楊子茵,黃 軍,李佳宇,曹 西,倪 艷,高安亮(成都醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院核工業(yè)四一六醫(yī)院神經(jīng)外科,成都 610051;通訊作者,E-mail:3034240438@qq.com)

癲癇作為一種常見的反復發(fā)作的頑固性疾病,其發(fā)作機制涉及突觸結(jié)構、細胞死亡、神經(jīng)信號傳導及炎癥[1,2]。研究發(fā)現(xiàn),目前所用抗癲癇藥物對60%的患者有效,40%患者療效不佳,因此尋找有效的治療方法對提高抗癲癇發(fā)作效果與生存質(zhì)量極其重要[1]。微小RNA作為一個小型非編碼RNA家族可通過抑制其靶基因mRNA表達及翻譯來調(diào)控多種蛋白質(zhì)的表達[2]。微小RNA 27b(miR-27b)與腦損傷大鼠神經(jīng)細胞的凋亡密切相關,降低其表達可有效改善腦損傷,除此之外miR-27b-3p與神經(jīng)退行性疾病多系統(tǒng)萎縮癥的發(fā)生有關[3,4]。

自噬在維持細胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用,研究發(fā)現(xiàn)其在癲癇應激下可起到保護作用[5]。PTEN誘導性激酶蛋白1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)/E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligase,Parkin)是一條經(jīng)典的自噬相關通路,其激活可改善腦損傷大鼠的神經(jīng)元損傷[6]。研究發(fā)現(xiàn)在HeLa宮頸癌細胞系中,miR-27b對PINK1的翻譯抑制作用可顯著降低溶酶體對受損線粒體的自噬清除[7]。目前,關于miR-27b及PINK1/parkin通路在癲癇中機制研究還未清楚,因此,本研究通過探究miR-27b及PINK1/parkin通路在癲癇中的作用機制,以期為疾病新治療靶點的尋找提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

從長春市億斯實驗動物技術有限責任公司購買80只SPF級SD大鼠(245-285 g),許可證:SCXK(吉)2016-0004,于正常12 h明暗交替環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周,期間自由飲水采食,實驗前禁食12 h。

1.2 主要試劑

氯化鋰(貨號:0416-100G)購自南京森貝伽生物科技有限公司;HE染色試劑盒(貨號:G1120-100)購自北京索萊寶科技有限公司;蛋白提取試劑盒(貨號:CD-13559-ML)購自武漢純度生物科技有限公司;BCA蛋白檢測試劑盒、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗抗體(貨號:HR0329-ZHV、JN0200-GLH)購自北京百奧萊博科技有限公司;兔抗β-actin、DRP1、PINK1、parkin、Beclin-1抗體(貨號:4970、8570、6946、2132、3495)購自Cell Signaling Technology;兔抗LC3抗體(貨號:NB100-2220)購自Novus Biologicals;TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:D1802)購自?；锟萍加邢薰?miRNA定量試劑盒(貨號:AMPR-0200)購自美國GeneCopoeia;即用型免疫組化EliVisionTMplus試劑盒(貨號:KIT-9901)購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司;陰性對照序列(scramble)、miR-27b antagomiR序列由吉瑪基因合成。

CFX384TMTouch熒光定量PCR系統(tǒng)購自伯樂(Bio-Rad)公司;JEM-2100F場發(fā)射透射電子顯微鏡購自日本電子株式會社;蛋白凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 分組與癲癇模型構建 從80只SD大鼠中隨機選取12只作為對照組;其余大鼠進行模型構建:以127 mg/kg氯化鋰進行腹腔注射,之后每間隔0.5 h注射30 mg/kg匹羅卡品,直至Racine評級達到4-5級即為造模成功[8],成功60只,記錄首次注射匹羅卡品至第一次出現(xiàn)Racine評級4級或5級癲癇發(fā)作所需時間即潛伏期,并記錄1 h內(nèi)發(fā)作次數(shù);對照組在模型組同一時間點腹腔注射等量生理鹽水。將60只大鼠分為模型組、miR-27b NC組、miR-27b拮抗劑組、miR-27b拮抗劑+H89組。對照組與模型組于造模前2周使用腦立體定位儀于大鼠大腦海馬部雙側(cè)定位注射5 μl生理鹽水;miR-27b NC組注射20 nmol/L拮抗劑陰性對照5 μl;miR-27b拮抗劑組注射20 nmol/L miR-27b拮抗劑5 μl;miR-27b拮抗劑+H89組注射20 nmol/L miR-27b拮抗劑5 μl及5 mg/kg[9]PINK1上游因子PKA抑制劑H89;實驗結(jié)束后觀察大鼠行為學變化。

