龍 熙，柴 捷，潘紅梅，王金勇，肖杰秋，張廷煥*

（1.重慶市畜牧科學院，重慶 402460；2.綏江縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南昭通 657000）

FK506 結合蛋白（FK506 Binding Proteins,FKBPs）是免疫抑制劑FK506（Tacrolimus）在生物體內的天然配體，與另兩類免疫抑制劑Cyclosporin A 體內的配體親環(huán)素（Eyclophilin CyP）和Rapamycin 共同稱為親免素（Immunophilin）。FKBPs 蛋白是一類具有多種生物學功能的親免素家族蛋白，在機體內的一個重要作用就是作為肽基脯氨酰基順反異構酶（Peptidyl-Prolyl Cis-Trans Isomerase，PPIase）同胞內胞外的多種靶受體相互作用參與蛋白的折疊和轉運[1]。同時，F(xiàn)KBPs 家族中包括FKBP5[2]、FKBP73[3]、FKBP38[4]、FKBP35[5]以及古細菌FKBP 在內的多個成員均具有分子伴侶的功能[6]。FKBPs 家族成員具有多個結構域，不同家族成員的結構域不盡相同。典型的FKBPs 家族成員具有1～2 個FK506 結合域（FK506 Binding Domain,FKBD），三重三四氨基酸重復（Tetratricopeptide Repeat，TPR），以及1 個鈣調蛋白區(qū)（Calmodulin,CBD）[7]。FKBPs家族作為親免素的一個重要成員，其中一個重要作用就是免疫抑制劑在機體內的重要配體。免疫抑制劑通過與FKBPs 家族成員結合后，抑制了FKBPs 家族蛋白在機體內的生物學功能，進而起到免疫抑制的作用。多數(shù)FKBPs 家族成員在神經組織中有著豐富表達，且表達量在神經組織受損后有著一個指數(shù)級的上升[8]。由此可以推斷FKBPs 家族成員在神經受損的修復中起到了重要作用。

FKBP5 蛋白是FKBPs 家族成員之一，編碼FKBP5蛋白的基因最早由Baughman[9]等在小鼠T 細胞中克隆得到。FKBP5 蛋白擁有2 個FK506 結合域（FK506 Binding Domain,FKBD），N 末端的FKBD 同時擁有PPIase 活性和FK506 結合活性，C 末端的FKBD 擁有旋轉酶（Rotmase）的活性而無FK506 結合活性，其主要負責FKBPs 自身與Hsp90 和激素受體等的分子互作[10]。Baughman 等[9]人通過藥物結合實驗證明，F(xiàn)KBP5 蛋白具有PPIase 活性，其與子囊霉素（FK506 類似物）的結合物可以抑制鈣調磷酸酶的活性，進而證明了FKBP5 蛋白在免疫調節(jié)以及免疫抑制功效中發(fā)揮的重要作用。進一步深入研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP5 蛋白的PPIase活性介導的Ca2+信號通路主要通過參與蛋白的折疊與轉運而對小鼠T 細胞的活化起關鍵作用[11-12]。最新研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP5 蛋白可與干擾素誘導蛋白44（Interferon-Induced Protein 44，IFI44）協(xié)同作用負向調節(jié)病毒感染后的先天免疫應答[13]，也可通過激活維甲酸誘導基因I 蛋 白（Retinoic Acid-Inducible Gene I，RIG-I）介導的NF-κB 信號來抵抗病毒感染[14]。此外，F(xiàn)KBP5 蛋白還在調節(jié)類固醇激素[2,15]、抑郁癥[16]、癌癥和藥物抵抗[17]等方面扮演著重要角色。目前，F(xiàn)KBP5 蛋白在豬上的功能研究還鮮見報道，雖然Zhao 等[18]研究發(fā)現(xiàn)FKBP5 蛋白可能在初生階段豬的病原防御中發(fā)揮重要功能，但是其具體作用機制還尚待研究。因此，對FKBP5 蛋白進行深入研究有助于進一步了解FKBP5 蛋白在豬機體內的生物學功能及其相關信號通路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗用健康的、生長狀況良好的、檢疫合格的、出生1 d 的榮昌豬胸腺組織由重慶市畜牧科學院榮昌豬國家級保種場提供；pET-28a 載體由重慶市畜牧科學院豬遺傳改良國家地方聯(lián)合工程實驗室保存；RNeasy Mini protect kit 購自QIAGEN 公司；SMARTerTMPCR cDNA Synthesis Kit 購自Clontech 公司；PCR 純化試劑盒、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自OMEGA公司；Q5?Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix、BamHI和XhoI 限制性內切酶、T4 DNA 連接酶購自NEB 公司；His-Bind 蛋白純化試劑盒購自Novagen 公司；PMSF、蛋白濃度測定試劑盒、His-tag 抗體及HRP 標記的二抗（山羊抗小鼠）購自碧云天公司；ECL 試劑盒購自pierce 公司。

