25、259.5、91.25、41.75、16.25、9.5、4.8拷貝。

（三）低樣本量qPCR檢測結果比較選擇81倍稀釋和243倍稀釋的低濃度陽性DNA模板用上述6對引物進行qPCR擴增，旨在證明對于存在少量病原菌的情況下哪一對引物的檢測效果更好，能夠更早檢驗出該病菌（結果見圖2、圖3）。由圖2、圖3可以看出，在81倍稀釋下和243倍稀釋下的同濃度的模板DNA采用引物CLIB 4和引物rpll的起峰值明顯晚于其他引物，表明在檢測低濃度的樣品時引物CLIB 4和引物rpll的靈敏度稍差于其他引物。圖4顯示在81倍稀釋下3次重復的平均Ct值，Las

圖2 81倍稀釋下各引物在檢測中的擴增曲線

圖3 243倍稀釋下各引物在檢測中的擴增曲線

圖4 81倍稀釋下各引物在檢測中的Ct值

圖5 243倍稀釋下各引物在檢測中的Ct值

（四）qPCR標準曲線與檢測限比較將提取的DNA陽性模板用連續(xù)3倍濃度稀釋的方法稀釋10次，得到1、3、9、27、81、243、729、2 187、6 561、19 683稀釋倍數(shù)的陽性模板DNA。采用CLIB 9、Las、CLIB 11這3對引物進行擴增以判斷引物靈敏度的高低，結果見圖6。結果表明，CLIB 9在稀釋得到的10個陽性樣品模板中，有9個明顯的擴增曲線，隨著稀釋倍數(shù)的增加，樣品濃度不斷降低，Ct值不斷升高，其中稀釋6 561倍的DNA樣品平均Ct值達到38.61，在高于6 561倍稀釋的qPCR中無法檢驗出熒光擴增曲線。參考GB/T 28062－2011，Ct值≤35為陽性樣品，Ct值＞35為陰性樣品[17]。對于較低濃度的樣品Ct值較高則不能準確判斷是否感染黃龍病，需要進行進一步的檢測。引物Las在稀釋得到的10個陽性樣品模板中均可得到擴增曲線，其中稀釋6 561倍的DNA陽性模板樣品平均Ct值為37.89，稀釋19 683倍的DNA陽性模板樣品平均Ct值為38.39。引物CLIB 11在稀釋得到的10個陽性樣品模板中可得到9個擴增曲線，其中稀釋6 561倍的DNA陽性模板樣品平均Ct值達到37.96，稀釋倍數(shù)高于6 561的沒有熒光擴增曲線。初步判斷這3組引物的靈敏度Las>CLIB 11=CLIB 9，Las的檢測靈敏度比CLIB 11、CLIB 9高出3倍。擴增效率方面CLIB 9為98.9%，Las為101.7%，CLIB 11略低，為97.3%，都在90%～110%之間，表明擴增效率較為理想。且3對引物的標準曲線決定系數(shù)R2為0.999（＞0.98），表示qPCR的擴增線性關系良好。

圖6 3種引物qPCR在柑橘黃龍病菌檢測的靈敏度和標準曲線測試

進一步做檢測限研究，將CLIB 9和CLIB 11在6 561倍的稀釋濃度下設置8個重復，Las在19 683倍的稀釋濃度下設置8個重復，結果見表2。結果顯示，在6 561倍稀釋下引物CLIB 9和CLIB 11所設置的8個平行反應都有熒光信號，Ct平均值分別為37.48和37.77。對建立的qPCR方法，要求在線性動態(tài)范圍內的重復性的相對標準偏差RSD一般應＜25%[18]。CLIB 9和CLIB 11 8次的檢測結果RSD分別是0.23%和3.86%，都＜25%，因此該兩種方法的檢測限為9.5拷貝。在19 683倍稀釋濃度下引物Las的8個平行反應都存在熒光信號，平均Ct值為38.58，RSD為2.91%（＜25%）。因此由實驗室內的驗證估測引物Las的檢測限為4.8拷貝。即靈敏度Las>CLIB 11＝CLIB 9，引物Las相對于其他引物對，可以檢測出更加微量感染黃龍病的柑橘基因組DNA，能用于黃龍病菌的早期檢驗。

