李玉杰，王海波，潘慶杰，顏 碩，李美玉，董煥聲

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

目前，利用幼畜體外胚胎移植技術(shù)挖掘優(yōu)秀母畜的遺傳潛力[1]，在相對(duì)較短的時(shí)間里可以獲得更多遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良后代[2]，但由于性成熟前綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力較低[3]，從而影響體外胚胎生產(chǎn)的效率。相較體內(nèi)成熟而言，卵母細(xì)胞體外成熟（In Vitro Maturation，IVM）脫離了體內(nèi)微環(huán)境，導(dǎo)致卵丘擴(kuò)散不完全或核質(zhì)成熟不同步等現(xiàn)象，這嚴(yán)重影響著卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量[4]。促黃體素（LH）誘導(dǎo)卵巢壁層顆粒細(xì)胞表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）類因子[5]，它們可以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟、排卵等相關(guān)過程，EGF 類因子在顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中提供了一種自分泌和旁分泌機(jī)制來調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的微環(huán)境[6]。性成熟后綿羊卵巢可以在LH 的周期性刺激下，促進(jìn)卵巢壁層顆粒細(xì)胞表達(dá)EGF 類因子[7]。然而，綿羊在性成熟前階段卵巢壁層顆粒細(xì)胞由于缺乏促性腺激素的周期性刺激，原始卵泡處于靜息期[8]。在體內(nèi)時(shí)，性成熟前階段的綿羊卵母細(xì)胞在LH 峰到來前未啟動(dòng)EGF 信號(hào)[9]。因此，通過在性成熟前綿羊卵母細(xì)胞的體外成熟液中添加一定濃度的EGF 來模擬體內(nèi)成熟微環(huán)境。目前，在國(guó)內(nèi)尚未報(bào)道關(guān)于EGF 對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的影響。本實(shí)驗(yàn)旨在探究不同濃度EGF 對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展、第一極體排出、肌動(dòng)蛋白（Actin）定位及紡錘體組裝的影響，為改善性成熟前綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系和探究性成熟前綿羊卵母細(xì)胞體外成熟機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 促卵泡素（FSH）、LH 為RayBiotech公司產(chǎn)品；雌二醇（E2）、丙酮酸鈉、EGF、透明質(zhì)酸酶、Hoechest33342、聚乙烯醇（PVA）、礦物油等為Sigma 公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）為Gibco 公司產(chǎn)品；DME/F-12、Medium199/EBSS 為Hyclone 公司產(chǎn)品；Actin-Tracker Green（肌動(dòng)蛋白綠色熒光探針）為碧云天生物科技公司產(chǎn)品；小鼠來源的Anti-α-tubulin 為Proteintech 公司產(chǎn)品；山羊抗鼠 IgG DyLight?488 為Abcam 公司產(chǎn)品；青鏈霉素混合液、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、TritonX-100、Tween 20 等為自索萊寶公司產(chǎn)品。

1.2 試劑配制 采卵液：M199 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1%青鏈霉素混合液、0.1% PVA，0.22 μm 濾膜過濾除菌，4℃保存。

卵母細(xì)胞體外成熟液：M199 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1% 青鏈霉素混合液、10% FBS、10 μg/mL FSH、10 μg/mL LH、1 μg/mL E2、2 mmol/L 丙酮酸鈉、10 ng/mL EGF、100 ng/mL EGF，1 000 ng/mL EGF，0.22 μm 濾膜過濾除菌，4℃保存。

配制EGF 濃度：對(duì)照組為基礎(chǔ)成熟液；實(shí)驗(yàn)組在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加10、100、1 000 ng/mL EGF 配成不同EGF 濃度的IVM 液，4℃保存。

1.3 卵母細(xì)胞的采集 綿羊（2～4 月齡性成熟前綿羊，1 年左右的性成熟后綿羊）卵巢均在山東省日照市東港區(qū)的綿羊屠宰場(chǎng)采集，采用抽吸法與切割法獲取卵母細(xì)胞，即將抽取完卵泡液的卵巢使用手術(shù)刀片對(duì)卵巢表面的卵泡進(jìn)行充分地切割，使卵泡內(nèi)容物流到采卵液里。在體視顯微鏡下，挑選出卵丘顆粒細(xì)胞緊密包圍和細(xì)胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞。用洗卵液清洗3 次后，在38.5℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中體外成熟。

