趙程祥 陳蘇蒙 張宏達 賈 曼 孫永躍 陳 剛

(1.天津理工大學化學化工學院，天津300384；2.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質量安全重點實驗室，北京100081)

核磁共振（Nuclear magnetic resonance，簡稱NMR）技術是基于原子核磁特性的一種波譜技術，也是用于解釋小分子和大分子結構的著名分析技術。具有化學位移和耦合常數(shù)的1H NMR譜圖可以給出分子內(nèi)和分子間共振的定量關系信息，因此NMR技術被作為鑒定有機化合物結構和研究化學動力學的先進儀器分析方法得到應用。NMR技術于20世紀中期由荷蘭物理學家GOVETER最先發(fā)現(xiàn)，后由美國物理學家BLOCH和PURELL加以完善，兩人也因此成就獲得1952年諾貝爾物理學獎。1987年，ERNST等[1]首次利用傅里葉變換核磁共振光譜，將NMR技術擴展到二維層次。

近年來，NMR技術在食品質量與安全方面被廣泛應用，因其處理復雜代謝混合物的特殊能力，也成為了食品代謝組學研究領域的首選技術。NMR方法學可用于表征食品的質量和真實性，也可用于識別假冒產(chǎn)品[2]。NMR可以根據(jù)具體應用，采取有針對性的方法（可以是靶向分析，也可以是非靶向分析）來識別特定食品中的特定標識物或摻假[3]。在某些情況下，食品真實性或摻假的表征不能簡單地局限于單個或幾個標記化合物的鑒定，必須根據(jù)幾種化合物的組合或食品的整個代謝物特征進行分析。在這種情況下，就可以使用NMR的非靶向分析方法，這種方法允許對復雜混合物的化學成分進行表征，同時提供關于廣泛代謝物或一組選定代謝物的信息。隨著研究的深入，利用NMR技術分析有關食品欺詐和食品特性的復雜問題的研究已顯著增多[4]。

雖然其他技術如氣相色譜質譜聯(lián)用（GC－MS）、液相色譜質譜聯(lián)用（LC－MS）越來越多地用于食品質量與安全方面的研究，但NMR技術具有許多獨特的優(yōu)勢，特別是對樣品結構性質無損傷性、易于量化、幾乎不需要或不需要分離、允許識別新化合物并且不需要化學衍生等優(yōu)勢[5]。NMR技術特別適合用于GC－MS或LC－MS難以分析的化合物，如糖、胺和揮發(fā)性酮等化合物。NMR技術的一個關鍵缺點是靈敏度不高，檢測下限為1～5 mg，并且需要相對較大的樣本量（500μL）。然而，隨著近期更高磁場磁體（900 MHz）、低溫冷卻探頭（將信號增加3倍）和小體積微探針（60μL）的引入，一些靈敏度問題開始變得不那么令人擔憂[6]。

隨著技術的發(fā)展，二維核磁譜圖 （1H－1H COSY NMR、1H－1H TOCSY NMR、1H－13C HMQC NMR、1H－13C HMBC NMR）也被廣泛地應用于定量檢測與分析當中，而且二維譜圖相比一維譜圖有著更高的檢測限和精密度，可以用于食品中微量物質的定量檢測。

一、 核磁共振的原理

原子核是帶正電荷的自旋粒子，表現(xiàn)出磁偶極矩。在外部磁場的作用下， 具有磁性的原子核存在不同能級，當用特定頻率的電磁波照射樣品，且當外加射頻場的頻率與原子核自旋進動的頻率相同（Larmor頻率）時，射頻場的能量才能被原子核有收效地吸收。因此，對于給定的原子核，在給定的外加磁場中，只能吸收特定頻率射頻場提供的能量。原子核吸收電磁能發(fā)生躍遷，產(chǎn)生共振吸收信號，所得到的吸收圖譜為核磁共振譜[7]。NMR現(xiàn)象來源于原子核的自旋角動量在外加磁場作用下的進動，而自旋角動量的具體數(shù)值是由原子核的自旋量子數(shù)決定的[8]。目前，只有自旋量子數(shù)等于1/2的原子核才能夠產(chǎn)生共振信號，可以產(chǎn)生信號的原子核有1H、11B、13C、17O、19F、31P和23Na等。