1.3.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-27b表達水平 造模結(jié)束24 h后對大鼠進行頸椎脫臼處死,取出腦組織。每組選取3只大鼠腦組織,一部分液氮冷凍-80 ℃儲存待Western blot檢測,一部分置于研缽中研磨,通過Trizol法提取出腦組織樣本中總RNA后檢測其濃度,以所得RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再以其為模板進行qRT-PCR擴增,檢測各組組織中miR-27b的表達水平;U6作為內(nèi)參,并經(jīng)過2-ΔΔCt分析表達水平;引物由Primer 3.0和Oligo 7軟件設計(見表1),由上海生工生物工程有限公司進行合成(miR-27b下游引物由試劑盒提供)。

表1 實驗所用qRT-PCR引物Table 1 QRT-PCR primers used in the experiment

1.3.3 HE染色觀察大鼠海馬組織病理學變化 每組另取5只大鼠,取其海馬組織,并在4%多聚甲醛中固定(24 h)后乙醇脫水、石蠟包埋、切片(4 μm)、二甲苯脫蠟及梯度乙醇處理,再進行HE染色、脫水、封片、顯微鏡觀察(n=5)。

1.3.4 透射電鏡觀察大鼠海馬CA1區(qū)線粒體超微結(jié)構 取其余4只大鼠海馬組織,使用戊二醛固定4 h后再使用四氧化鋨固定2 h,乙醇、丙酮脫水后環(huán)氧樹脂包埋,切片(0.5 μm),再使用光鏡定位將其制備成超薄切片(60 nm),通過檸檬酸鋁及醋酸雙氧化鈾染色后選取5個視野于透射電鏡下觀察。

1.3.5 免疫組化法檢測DRP1蛋白表達情況 取2.3所得石蠟切片、梯度乙醇脫蠟、水化后加入雙氧水清除內(nèi)源性過氧化物酶,添加枸緣酸鈉緩沖液(1 000 ml)高壓修復抗原,DRP1一抗(1 ∶500)過夜,添加Envision二抗-酶標多聚物30 min后PBS清洗,經(jīng)過DAB顯色顯微鏡下觀察到棕黃色顆粒、脫水干燥、中性樹膠封片觀察,呈棕黃色染色即為陽性。

1.3.6 Western blot檢測腦組織PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達情況 將1.3.2所得3只大鼠腦組織(n=3)經(jīng)苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride、PMSF)裂解后提取總蛋白,經(jīng)BCA法檢測總蛋白含量;取上樣緩沖液與蛋白混勻后100 ℃進行5 min變性,以每孔40 μg的量進行SDS-PAGE凝膠電泳,低溫轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上,5%的脫脂奶粉封閉(1 h)后,按照1 ∶1 000的稀釋度例加入兔抗β-actin、PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ一抗孵育(4 ℃)過夜,PBS清洗3次后HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶3 000)孵育2 h,添加免疫印跡化學發(fā)光試劑(ECL Reagent)進行顯色,蛋白凝膠成像儀觀察,定量分析各蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察

對照組大鼠飲食良好、精神狀態(tài)好、皮毛光潔;模型組和miR-27b NC組大鼠精神萎靡、飲食不佳、體形消瘦、皮毛光澤暗淡臟亂;與模型組相比,miR-27b拮抗劑組大鼠精神狀態(tài)改善、飲食增加、皮毛恢復光澤;與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組大鼠精神狀態(tài)下降、飲食減少、皮毛暗淡。