1.4 卵母細(xì)胞免疫熒光染色 將已在4%多聚甲醛中固定40 min 的卵母細(xì)胞用洗滌緩沖液洗滌3 次后，在1%Triton X-100（在PBS 中）中透化40 min。再洗滌3 次后，卵母細(xì)胞與1% BSA 孵育1 h，以阻斷IgG 的非特異性結(jié)合，上述操作均在室溫下進(jìn)行。對(duì)于α-微管蛋白（紡錘體）染色，卵母細(xì)胞與抗α-微管蛋白抗體在4℃孵育過夜，然后洗滌5 次，并與二抗在室溫孵育2.5 h。對(duì)于肌動(dòng)蛋白染色，在室溫下用Actin-Tracker Green 染色1 h。最終，細(xì)胞核在室溫下用PI 染色30 min。然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察樣品的熒光情況。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 年齡綿羊?qū)β殉仓新涯讣?xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程的影響將取回的綿羊卵巢分為性成熟前組和性成熟后組，挑選出卵丘顆粒細(xì)胞緊密包圍和細(xì)胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞。用透明質(zhì)酸酶去除卵丘顆粒細(xì)胞，對(duì)性成熟前組和性成熟后組的卵母細(xì)胞分別做Hochest33342 染色，統(tǒng)計(jì)2 組卵母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期，進(jìn)行6 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 不同濃度 EGF 對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞的卵丘擴(kuò)展率和卵母細(xì)胞第一極體排出率的影響 使用含有不同濃度 EGF（0、10、100、1 000 ng/mL）的 IVM 培養(yǎng)基體外培養(yǎng)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞24 h，依照Fagbohun 等[12]建立的主觀評(píng)分方法統(tǒng)計(jì)卵丘擴(kuò)展指數(shù)，根據(jù)第一極體排出情況，統(tǒng)計(jì)第一極體排出率。將收集的卵母細(xì)胞隨機(jī)分為4 組，分別進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.5.3 不同濃度 EGF 對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞成熟過程中肌動(dòng)蛋白（Actin）定位和紡錘體（Tubulin）組裝的影響 使用含不同濃度 EGF（0、10、100、1 000 ng/mL）的 IVM 培養(yǎng)基體外培養(yǎng)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞6 h，此時(shí)大部分卵母細(xì)胞仍處于生發(fā)泡（GV）期，透明質(zhì)酸酶去除顆粒細(xì)胞后，檢測(cè)肌動(dòng)蛋白定位。將體外培養(yǎng)16 h 的綿羊卵母細(xì)胞，此時(shí)的卵母細(xì)胞大部分處于MI 期，用Anti-α-tubulin（檢測(cè)紡錘體組裝情況）進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。為了定量熒光強(qiáng)度，通過執(zhí)行相同的免疫染色程序并在激光共聚焦顯微鏡上設(shè)置相同的參數(shù)，獲得卵母細(xì)胞的熒光圖像。將卵母細(xì)胞隨機(jī)分為4組，分別進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 利用 Image J 軟件檢測(cè)卵母細(xì)胞肌動(dòng)蛋白熒光強(qiáng)度，采用Origin 2018 和Graphpad Prism 8 完成統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制，使用SPASS 23.0 軟件LSD 法進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05 作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。數(shù)據(jù)表示為至少3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 年齡對(duì)綿羊卵巢中卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程的影響GV 期卵母細(xì)胞，邊緣區(qū)有1 個(gè)大而圓的細(xì)胞核，其中染色質(zhì)呈松散的網(wǎng)狀分布；生發(fā)泡破裂（GVBD）期卵母細(xì)胞，染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞核核膜破裂。如表1 和圖1所示，性成熟前綿羊卵母細(xì)胞多數(shù)處于GV 期，極少數(shù)處于GVBD 期。性成熟前綿羊卵母細(xì)胞處于GV 期的比例高于性成熟后綿羊卵母細(xì)胞（P<0.05），GVBD 期的比例低于性成熟后綿羊（P<0.05）。

圖1 Hoechst33342 標(biāo)記綿羊卵母細(xì)胞的代表性圖像

表1 性成熟前后綿羊卵巢中GV 期和GVBD 期的卵母細(xì)胞減數(shù)分析

2.2 不同濃度EGF 對(duì)性成熟前綿羊卵丘擴(kuò)展指數(shù)和第一極體排出率的影響 如圖2 所示，與0 ng/mL EGF 組相比，10 ng/mL EGF 組的卵丘擴(kuò)展指數(shù)有提高趨勢(shì)，但差異不顯著，而100 ng/mL EGF 組的卵丘擴(kuò)展指數(shù)顯著提高。與100 ng/mL EGF 組相比，1 000 ng/mL EGF組的卵丘擴(kuò)展指數(shù)有降低趨勢(shì)，但無顯著差異。如表2所示，100 ng/mL EGF 組第一極體排出率高于其他處理組（P<0.05），10 ng/mL EGF 和1 000 ng/mL EGF 組間第一極體排出率無顯著差異。結(jié)果表明，100 ng/mL EGF 對(duì)卵母細(xì)胞核成熟有促進(jìn)作用。性成熟前綿羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h 后的代表性圖像見圖3。