1.2 總RNA 的提取及cDNA 合成 利用RNeasy Mini Protect Kit 提取榮昌豬胸腺組織總RNA，用Nanodrop 2000 測定總RNA 濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。以提取的RNA 為模板，利用SMARTerTMPCR cDNA Synthesis Kit 將總RNA 反轉錄成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計與合成 依據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中提供的FKBP5基因參考序列，用Primer Premier 5.0 設計FKBP5基因CDS 區(qū)全長擴增引物，并引入多克隆位點BamHI 和XhoI。菌液PCR 引物序列同pET-28a 載體測序通用引物，詳細信息見表1，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.4FKBP5基因CDS 區(qū)全長片段擴增 以合成的榮昌豬胸腺cDNA 為模板，擴增帶多克隆位點的CDS 區(qū)全長，50 μL PCR 擴增體系如下：2×Q5?Hot Start High-Fidelity Master Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，H2O 22 μL。PCR 擴增程序為：98℃預變性30 s；98℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，共35 個循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR 產物經PCR 純化試劑盒純化后用BamHI 和XhoI 內切酶進行雙酶切，通過2%瓊脂糖凝膠電泳及膠回收試劑盒回收帶BamHI 和XhoI 多克隆位點的CDS 全長片段，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 FKBP5 蛋白原核表達載體構建及鑒定 利用BamHI 和XhoI 內切酶對pET-28a 載體進行雙酶切，隨后通過2% 瓊脂糖凝膠電泳及膠回收試劑盒回收帶BamHI 和XhoI 多克隆位點的pET-28a 載體。利用T4 DNA 連接酶將FKBP5CDS 區(qū)全長片段與pET-28a 載體進行連接，轉化DH5α感受態(tài)細胞后，接種至Kana抗性的LB 固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)后挑取單克隆，利用菌液PCR 和雙酶切鑒定陽性克隆，將陽性克隆送至蘇州金唯智生物科技股份有限公司進行測序鑒定。

1.6 FKBP5 蛋白原核表達條件優(yōu)化 將測序驗證無誤的原核表達載體轉化進蛋白表達菌株BL21 中，接種至Kana 抗性的LB 固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)后挑取單克隆，于試管中37℃過夜培養(yǎng)，隨后以1:100 比例接種至LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，分別用終濃度為0、0.4、0.8、1、1.2、1.5 mmol/L 的IPTG 進行誘導，誘導結束后收集菌體，PBS 清洗菌體3 次，超聲破碎后收集上清，利用SDS-PAGE 鑒定上清中的蛋白表達情況，確定最適誘導終濃度。分別收集最適IPTG終濃度下誘導2、4、6、8、10 h 后的菌體，超聲破碎后收集上清，利用SDS-PAGE 鑒定上清中蛋白表達情況，優(yōu)化FKBP5 蛋白表達所需的時間。依據(jù)優(yōu)化的最適誘導濃度和時間，大量表達FKBP5 重組蛋白。

1.7 FKBP5 蛋白的分離純化 將誘導表達后的菌體10 000 g 離心10 min，PBS 洗滌3 次后，用BugBuster Master Mix 蛋白裂解液裂解菌體，同時加入PMSF 以防蛋白降解，搖床上室溫孵育20 min 后，于4℃條件下16 000 g 離心20 min，收集上清，使用Novagen 的純化樹脂對上清中的蛋白進行純化。

1.8 表達蛋白的Western-blot 鑒定 BCA 蛋白濃度試劑盒測純化蛋白的濃度，隨后利用12% SDS-PAGE 進行電泳，并將蛋白轉印至PVDF 膜上（100V，45 min），然后將PVDF 膜于5% 的脫脂奶粉中室溫封閉1 h，一抗（His-tag，1:1 000）4℃孵育過夜，HRP 標記的二抗（山羊抗小鼠，1:1 000）室溫孵育1 h，ECL 顯色后于Bio-Rad 成像系統(tǒng)中完成圖像采集。

2 結果

2.1 目的片段擴增結果 預期的FKBP5基因大小為1 374 bp，在1 000～2 000 bp 之間出現(xiàn)條帶（圖1），表明擴增得到了目的片段。

圖1 目的片段擴增結果

2.2 pET-28a-FKBP5 重組表達質粒的構建 預期菌液PCR 擴增產物長度為1 701 bp（測序通用引物T7 結合部位在pET-28a 載體上，目的片段長度加pET-28a 載體上部分序列長度共計約1 701 bp），在預期位置出現(xiàn)特異性條帶（圖2），表明為陽性克隆菌。陽性克隆提取質粒后，用BamHI 和XhoI 酶切鑒定，結果如圖3 所示，在1 000～2 000 bp 之間出現(xiàn)特異性條帶，同時對重組質粒單酶切，結果顯示相應的一條帶，表明重組表達質粒連接成功。將菌液PCR 及酶切鑒定的質粒送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序，結果顯示序列同源性大于99%，表明重組表達質粒構建成功。