2.2 各組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)及發(fā)作潛伏期比較

對照組大鼠無癲癇發(fā)作。與模型組相比,miR-27b NC組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)及發(fā)作潛伏期差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而miR-27b拮抗劑組發(fā)作次數(shù)顯著降低,而發(fā)作潛伏期顯著增加(P<0.05);與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組發(fā)作次數(shù)顯著增加,發(fā)作潛伏期顯著降低(P<0.05,見表2)。

表2 各組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)及發(fā)作潛伏期比較Table 2 Comparison of seizure frequency and seizure latency of rats in each

2.3 各組大鼠miR-27b表達水平檢測

與對照組相比,模型組腦組織中miR-27b表達水平顯著增加(P<0.05);與模型組相比,miR-27b NC組miR-27b表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而miR-27b拮抗劑組miR-27b表達水平顯著降低(P<0.05);與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組miR-27b表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表3)。

表3 miR-27b表達情況Table 3

2.4 各組大鼠海馬組織神經(jīng)細胞形態(tài)學觀察

HE染色結(jié)果顯示,對照組大鼠海馬組織神經(jīng)細胞排列規(guī)則、形態(tài)結(jié)構正常,而模型組和miR-27b NC組大鼠海馬組織神經(jīng)細胞出現(xiàn)腫脹、核固縮和溶解現(xiàn)象,排列分布不均且紊亂;與模型組相比,miR-27b拮抗劑組神經(jīng)細胞腫脹、壞死現(xiàn)象改善,排列分布較為有序、均勻;與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組神經(jīng)細胞壞死、腫脹現(xiàn)象加重,排列分布雜亂無序(見圖1)。

圖1 各組大鼠海馬組織神經(jīng)細胞形態(tài)學觀察 (HE,×400)Figure 1 Morphological changes of nerve cells in hippocampus of rats in each group (HE,×400)

2.5 各組大鼠海馬CA1區(qū)線粒體超微結(jié)構觀察

對照組大鼠海馬CA1區(qū)線粒體形態(tài)結(jié)構完整、邊界清晰、嵴未出現(xiàn)破損現(xiàn)象,而模型組和miR-27b NC組大鼠海馬CA1區(qū)線粒體嵴和膜破損、邊界模糊,出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象;與模型組相比,miR-27b拮抗劑組線粒體腫脹及膜破損程度減輕、邊界較為清晰;與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組線粒體結(jié)構破壞又見加重(見圖2)。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)線粒體超微結(jié)構觀察 (×30 000)Figure 2 Observation on the ultrastructure of mitochondria in hippocampal CA1 area of rats in each group (×30 000)

2.6 各組大鼠海馬區(qū)DRP1蛋白表達情況

DRP1陽性細胞表達于神經(jīng)元樣細胞膜上,與對照組相比,模型組DRP1陽性表達顯著增加(P<0.05);與模型組相比,miR-27b NC組DRP1陽性表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而miR-27b拮抗劑組DRP1陽性表達顯著降低(P<0.05);與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組DRP1陽性表達顯著增加(P<0.05,見圖3)。

圖3 大鼠海馬區(qū)DRP1蛋白表達情況 (×200)Figure 3 DRP1 protein expression in the hippocampus of rats (×200)

2.7 Western blot檢測大鼠海馬組織中PINK1/parkin通路及自噬相關蛋白表達情況

與對照組相比,模型組海馬組織中PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,miR-27b NC組PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而miR-27b拮抗劑組PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達水平顯著增加(P<0.05);與miR-27b拮抗劑組相比,miR-27b拮抗劑+H89組PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達水平顯著降低(P<0.05,見表4、圖4)。

表4 大鼠海馬組織中PINK1/parkin通路及自噬相關蛋白表達情況Table 4 Expression of PINK1/parkin pathway and autophagy related proteins in rat

圖4 Western blot檢測大鼠海馬組織中PINK1/parkin通路及自噬相關蛋白表達Figure 4 PINK1/parkin pathway and autophagy-related protein expression in rat hippocampus by Western blot

