楊 陽(yáng)，黃興法,2，王東方，劉玉蘭，胡 進(jìn)*

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；2.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074）

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）是引起新生動(dòng)物如仔豬、犢牛、羔羊等腹瀉的主要病原菌之一[1]，其致病性主要與其具有宿主特異性的菌毛粘附素（Fimbrias）和黏附后分泌的腸毒素（Enterotoxinsl）相關(guān)[2]，含有K88 菌毛的大腸桿菌是引起仔豬腹瀉的主要病原，有研究發(fā)現(xiàn)ETEC K88 感染仔豬后能夠激活仔豬腸道上皮細(xì)胞TLR2/4-MyD88 信號(hào)通路，導(dǎo)致仔豬腸系淋巴結(jié)出血與腸道炎癥[3]。在小鼠模型上研究結(jié)果表明，ETEC K88 感染小鼠后能夠激活小鼠TLR2/4 信號(hào)通路，促進(jìn)小鼠腸道炎癥基因表達(dá)，引起小鼠腸道損傷與腹瀉[4]。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)ETEC K88 不僅可通過(guò)促進(jìn)淋巴細(xì)胞[5]、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在小鼠腸道與各組織器官上的聚集，還可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞變性，引起組織出血或水腫[6]，引起小鼠腸道組織損傷以及全身特異性免疫反應(yīng)[7-10]。ETEC K88 還可激活小鼠腸道NF-κB 信號(hào)通路或Caspase3 相關(guān)的凋亡信號(hào)通路誘導(dǎo)腸道炎癥和細(xì)胞凋亡進(jìn)而導(dǎo)致腸道損傷[11]。然而目前并沒(méi)有ETEC K88 與焦亡信號(hào)通路相關(guān)性的報(bào)道。焦亡是一種由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶11（Caspase-11）介導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式[12]，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激后，核苷酸會(huì)結(jié)合NLRs 與未活化的ASC 形成炎性復(fù)合體，進(jìn)一步激活Caspase-1 促使其剪切焦亡效應(yīng)分子（GSDMD）導(dǎo)致炎性因子IL-1β和IL-18 的釋放，引起細(xì)胞焦亡[13]?；罨腃aspase-11 同樣能剪切GSDMD 形成GSDMD-N 端結(jié)構(gòu)域寡聚化誘導(dǎo)焦亡。本試驗(yàn)采用腹腔注射ETEC K88 菌液感染小鼠，研究ETEC K88 對(duì)小鼠造成的空腸損傷以及感染后第36 h 小鼠空腸內(nèi)炎癥、焦亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，探討ETEC K88 導(dǎo)致小鼠腸道損傷的機(jī)制，為防控和治療ETEC K88 引起的腸道損傷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 ETEC K88（血清型為O149:K91:K88ac）購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；BALB/c 小鼠購(gòu)于北京維通利華公司；電子天平（沈陽(yáng)龍騰ESK-1 系列）購(gòu)于龍騰公司；Total RNA 提取試劑、cDNA 合成試劑盒、Real-time PCR 試劑盒均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；7500 Real-time PCR 儀購(gòu)于Applied Biosystems 公司；梯度升降溫功能PCR 儀購(gòu)于TaKaRa 公司。