圖3 性成熟前綿羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h 后的代表性圖像

表2 不同濃度EGF 對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞第一極體排出的影響

圖2 不同濃度EGF 處理24 h 對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展的影響

2.3 不同濃度EGF 對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞質(zhì)膜肌動(dòng)蛋白定位的影響 如圖4 所示，沿著卵母細(xì)胞繪制截面將熒光信號(hào)進(jìn)行量化，卵母細(xì)胞肌動(dòng)蛋白定位正常時(shí)，肌動(dòng)蛋白在質(zhì)膜中分布均勻，信號(hào)較強(qiáng)；100 ng/mL EGF組性成熟前綿羊卵母細(xì)胞質(zhì)膜肌動(dòng)蛋白的正確定位率高于其他組（P<0.05）。結(jié)果表明，添加100 ng/mL EGF可促進(jìn)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞質(zhì)膜肌動(dòng)蛋白的正確定位。

圖4 不同濃度EGF 對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞GV 期肌動(dòng)蛋白定位的影響

2.4 不同濃度EGF 對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞紡錘體組裝的影響 如圖5 所示，在IVM 液中添加10 ng/mL EGF和100 ng/mL EGF 時(shí)，性成熟前綿羊卵母細(xì)胞紡錘體組裝正確率分別為63.95%和68.10%，均高于0 ng/mL EGF 組（P<0.05），1 000 ng/mL EGF 組與0 ng/mL EGF組間無顯著差異。結(jié)果表明，添加10 ng/mL 和100 ng/mL EGF 對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞紡錘體的正確組裝有促進(jìn)作用。

圖5 不同濃度EGF 對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞MI 期紡錘體組裝的影響

3 討 論

哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂經(jīng)歷細(xì)線期、合線期、粗線期后被阻滯在前期的雙線期，阻滯期從數(shù)月長(zhǎng)達(dá)幾年或幾十年，這種阻滯在綿羊中長(zhǎng)達(dá)數(shù)月之久，直到性成熟后，在促性腺激素作用下卵泡周期性募集，排卵前LH 峰到來以后卵母細(xì)胞才恢復(fù)第一次減數(shù)分[13]。而且也有研究表明卵母細(xì)胞在LH 波峰誘導(dǎo)下恢復(fù)減數(shù)分裂后，生長(zhǎng)充分的卵母細(xì)胞在排卵前會(huì)合成并儲(chǔ)存大量蛋白質(zhì)，為卵母細(xì)胞的后期發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)，而仍處于生長(zhǎng)階段的卵母細(xì)胞未進(jìn)行充分的物質(zhì)儲(chǔ)備[14]。研究發(fā)現(xiàn)，與性成熟后綿羊卵母細(xì)胞相比，性成熟前綿羊卵母細(xì)胞在IVM 0 h 時(shí)，其GV 率顯著高于性成熟后綿羊卵母細(xì)胞，GVBD 率顯著低于性成熟后綿羊卵母細(xì)胞，此結(jié)果表明性成熟前綿羊卵母細(xì)胞可能是因?yàn)榇蠖鄶?shù)仍處于生長(zhǎng)階段，還沒有為后期發(fā)育合成必需的儲(chǔ)備物質(zhì)，造成了體外發(fā)育能力低。Richani 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，EGF 可以響應(yīng)LH 信號(hào)并在促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育中有重要作用，如促進(jìn)卵丘擴(kuò)展、卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟及受精后的胚胎發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，在IVM 液中添加10 ng/mL 和100 ng/mLEGF 時(shí)性成熟前綿羊卵丘細(xì)胞擴(kuò)展指數(shù)有提高趨勢(shì)，而當(dāng)濃度增加至1 000 ng/mL 時(shí)卵丘擴(kuò)展指數(shù)有所下降。卵丘細(xì)胞擴(kuò)展指數(shù)是評(píng)估卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的重要指標(biāo)，卵丘細(xì)胞擴(kuò)展指數(shù)越高，卵丘細(xì)胞產(chǎn)生有利于卵母細(xì)胞發(fā)育的成熟因子就越高[17]，這將提高卵母細(xì)胞的體外發(fā)育能力。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在成熟液中添加10 ng/mL 和100 ng/mL EGF 后，第一極體排出率有提高趨勢(shì)，而當(dāng)濃度增加至1 000 ng/mL時(shí)第一極體排出率與100 ng/mL EGF 處理組相比顯著下降，這可能因?yàn)槁亚饠U(kuò)展指數(shù)高增強(qiáng)了卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞間的縫隙連接，從而激活了更多有利于卵母細(xì)胞成熟的信號(hào)通路[18]，促進(jìn)細(xì)胞核成熟，當(dāng)添加1 000 ng/mL EGF 時(shí)，第一極體排出率下降，可能因?yàn)槁亚饠U(kuò)展指數(shù)的降低抑制了卵丘細(xì)胞向卵母細(xì)胞傳遞成熟信號(hào)。