二、核磁共振波譜技術在食品質量與安全方面的應用研究

（一）核磁共振波譜技術在水果質量與安全方面的應用在檢測水果代謝物方面，KIM等[9]利用1H NMR技術研究了黑樹莓果實不同成熟階段各種化合物（如氨基酸、有機酸、糖和酚類化合物）的相對水平，還比較了3種不同溶劑體系中指定化合物的總數(shù)和種類。結果表明，隨著黑樹莓果實的成熟，蔗糖和大多數(shù)氨基酸及有機酸減少，而果糖、葡萄糖和花青素的相對濃度增加。JOHN等[10]利用1H NMR技術與主成分分析方法檢測了蔓越莓標準品和3種蔓越莓補充劑，得到的大多數(shù)產(chǎn)品的代謝特征有很大差異，主要的差異代謝物包括檸檬酸和蔓越莓皮成分熊果酸、齊墩果酸和金絲桃苷。FRANCINI等[11]通過1H NMR技術對干蘋果和新鮮蘋果的多酚含量進行了研究，研究中將定量NMR光譜與主成分分析相結合，并量化了幾種多酚（如兒茶素、表兒茶素和綠原酸），這些多酚對于確定不同品種的蘋果的營養(yǎng)價值有著重要意義。VLASIOS等[12]開發(fā)了一種允許在一次運行中檢測甜櫻桃果實初級和次級代謝物的1H NMR方法，在研究中發(fā)現(xiàn)糖和有機酸的診斷峰位于脂肪族區(qū)域，酚類化合物位于芳香族區(qū)域，花青素位于8.2×10－6～8.6×10－6。這種方法為甜櫻桃果實代謝物變化的定量和定性表征提供了統(tǒng)一的工具，可以進一步利用它來監(jiān)測其他肉質水果代謝物隨時間的變化。

NMR技術也可以用于水果成分與真實性的研究。DELPINO－RIUS等[13]利用1H NMR技術結合主要代謝物和酚類化合物的數(shù)據(jù)，來區(qū)分加工和未加工的桃泥、單獨和混合的桃泥，也可用于區(qū)分梨汁的品種。?I?EK等[14]使用二維定量NMR來選擇性地確定羅漢果中11－α－羥基羅漢果苷的含量，從而預測羅漢果的甜味程度。將同核（COSY）和異核（HSQC）方法進行比較，發(fā)現(xiàn)兩種技術都適用于羅漢果提取物的質量控制，二維定量NMR在準確度、精密度和定量限方面具有優(yōu)勢。MARCHETTI等[15]選擇蘋果汁、橙汁、菠蘿汁和石榴汁為研究對象建立實驗計劃，根據(jù)中心復合設計（CCD）以不同比例混合研究對象，使用抑制水信號的核Overhauser增強光譜（NOESY）實驗與偏最小二乘（PLS）回歸分析相結合的方式進行分析，研究結果證明了1H NMR光譜數(shù)據(jù)結合多變量分析來開發(fā)和優(yōu)化檢測果汁摻假校準模型的可行性和優(yōu)勢。

在水果產(chǎn)地溯源方面，MARUENDA等[16]對來自秘魯安第斯山脈8個不同地區(qū)的紫蘇果通過NMR平臺進行了代謝分析，明確鑒定出24種化合物，并對16種化合物進行量化。單向方差分析和事后圖基（Tukey）檢驗表明，所有量化的代謝物在不同區(qū)域之間都存在顯著變化，并通過偏最小二乘判別分析（PLS－DA）揭示了基于其代謝特征的區(qū)域之間的明顯分離，突出了NMR在確定秘魯紫蘇果產(chǎn)區(qū)差異方面的區(qū)分能力。

（二）核磁共振波譜技術在蔬菜質量與安全方面的應用INGALLINA等[17]開發(fā)了一種NMR結合分光光度計的分析方法，將其用于分析芹菜提取物，并首次報道了芹菜提取物中存在某些酚，證實了低含量的生物胺和霉菌毒素與芹菜的質量和新鮮度有關。WANG等[18]利用1H NMR代謝組學的方法鑒定中國溫縣鐵棍山藥和其他山藥之間的區(qū)分代謝物。代謝組學結果表明，中國溫縣鐵棍山藥的葡萄糖、果糖和蔗糖濃度較低，亮氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、檸檬酸鹽和膽堿濃度較高，可以根據(jù)葡萄糖和果糖的含量來驗證中國溫縣鐵棍山藥的真實性。