1.2 菌株培養(yǎng) 取10 μL ETEC K88 菌株甘油保存液接種在TSA 固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇，37℃條件下靜置培養(yǎng)12 h，挑取復(fù)蘇單菌落接種在TSB 液體培養(yǎng)基上復(fù)壯，37℃條件下靜置培養(yǎng)10 h 后采用濃度梯度稀釋法將菌液10倍稀釋進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3 飼養(yǎng)管理 將小鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)無(wú)特異性病原體（SPF）的鼠房中，溫度控制在（22±3）℃，晝夜周期為12 h，允許小鼠自由采食。飼喂3 d 后進(jìn)行正式試驗(yàn)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取25 只體重（17±1）g 的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射1×107CFU/mL ETEC K88 溶液0.2 mL。注射完成后持續(xù)觀察小鼠48 h，每隔12 h對(duì)小鼠的體重與活動(dòng)指數(shù)進(jìn)行一次統(tǒng)計(jì)。在該試驗(yàn)得出的最適感染時(shí)間基礎(chǔ)上，重新選取10 只體重（17±1）g的雌性BALB/c 小鼠，感染后36 h 屠宰小鼠，采集小鼠空腸進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析和RNA 檢測(cè)。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 小鼠體重與疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分 ETEC K88 感染小鼠后進(jìn)行持續(xù)觀察，每隔12 h 對(duì)小鼠的體重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。參照齊宇等[5]所述方法對(duì)小鼠體重下降率、糞便黏稠度、便血情況進(jìn)行評(píng)分，取3 項(xiàng)觀察評(píng)分的平均值作為小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表1）。

表1 小鼠DAI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.2 小鼠空腸組織病理學(xué)觀察 感染后0 h 和36 h 屠宰小鼠，收集小鼠空腸中段，放入4%多聚甲醛進(jìn)行固定，用蘇木素-伊紅（HE）染色后對(duì)小鼠腸道進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，采用正置光學(xué)顯微鏡在目鏡和物鏡分別為10 倍和40 倍下拍照保存圖片，采用HPIAS 高清晰度彩色病例圖文報(bào)告分析系統(tǒng)進(jìn)行腸道損傷分析。

1.5.3 mRNA 表達(dá)量測(cè)定 檢測(cè)指標(biāo)為炎癥、焦亡相關(guān)基因，測(cè)定步驟參照陳逢[14]。以NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的小鼠基因組序列為模板，采用引物設(shè)計(jì)軟件Premier 6.0 設(shè)計(jì)引物，委托武漢擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行合成，引物序列詳見表2。Real-time PCR 操作方法參考陳少魁[15]。Real-time PCR 數(shù)據(jù)分析以肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參基因，參考livak 的2-ΔΔCt計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算[16]。

表2 基因的引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 進(jìn)行獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)和單因素ANOVA 檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示，以P<0.05 表示顯著性差異。圖表采用Graphpad Prism 8.0.2 繪圖軟件進(jìn)行制作。

2 結(jié)果

2.1 ETEC K88 感染后小鼠臨床癥狀 感染ETEC K88后各時(shí)間點(diǎn)小鼠均表現(xiàn)出精神不振、行動(dòng)遲緩、進(jìn)食飲水頻率降低等癥狀，其中以36 h 最為明顯。小鼠體重隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而下降，在36 h 降至最低值，隨后出現(xiàn)逐漸恢復(fù)（圖1）。隨著小鼠體重下降，小鼠糞便出現(xiàn)變形、水分增多等臨床變化，但在0～48 h 的連續(xù)觀察中并未發(fā)現(xiàn)糞便隱血狀況。DAI 指數(shù)在36 h 達(dá)到最高點(diǎn)2.0，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖2）。

圖1 小鼠體重變化

圖2 小鼠DAI 指數(shù)

2.2 ETEC K88 感染后小鼠空腸病理學(xué)觀察 ETEC K88感染引起小鼠空腸損傷，與對(duì)照組（0 h）相比，ETEC K88 感染后36 h 引起了小鼠空腸充血、毛細(xì)血管出血與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。感染組空腸內(nèi)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與漿細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組（圖3）。

圖3 小鼠空腸切片（HE，40×10）

2.3 ETEC K88 刺激對(duì)小鼠腸道炎癥基因mRNA 表達(dá)量的影響 由表3 可知，與對(duì)照組相比，ETEC K88 刺激36 h 后引起了小鼠空腸炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA 表達(dá)量升高（P<0.05）。

表3 ETEC K88 對(duì)小鼠空腸IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA 表達(dá)量的影響