圖2 菌液PCR 鑒定結果

圖 3 雙酶切鑒定表達載體

2.3 FKBP5 重組蛋白的誘導表達及條件優(yōu)化 將重組表達質粒轉化進表達菌BL21（DE3）后進行蛋白誘導表達，收集菌體并清洗，超聲破碎后進行SDS-PAGE 鑒定，結果表明，IPTG 誘導后的菌體在接近55 ku 處出現(xiàn)一條帶，未誘導的菌體在相應位置無條帶。并且，超聲破碎誘導的菌體后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP5 重組蛋白在上清和沉淀中均有分布，且上清中的蛋白表達量高于沉淀（圖4）。利用SDS-PAGE 對重組蛋白表達的IPTG 濃度及時間進行檢測，發(fā)現(xiàn)重組FKBP5 蛋白誘導表達的最適IPTG終濃度為1 mmol/L（圖5），最優(yōu)時間是2 h（圖6）。1：170 ku 預染蛋白Marker；2～7：0、0.4、0.8、1、1.2、1.5 mmol/L 終濃度IPTG誘導蛋白表達。

圖4 FKBP5 蛋白誘導表達結果

圖5 最適IPTG 誘導終濃度鑒定結果

圖6 最適誘導時間鑒定結果

2.4 FKBP5 重組蛋白的分離純化 最適條件下誘導FKBP5重組蛋白表達，收集菌體，經蛋白提取、蛋白分離純化后，測定重組蛋白濃度，取20 μg 純化蛋白進行SDS-PAGE，結果表明，在55 ku 左右位置成功純化出目的蛋白（圖7）。

圖7 FKBP5 蛋白的純化

2.5 FKBP5 重組蛋白的Western-blot 鑒定 利用Westernblot 鑒定分離純化的蛋白，結果表明His-tag 能在預期位置雜交出單一條帶（圖8）。

圖8 Western-blot 鑒定表達蛋白

3 討 論

FKBP5 是一種具有多種結構域、多種生物學功能的蛋白。本實驗首次通過基因克隆的方法獲得FKBP5CDS 區(qū)，將其與pET-28a 載體相連，并將構建好的原核表達載體轉化到大腸桿菌BL21（DE3）表達菌中，誘導表達蛋白，最后經鑒定獲得豬的FKBP5 蛋白，實驗結果可為進一步研究FKBP5 蛋白的生物學功能以及豬抗病育種研究提供理論依據(jù)。

獲得大量純化的蛋白質是蛋白質功能和理化性質研究的基礎。由于真核表達系統(tǒng)具有表達周期長、效率低、成本高、產量低等缺點，且大腸桿菌具有遺傳背景清晰、經濟方便、表達快速、產量高效等優(yōu)點，目前體外表達外源蛋白最普遍的方法仍然是以大腸桿菌為代表的原核表達系統(tǒng)[19]。在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中，最常使用的質粒為pET 和pGEX 系列。其中，pET 系列質粒帶有His 純化標簽，具有分子量小、免疫原性低、無需進行后續(xù)處理即可用于后續(xù)動物實驗以及若不添加誘導劑蛋白表達過程幾乎不進行的優(yōu)點[20]，因此，在實驗方法上，本研究用以大腸桿菌為代表的原核表達系統(tǒng)，帶有His 純化標簽的pET 系列質粒，以獲得較好的蛋白表達效果。

本實驗對蛋白誘導表達的IPTG 終濃度和誘導時間進行了優(yōu)化，結果發(fā)現(xiàn)，當IPTG 濃度達到1 mmol/L 時，誘導2 h 后蛋白的表達量基本就能達到很高水平。此外，低劑量IPTG 濃度對蛋白表達影響較大，而誘導時間對蛋白的影響并不大。

在本實驗中，蛋白同時以溶解蛋白和包涵體2 種形式表達。普遍認為，包涵體的形成是二硫鍵錯配導致錯誤折疊所致，包涵體形式存在的蛋白沒有活性，需要進行后續(xù)的變性、復性等操作才能使蛋白具有活性，操作較為復雜，且成功率低。因此，“溶解蛋白”表達優(yōu)于“包涵體”表達。若要減少或避免包涵體的形成，可以考慮通過改變誘導過程中的滲透壓[21]、共表達折疊酶[22]、表達分子伴侶[23]、降低表達溫度[24]、融合表達可溶性多肽等方法來進一步提高蛋白的可溶性表達[25]。

4 結 論

本實驗成功構建了pET-28a-FKBP5 重組質粒，并對重組FKBP5 蛋白進行了誘導表達條件優(yōu)化、分離純化、SDS-PAGE 及Western-blot 鑒定，得到了較高純度的重組FKBP5 蛋白，結果可為進一步研究FKBP5 蛋白的生物學功能以及豬的抗病育種提供理論依據(jù)。