表2 3組引物的檢出限研究

（五）dPCR檢測微滴范圍介于正負液滴之間的熒光單位被稱為“雨滴現(xiàn)象”，正、負液滴之間的區(qū)別越明顯，閾值位置對其拷貝數(shù)的影響就越小，越接近真值。降雨通常是由于PCR延遲出現(xiàn)，或個別微滴的部分PCR被抑制所導致[19]。將陽性模板DNA用CLIB 9、Las、CLIB 11 3對引物進行dPCR擴增，在dPCR的反應熱圖（見圖7）中，引物對CLIB 9與Las、CLIB 11的反應微滴熒光強度存在顯著的差異，CLIB 9在反應過程中沒有將陽性信號微滴與陰性信號微滴明顯區(qū)分開， “雨滴現(xiàn)象”嚴重，表明此引物探針在dPCR反應中不適用。Las、CLIB 11反應熱圖中陽性信號微滴與陰性信號微滴很好地區(qū)分開，并且沒有明顯的“下雨”現(xiàn)象，且相比之下CLIB 11略好一些，表明這兩條引物對都可用于dPCR檢測。CLIB 9檢測出的陽性微滴拷貝數(shù)顯著低于其他兩對，Las、CLIB 11檢測到的陽性微滴的拷貝數(shù)相對穩(wěn)定，這可能與所設計的引物探針組合所在基因位置存在差異有關。

圖7 3種引物dPCR測試

三、討論與結論

黃龍病病原菌是我國柑橘行業(yè)發(fā)展的頭號威脅者，其對柑橘的生長和營養(yǎng)品質造成嚴重的損害，使果實可食率降低，維生素C、類胡蘿卜素和類黃酮等營養(yǎng)物質不同程度流失，柑橘口感風味喪失[20]，無論在生態(tài)環(huán)境還是經(jīng)濟上都造成巨大損失。本文主要針對16S rDNA保守性極強的基因序列，比較6種定量PCR引物在qPCR中的檢測限和在dPCR中的適用性。2007年，丁芳等[21]進行過定性引物靈敏度比較實驗，結果顯示P400F/P400R>P535F/P535R>f A2/r J5>OI1/OI2c>f OI2/r23S1。2015年，高玉霞[22]對傳統(tǒng)PCR檢測黃龍病的6對引物進行靈敏度的比較，得出Las606/LSS>16S>P400>OI1/OI2c＝P535＝A2J5。2019年，肖婉鈺和黃江華[23]比較了定性引物的靈敏度，得出OI1/OI2c>P3/P4>P1/P2。以上都證明在柑橘黃龍病菌的16S rDNA基因上設計的引物具有高度的特異性、保守性，與本實驗結果相似。本研究在對其中都處于16S rDNA序列位置的3對熒光定量PCR引物的靈敏度進行比較，得出Las>CLIB 11＝CLIB 9，引物Las可檢測到僅4.8拷貝的黃龍病病原菌，檢測效果最好。dPCR也顯示引物Las和CLIB 11可以很好地將陽性微滴和陰性微滴區(qū)分開來，同時也可作為dPCR引物探針使用，這與ZHONG等[11]的研究結果一致。同時研究也證明引物的靈敏度和擴增的片段長度有著很大的關系，擴增片段越小，靈敏度越大[24]，建議在柑橘黃龍病菌檢測引物的設計和選擇上采用16S rDNA上的擴增較短序列進行實驗。dPCR雖然可以精確捕捉到超低微量的黃龍病病原菌，為幫助技術人員判斷黃龍病的早期感染提供積極有效的方法，但此技術在我國并未進行大規(guī)模的推廣應用。原因可能是此方法需要昂貴的儀器，且操作相對復雜[25]。最新研究顯示，抑菌泛素寡核苷酸（antibacterial FANA oligonucleotides）被證明是治療黃龍病的一種新方法，是一種類似于轉錄后的RNA沉默技術，可以通過作用于減少黃龍病病原菌的共生菌體從而達到減少黃龍病病原菌的效果，最終降低黃龍病病菌的傳播[26]，可以在一定程度上減緩黃龍病病原菌對藥物的耐受性。建議未來可同時將殺蟲劑、清除受感染的樹木、通過RNA干擾控制基因表達、基因編輯等多種方法工具結合，納入黃龍病綜合控制管理的計劃范圍之內，并且同時發(fā)展高質量的一體化可用于現(xiàn)場的快速檢測技術，為更好地防控黃龍病，從而提升柑橘品質及其食用安全建立起更高效的技術平臺。