2.4 ETEC K88 刺激對(duì)小鼠腸道焦亡關(guān)鍵基因的影響由表4 可知，與對(duì)照組相比，刺激組（36 h）小鼠空腸GSDMD的mRNA 表達(dá)量上升（P<0.01），IL-18的表達(dá)量有上升的趨勢(shì)（P<0.10），而Caspase-1、ASC、NLRP3的mRNA 表達(dá)量差異不顯著。

表4 ETEC K88 對(duì)小鼠空腸焦亡信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA 表達(dá)量的影響

3 討 論

ETEC K88 是一種常見的致病性大腸桿菌，已有眾多文獻(xiàn)報(bào)道了其菌毛粘附素、耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素的分子結(jié)構(gòu)與合成機(jī)制[17-18]，但在其致病性的研究上目前尚未完全透徹。目前大部分研究從體外角度報(bào)道了ETEC K88感染對(duì)腸道上皮細(xì)胞造成的損傷及其機(jī)制[19]，但對(duì)ETEC K88 侵入機(jī)體引起的動(dòng)物體炎癥并激活相關(guān)信號(hào)通路的研究較少。張賽群等[1]研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射ETEC K88 能夠誘導(dǎo)小鼠發(fā)生顯著的病理反應(yīng)與組織損傷，不僅在腹腔臟器以及腸上部發(fā)現(xiàn)ETEC K88 黏附，在胸腔臟器以及腦、肌肉、血液中都能檢測(cè)到ETEC K88 聚集，這表明ETEC K88 的致病性不僅與其產(chǎn)腸毒素相關(guān)，ETEC K88 的黏附性與侵襲性也應(yīng)作為致病因素之一進(jìn)行討論。本試驗(yàn)中腹腔注射ETEC K88 引起小鼠空腸內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、毛細(xì)血管出血與空腸充血，誘發(fā)腸道炎癥，這些現(xiàn)象證實(shí)了ETEC K88 在腸外也能發(fā)揮其致病性。

Jiang 等[20]研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射ETEC K88 能誘導(dǎo)6～8 周齡雄性ICR 小鼠的腸道炎癥，ETEC K88 刺激提高了小鼠回腸中部IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、干擾素（IFN-γ）等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并且抑制了抗炎細(xì)胞因子IL-10的mRNA 表達(dá)。本試驗(yàn)中，ETEC K88感染引起小鼠空腸中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子表達(dá)。兩個(gè)試驗(yàn)雖然檢測(cè)的腸段不同但結(jié)果具有相似性，表明ETEC K88 感染對(duì)小腸段造成的損傷較嚴(yán)重。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ETEC K88 刺激上調(diào)了小鼠空腸中焦亡相關(guān)基因GSDMD和IL-18的表達(dá)量并導(dǎo)致腸道損傷，目前研究已發(fā)現(xiàn)微生物感染能激活動(dòng)物體腸道焦亡信號(hào)通路，被激活的焦亡信號(hào)通路又參與到促炎因子釋放與溶酶體損傷過(guò)程中，最終導(dǎo)致腸道屏障損傷[21]。這表明ETEC K88 刺激與焦亡存在必然的聯(lián)系。而且在細(xì)胞水平上，革蘭氏陰性菌組分LPS 能夠激活Caspase11相關(guān)的焦亡信號(hào)通路，引起腸細(xì)胞死亡[22]。綜上所述，ETEC K88 激活了小鼠空腸焦亡信號(hào)通路，促進(jìn)了炎性因子的釋放并破壞腸道屏障完整性從而引起了空腸損傷。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，ETEC K88 感染小鼠后，空腸炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)水平升高，同時(shí)焦亡信號(hào)通路中GSDMD的mRNA 表達(dá)量顯著上升，IL-18的mRNA 表達(dá)量有上升趨勢(shì)。病理切片結(jié)果顯示感染組空腸充血、毛細(xì)血管出血與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，空腸內(nèi)聚集有大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與漿細(xì)胞。表明ETEC K88 感染可上調(diào)焦亡信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)量引起小鼠的腸道損傷，誘發(fā)腸道炎癥。