在蔬菜產(chǎn)地溯源方面，KLARE等[19]利用非靶向1H NMR代謝組學成功區(qū)分了來自德國、波蘭、荷蘭、西班牙、希臘和秘魯?shù)?37份白蘆筍樣品的地理來源。LEE等[20]使用1H NMR結合典型判別分析區(qū)分了韓國、中國和越南紅辣椒粉的地理來源。研究表明，1H NMR光譜可以通過對與代謝物相關的信號進行適當?shù)囊?guī)范判別分析來區(qū)分紅辣椒粉的來源。LAU等[21]采用同樣的方法研究來自澳大利亞等3個地理來源的芹菜提取物之間的差異，發(fā)現(xiàn)糖、氨基酸和有機酸對不同來源的區(qū)分有顯著貢獻，甘露醇被確定為重要的區(qū)分代謝物。

低場核磁也經(jīng)常用于蔬菜方面的研究，BORBA等[22]使用時域核磁共振（TD－NMR）技術，根據(jù)番茄成熟階段顯示不同的衰減時間的特性，開發(fā)準確且無損的分類模型。結果表明，與計算方法相關的衰減可用于番茄加工業(yè)并對番茄樣本進行分類，這些分類模型顯示了TD－NMR技術在處理高通量篩選應用中的潛力。LV等[23]研究了低場核磁共振（LF－NMR）技術用于測量6種微波真空干燥的蔬菜的在線水分狀況。結果表明，蘑菇、胡蘿卜、馬鈴薯、荷花、毛豆和玉米的信號幅度和水分含量沒有單一的經(jīng)驗模型擬合，然而，在不同的微波真空干燥階段，信號幅度和水分含量之間存在顯著的線性關系。

（三）核磁共振波譜技術在肉制品質量與安全方面的應用NMR技術在肉制品方面的研究主要應用于輻照時間、代謝物和肉制品品質檢測。MARIA等[24]利用1H NMR技術對牛肉中的共軛亞油酸（CLA）進行檢測，該方法定量準確，除了可應用于牛肉檢測外，還可應用于其他食品。ZANARDI等[25]研究利用1H NMR技術鑒別輻照牛肉和非輻照牛肉，主要標記物為甘油、乳酸及酪胺等化合物。RAYNA等[26]用1H NMR技術研究了不同劑量的γ射線輻照對雞肉脂肪酸組成的影響，結果顯示，多不飽和脂肪?；鶞p少的趨勢與γ射線照射后肉類脂肪氧化穩(wěn)定性的降低有關，據(jù)此可以用來鑒別輻照雞肉和非輻照雞肉。

YUAN等[27]評估了不同的干燥老化方式對牛腰肉質量屬性和代謝物譜的影響，經(jīng)感官評價發(fā)現(xiàn)，干燥陳年的腰部牛肉具有更好的風味并整體更受歡迎（p<0.05），但在嫩度和多汁性方面沒有差異，滴漏/蒸煮損失和顏色也沒有差異。代謝物分析表明，干燥陳年牛肉中的7種代謝物比濕陳年牛肉更豐富，有助于增強干陳年牛肉的風味。GARCíA等[28]通過1H NMR分析，對經(jīng)電子束輻照處理的豬里脊肉樣品的7種分泌物進行了輻照劑量和貯存時間實驗，確定豬肉滲出物的主要成分為核苷（IMP）和糖（α－Glc、β－Glc和α－Man）。GRAHAM等[29]利用NMR技術檢測牛肉中極性代謝物組成及其含量隨儲藏時間的變化，結果顯示，隨著儲藏時間的增加，蛋白質水解程度也會加深，表現(xiàn)為氨基酸含量上升等，這種變化可以作為牛肉儲存時間的鑒定標準。KIM等[30]利用2D－NMR檢測4周內(nèi)不同老化狀態(tài)牛肉的特征代謝物，發(fā)現(xiàn)在牛肉老化與蛋白水解的過程中，主要影響物質為3－吲哚氧基硫酸鹽和γ－氨基丁酸，此方法可用于鑒別牛肉老化的程度。FONTES等[31]使用1H NMR光譜分析了3種肉塊（夾頭肉、牛腰肉和里脊肉）的30個樣品，以確定儲存期和溫度的影響。結果顯示，代謝物信號包括乙酸鹽、肌酐、肌肽、富馬酸鹽、乳酸鹽、亮氨酸、蛋氨酸和纈氨酸；得分圖結果表明，溫度對降解程度有巨大影響，原因是溫度影響微生物種群的生長。