除了卵丘細(xì)胞狀態(tài)可判斷卵母細(xì)胞成熟及質(zhì)量外，DNA、RNA、蛋白質(zhì)和其他必需物質(zhì)的準(zhǔn)備對(duì)于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞在GV 階段恢復(fù)減數(shù)分裂也至關(guān)重要[19]。肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞骨架微絲的主要成分，它通過為細(xì)胞器的移動(dòng)和染色體分離提供驅(qū)動(dòng)力來介導(dǎo)真核卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂活性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，成熟液中未添加EGF 時(shí)，性成熟前綿羊卵母細(xì)胞GV 期卵母細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白有定位失敗的現(xiàn)象。Wang 等[21]報(bào)道，肌動(dòng)蛋白細(xì)絲是細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)重要組成部分，它的動(dòng)態(tài)變化在卵母細(xì)胞紡錘體定位、成熟和受精中起著至關(guān)重要的作用，所以當(dāng)GV 期卵母細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白定位失敗時(shí)會(huì)影響卵母細(xì)胞的后期發(fā)育能力。因此，本研究通過添加一定濃度的EGF 來驗(yàn)證EGF 是否可以幫助性成熟前綿羊卵母細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的正確定位，從而幫助卵母細(xì)胞提高體外發(fā)育能力。本研究結(jié)果顯示，在添加10 ng/mL 和100 ng/mL EGF 時(shí)，性成熟前綿羊卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)6 h 時(shí)肌動(dòng)蛋白定位正確率顯著提高，并且當(dāng)添加100 ng/mL 的EGF 時(shí)顯著修復(fù)了性成熟前綿羊卵母細(xì)胞GV 期肌動(dòng)蛋白聚合失敗的現(xiàn)象，而高濃度1000 ng/mL EGF 試驗(yàn)組的肌動(dòng)蛋白正確定位率與100 ng/mL EGF 試驗(yàn)組相比顯著降低，發(fā)現(xiàn)GV 期肌動(dòng)蛋白的正確定位與第一極體排出情況呈正相關(guān)。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的成熟與紡錘體的準(zhǔn)確組裝密切相關(guān)。Radek 等[22]研究表明，EGF 可以通過響應(yīng)LH 信號(hào)促進(jìn)微絲F-actin 的重排。而且Jo等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在減數(shù)分裂成熟過程中，紡錘體受到微絲的牽引，逐漸由細(xì)胞中心區(qū)域向一側(cè)的皮質(zhì)區(qū)域移動(dòng)，最后錨定在一側(cè)的皮質(zhì)區(qū)，發(fā)生不對(duì)稱分裂并排出體積較小的極體。因此，本研究又進(jìn)一步驗(yàn)證了一定濃度的EGF 對(duì)MI 期紡錘體形態(tài)的影響。在添加10 ng/mL和100 ng/mL EGF 時(shí)，紡錘體的組裝正確率顯著高于0 ng/mL 和1 000 ng/mL EGF 組，這可能是因?yàn)? ng/mL和1 000 ng/mL EGF 組的微絲形成受阻，從而阻止穩(wěn)定的梭形紡錘體建立和正確的同源染色體排列，造成不能擠出第一極體。但EGF 對(duì)性成熟前綿羊卵母細(xì)胞相關(guān)成熟基因表達(dá)的影響以及早期胚胎發(fā)育的作用有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，性成熟前綿羊卵母細(xì)胞IVM 培養(yǎng)液中添加100 ng/mL EGF 能夠提高卵母細(xì)胞核成熟率，同時(shí)可以通過幫助肌動(dòng)蛋白和紡錘體的正確組織來提高性成熟前綿羊卵母細(xì)胞在體外的發(fā)育能力。