徐小艷 陳昌海梁永曄王相子 陳培華開 妍 邱 冬

（1江蘇省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210036；2寶應(yīng)縣畜牧獸醫(yī)站，江蘇揚(yáng)州 225800）

口蹄疫是目前對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害較嚴(yán)重的一種傳染病。一直以來，我國對(duì)口蹄疫防控都實(shí)施強(qiáng)制免疫策略，選用口蹄疫滅活疫苗對(duì)豬只進(jìn)行免疫預(yù)防。已發(fā)表的研究結(jié)果[1]表明，若口蹄疫疫苗中含有殘留的微量非結(jié)構(gòu)蛋白，能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，特別是重復(fù)注射疫苗后尤為明顯。因此，使用口蹄疫傳統(tǒng)滅活疫苗對(duì)口蹄疫的診斷、檢疫存在很大的干擾作用，是阻礙我國口蹄疫凈化和建立口蹄疫無疫區(qū)的重要原因之一。本研究選用的口蹄疫O型、A型二價(jià)3B蛋白表位缺失滅活疫苗，因缺失了口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白主要優(yōu)勢表位3B基因，疫苗中不存在非結(jié)構(gòu)蛋白優(yōu)勢表位3B，免疫動(dòng)物后，不產(chǎn)生口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，通過非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測，可有效區(qū)分自然感染和注射疫苗動(dòng)物，可為口蹄疫的疫病凈化提供有效的技術(shù)手段。通過對(duì)口蹄疫O型、A型二價(jià)3B蛋白表位缺失滅活疫苗（O/rV-1株+A/rV-2株）免疫安全性和抗體消長規(guī)律的研究，評(píng)估其安全性和誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平，可為臨床應(yīng)用口蹄疫疫苗提供新選擇，為口蹄疫疫病綜合防控和凈化提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)豬

選取江蘇省揚(yáng)州市某生豬養(yǎng)殖場45日齡仔豬50頭。豬群健康，生長良好，試驗(yàn)前，所有仔豬均未免疫任何口蹄疫疫苗。

1.1.2 疫苗

口蹄疫O型、A型二價(jià)3B蛋白表位缺失滅活疫苗（O/rV-1株+A/rV-2株），中牧實(shí)業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)1909001。

1.1.3 檢測試劑

豬口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白合成肽ELISA抗體檢測試劑盒，購自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，批號(hào)ZM2019001；口蹄疫病毒A型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，批號(hào)20191202103-1；口蹄疫病毒O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，批號(hào)202004011 01-2。

1.2 方法

1.2.1 免疫與樣品采集

⑴試驗(yàn)分組。50頭仔豬隨機(jī)分為2組，分別為：一免組，25頭，只進(jìn)行一次免疫；二免組：25頭，一免后31 d進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫（二免）。

⑵免疫劑量與途徑。免疫劑量為2 mL/頭，頸部肌肉注射。

⑶疫苗注射與樣品采集。一免前采血與一免：一免前進(jìn)行第1次采血，隨機(jī)采集15頭豬血樣（覆蓋一免組和二免組）并分離血清，凍存。參考豬場口蹄疫疫苗的原有免疫程序，一免時(shí)間選定在45日齡，對(duì)一免組和二免組共50頭仔豬實(shí)施免疫。

一免后采樣：一免后29 d，隨機(jī)采集15頭豬血樣（覆蓋一免組和二免組）并分離血清，凍存；一免后61 d、95 d、123 d，分別對(duì)一免組試驗(yàn)豬進(jìn)行采樣，每次隨機(jī)采集15頭豬血樣并分離血清，凍存。

二免：二免組試驗(yàn)豬在一免后31 d加強(qiáng)免疫1次。

二免后采樣：二免后30 d、64 d、92 d，分別對(duì)二免組試驗(yàn)豬進(jìn)行采樣，每次隨機(jī)采集15頭豬血樣并分離血清，凍存。

1.2.2 免疫安全性觀察

所有試驗(yàn)豬每次免疫后就地觀察2 h，如無異常癥狀，則由畜主管理并繼續(xù)觀察，免疫后48 h內(nèi)回訪1次。試驗(yàn)期間，不定期到場觀察。