3 討論

癲癇是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,影響中國約7%的人口,由大腦某特定區(qū)域神經(jīng)元異常引發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮與抑制間不平衡所導致,其發(fā)病機制十分復雜,至今仍未研究清楚[5,10,11]。隨著癲癇發(fā)作時間的延長,對患者大腦神經(jīng)元所造成的損傷持續(xù)加重,嚴重影響患者心理和生理健康,因此尋找其有效治療方法十分重要[12]。

由于miRNA在癲癇的發(fā)生中起著至關重要的作用,因此有作為癲癇生物標記物及治療靶標的潛能[10]。有研究表明癲癇的發(fā)作機制與炎癥相關,神經(jīng)炎癥可導致神經(jīng)系統(tǒng)疾病加重,miR-27b在多發(fā)性硬化癥、阿爾茲海默癥等幾種神經(jīng)炎性疾病中表達異常增加,研究發(fā)現(xiàn),抑制其表達則可緩解神經(jīng)炎癥[1,13]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-27b在癲癇大鼠腦組織中表達異常增加,抑制其表達可改善癲癇大鼠精神、飲食、皮毛狀態(tài),神經(jīng)細胞損傷程度,減少癲癇發(fā)作次數(shù),延長發(fā)作潛伏期。上述結(jié)果表明miR-27b可能與癲癇的發(fā)生有關,抑制其表達對疾病具有改善作用,其有作為癲癇治療靶點的潛能。

自噬是一個高度保守的細胞過程,為維持細胞穩(wěn)態(tài),可將存在功能障礙的細胞器、蛋白質(zhì)等細胞成分送至溶酶體進行降解,該過程可在癲癇應激下起保護作用,自噬功能障礙與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生相關[14,15]。PINK1/parkin作為經(jīng)典的自噬相關信號通路在線粒體運動和大小中具有重要作用[16]。PINK1是一種主要合成于細胞質(zhì)的蛋白激酶,在線粒體正常狀態(tài)下,其通過線粒體膜進入線粒體內(nèi),經(jīng)線粒體蛋白酶PARL剪切后被蛋白酶體降解,而當神經(jīng)元受損致使線粒體膜電位下降時,PINK1被穩(wěn)定于線粒體外膜上募集parkin促進自噬,清除受損細胞成分,從而保護細胞[6,16]。PINK1和parkin在神經(jīng)退行性疾病及神經(jīng)炎癥中具有重要作用,PINK1和parkin缺乏會促進巨噬細胞中組織相容性復合物(MHC)觸發(fā)高水平的線粒體抗原,從而刺激適應性免疫反應的發(fā)生[16,17]。研究發(fā)現(xiàn),parkin缺乏小鼠會出現(xiàn)神經(jīng)元丟失及運動能力降低的現(xiàn)象[15]。miR-27b可通過靶向抑制PINK1表達來降低受損線粒體的自噬清除能力[7]。線粒體動力相關蛋白(dynamin-related protein 1,DRP1)作為線粒體分裂的重要蛋白,其表達異常增加會打破線粒體動態(tài)平衡,致使線粒體功能損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-27b表達可改善癲癇大鼠大腦海馬組織線粒體損傷,降低DRP1陽性細胞數(shù),增加PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達水平,而PINK1上游因子PKA抑制劑H89可逆轉(zhuǎn)上述miR-27b抑制對癲癇大鼠損傷的改善作用。該結(jié)果與前人研究結(jié)果相似[7],這表明miR-27b沉默對癲癇大鼠腦損傷的改善作用與PINK1/parkin通路有關,miR-27b表達沉默可能通過促進PINK1/parkin通路來促進線粒體自噬,抑制神經(jīng)炎癥發(fā)生,以此改善大鼠癲癇程度。

綜上所述,miR-27b表達沉默可通過促進PINK1/parkin信號通路改善大鼠癲癇程度。本研究不僅為癲癇治療靶點的尋找提供參考,還對疾病發(fā)生機制的研究具有重要意義。但在未來的研究中還需對其下游通路進行深入研究。