臺式核磁也用于肉制品的研究，如利用LFNMR來確定生物系統(tǒng)中總脂肪和水分的含量。用于測定碎肉中脂肪的NMR方法被證明是一種穩(wěn)健的方法，不需要對實驗數(shù)據(jù)進行復雜的后期處理[32]。JAKES等[33]基于對60 MHz1H NMR光譜獲得的甘油三酯特征的比較來區(qū)分牛肉和馬肉，結合主成分分析給出的一個二維 “真實”牛肉區(qū)域 （p＝0.001），可以與光譜進行進一步比較，結果證明，60 MHz1H NMR可以作為一種可行的高通量篩選生肉的方法。

（四）核磁共振波譜技術在乳制品質量與安全方面的應用由于NMR技術能提供化合物中所有的氫原子信息,近年來關于NMR技術在乳制品方面的研究也逐漸增多，特別是乳制品中脂肪酸的定量分析方面。例如，MARIA等[34]利用1H NMR對意大利不同農(nóng)場生產(chǎn)的奶牛奶和水牛奶中脂質成分進行表征，得出奶牛奶中不飽和脂肪酸和膽固醇含量均高于水牛奶，而水牛奶中丁酸和飽和脂肪酸含量高于奶牛奶。TOCIU等[35]基于1H NMR方法檢測長鏈飽和脂肪酸與短鏈脂肪酸的比例，并利用標準氣相色譜－氫火焰離子化檢測器方法證實核磁共振方法提供的結果的準確性，經(jīng)證實，該方法可以快速確定乳制品中植物脂肪的可疑摻假。HU等[36]在沒有對全脂牛奶中的各種有機化合物做任何預處理的情況下，通過1D1H NMR和2D1H－13C HSQC核磁共振譜同時定量三酰基甘油的丁酸、總單不飽和脂肪酸和總多不飽和脂肪酸，并且首次定量牛奶中N－乙酰氨基水合物和三甲胺。

在針對乳制品代謝物研究方面，YANG等[37]利用1H－NMR技術研究中國荷斯坦奶牛、澤西牛、牦牛、水牛、山羊、駱駝和馬的乳汁代謝物，得到荷斯坦牛奶的特征標志物為膽堿和琥珀酸，可用特征標志物將荷斯坦牛奶與其他乳用動物的乳汁區(qū)分開來，有助于更好地區(qū)別荷斯坦奶牛和其他乳用動物在乳汁合成方面的差異，以鑒別不同乳用動物的乳汁代謝物和檢測乳制品的摻假。CUI等[38]利用1H－NMR和2D－HMBC NMR技術檢測超高溫牛奶和復原牛奶，選擇左旋肉堿、琥珀酸鹽、醋酸鹽3種化合物作為生物標志物來區(qū)分超高溫牛奶和復原牛奶。SCHIEVAND等[39]利用1H－NMR結合2D1H－1H TOCSY和2D1H－13C HMQC NMR快速檢測奶酪中的組胺以實現(xiàn)對奶酪質量安全的監(jiān)測。SEGATO等[40]利用1H－NMR技術鑒別基于高山牧場的阿齊亞戈PDO奶酪，結果顯示，膽堿、2，3－丁二醇、賴氨酸、酪氨酸和一些糖類化合物的信號被認為是其主要的水溶性代謝產(chǎn)物，有助于識別最短成熟期的干酪樣品。

在乳制品摻假方面，POLIANA等[41]探討了應用1H時域核磁共振（1H TD－NMR）作為評估牛奶質量的快速方法，將乳清、尿素、過氧化氫和合成奶以5%、15%、25%、35%和50%（v/v）的濃度添加到牛奶樣品中，通過建立回歸模型，得到牛奶樣品中的摻假水平有很強的相關性，開發(fā)了SIMCA和kNN分類模型，以根據(jù)摻假水平對摻假牛奶樣品和摻假牛奶樣品中的對照品進行分類，使用兩種模型獲得的結果顯示出相似且非常令人滿意的可預測性，說明1H TD－NMR可用作檢測和量化牛奶摻假。BERGANA等[42]開發(fā)出一種通過溶液狀態(tài)1H NMR結合一致性指數(shù)分析對正宗和摻假脫脂奶粉（SMP） 進行分類的非靶向方法。對于含有富氮小分子（三聚氰胺和雙氰胺）的樣品，在最低濃度（0.005%～0.05%）（w/w）下檢測到摻假；對于尿素及蔗糖和麥芽糖糊精，檢測閾值較高（0.5%）（w/w））。研究結果表明，1H NMR結合一致性指數(shù)分析可以支持SMP認證和檢測摻假。