1.2.3 抗體檢測

⑴非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，采用豬口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白合成肽ELISA抗體檢測試劑盒檢測口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

⑵結(jié)構(gòu)蛋白抗體，采用口蹄疫病毒A型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒檢測A型口蹄疫抗體，采用口蹄疫病毒O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒檢測O型口蹄疫抗體。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，每塊酶標(biāo)板檢測10份樣品，采用Log10（效價(jià)）表示定量檢測結(jié)果。

1.2.4 結(jié)果判定

口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體：血清OD450nm值＜臨界值，判為陰性；血清OD450nm值≥臨界值，判為陽性。

A型口蹄疫抗體、O型口蹄疫抗體：血清Log10（效價(jià)）＜1.8，判為陰性；血清Log10（效價(jià)）≥1.8，判為陽性。

2 結(jié)果

2.1 免疫安全性試驗(yàn)結(jié)果

觀察豬只精神狀態(tài)、采食量、糞便、尿液以及豬群的發(fā)病和死亡情況，試驗(yàn)期間未發(fā)現(xiàn)豬只精神狀態(tài)、采食量、糞便、尿液等出現(xiàn)異常情況，試驗(yàn)豬群未發(fā)病、死亡。

2.2 抗體檢測結(jié)果

試驗(yàn)期間，不同時(shí)間點(diǎn)各組實(shí)際采集樣品數(shù)為14～16份/次，共采集并檢測豬血清130份，檢測結(jié)果見表1。

表1 試驗(yàn)豬群抗體檢測結(jié)果

3 討論

3.1 免疫安全性

試驗(yàn)豬群未發(fā)現(xiàn)異常情況，表明口蹄疫O型、A型二價(jià)3B蛋白表位缺失滅活疫苗（O/rV-1株+A/rV-2株）對(duì)仔豬群進(jìn)行免疫是安全的。

3.2 非結(jié)構(gòu)蛋白抗體

免疫前后，豬群口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測結(jié)果均為陰性，說明疫苗免疫后未產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，豬群也未感染口蹄疫病毒而產(chǎn)生感染抗體。因此，該疫苗的應(yīng)用可以有效解決口蹄疫疫病監(jiān)測和診斷中無法有效區(qū)分感染抗體和免疫抗體的難題，為該病的凈化工作提供技術(shù)手段，可以大大縮短凈化周期，提高凈化實(shí)效。

3.3 A型和O型口蹄疫抗體消長規(guī)律

從A型和O型口蹄疫抗體陽性率來看，免疫前，分別為7.14%和0；一免后29 d、61 d、95 d、123 d，二免后30 d、64 d、92 d，均為100%。從A型和O型口蹄疫抗體Log10（效價(jià)）均值來看，免疫前，該指標(biāo)數(shù)值分別為0.86和0.75，低于判定陽性臨界值1.8；一免后29 d、61 d、95 d、123 d，二免后30 d、64 d、92 d，該數(shù)值均遠(yuǎn)大于1.8。從A型和O型口蹄疫抗體Log10（效價(jià)）標(biāo)準(zhǔn)差來看，本研究中涉及的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，該指標(biāo)數(shù)值均較小，說明個(gè)體之間抗體水平差異小，疫苗免疫整齊度高。

4 結(jié)論

用口蹄疫O型、A型二價(jià)3B蛋白表位缺失滅活疫苗對(duì)仔豬進(jìn)行一次免疫，免疫后29 d，A型和O型口蹄疫抗體陽性率迅速上升至100%，且維持在高水平（100%）的時(shí)間可達(dá)4個(gè)月；進(jìn)行二次免疫，二免后30天，A型和O型口蹄疫抗體陽性率為100%，且維持在高水平（100%）的時(shí)間約3個(gè)月，可為該病的綜合防控提供有效的疫苗產(chǎn)品。

該疫苗不僅可以免疫預(yù)防豬O型口蹄疫，還可以免疫預(yù)防豬A型口蹄疫，因而解決了生豬生產(chǎn)中存在的豬免疫牛羊口蹄疫滅活疫苗[2-5]的問題，為口蹄疫疫苗的科學(xué)合理使用提供了新選擇。