（五）核磁共振波譜技術在油脂類質量與安全方面的應用GUILLéN和URIARTE[43]利用1H NMR技術研究煎炸過程中隨溫度升高葵花籽油品質發(fā)生的變化，并在氧化過程中同時監(jiān)測化合物的官能團，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，乙醛的含量隨溫度變化明顯，一些有毒物質（過氧化物、過氧?；墓曹椂w系、醛類）也隨煎炸溫度的升高而產(chǎn)生，同時食用油氧化過程中會形成二環(huán)氧化物被首次得到證實。之后，GUILLéN等[44]又利用1H NMR結合傅里葉變換紅外（FTIR）光譜研究了魚肝油的脂質組成，其中FTIR光譜提供了樣品中多不飽和酰基的摩爾百分比，以及不飽和與飽和結構之間的比率信息，1H NMR提供了某些?；耙恍┐我衔铮懝檀迹┑谋壤驖舛刃畔ⅲ?jīng)研究得出，該方法方便、簡單，可以檢測出飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的含量。

在油脂摻假方面，YVONNE等[45]利用1H NMR技術檢測摩洛哥堅果油中單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量來鑒別摻假摩洛哥堅果油。SOPELANA等[46]利用1H NMR技術檢測不同品種的人造黃油中的脂質組成，結果發(fā)現(xiàn)多不飽和脂肪酸含量為22%～50%，單不飽和脂肪酸含量為23%～50%，飽和脂肪酸含量為21%～55%，證明該技術可快速簡便地分析人造黃油的脂類成分。SAFWAN[47]利用1H NMR光譜和主成分分析（PCA）方法對8個品牌的40個黃油樣品和7個品牌的35個人造黃油樣品進行了研究，成功地對黃油和人造黃油進行了評估。GUYADER等[48]通過在常規(guī)實驗室中建立13C NMR檢測序列，能夠分析23種常見食用油的來源，以及區(qū)分黃油、人造黃油和動物脂肪。該研究體現(xiàn)了通過化學計量學工具13C NMR檢測各種商品品質真實性的潛力，這種方法也可以作為驗證油脂真實性和完整性的全球方法。

（六）核磁共振波譜技術在其他食品方面的應用GOUGEON等[49]利用定量1H NMR技術對葡萄酒進行地理、年份和品種評估。該研究證明了NMR技術在葡萄酒鑒定中的潛力，方法具有快速（包括樣品制備、分析和數(shù)據(jù)處理約20 min）和低體積（0.5 mL）的優(yōu)點。CARVALHO等[50]將近紅外光譜（NIRS）和NMR的無損方法應用于根據(jù)缺陷對帶殼的澳洲堅果仁進行分類。RICHARDSON等[51]將NMR光譜結合化學計量學的方法應用到新鮮椰子水的摻假問題研究中。CONSONNI等[52]將NMR技術用于區(qū)分有機咖啡和傳統(tǒng)咖啡，之后又應用于區(qū)分意大利有機和傳統(tǒng)蜂蜜的研究中[53]。我國HE等[54]通過1H NMR結合多元分析，成功建立判別模型以鑒別真假蜂蜜，準確率為97.6%。此外，該研究篩選出脯氨酸、木二糖、尿苷、β－葡萄糖、松三糖、松二糖、賴氨酸等8種成分作為鑒別真假蜂蜜的主要成分，這些成分有助于建立蜂蜜認證的快速篩選方法，進而進一步管控我國蜂蜜市場。

三、結論

綜上所述，核磁共振波譜技術作為光譜分析方法中最重要的一種，在學術研究中取得了卓越的成就。這種技術利用化學位移的差異，以及信號強度與共振核數(shù)成正比的優(yōu)勢，可分別用于定性和定量分析。在過去，常規(guī)核磁共振波譜分析方法的發(fā)展受到儀器成本高、靈敏度差和定量重現(xiàn)性差等因素的限制，但隨著NMR技術的完善和提高，核磁共振波譜技術成為了非常適合分析復雜混合物的方法。核磁共振波譜技術具有測試程序快速、易于執(zhí)行、無損，通常不需要復雜的樣品制備或使用復雜的試劑，無輻射、安全高效、穿透能力強等諸多優(yōu)點，促使其在食品科學研究領域將會有更為廣闊的應用前景。