湯 華,陳少軍(宜昌市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科,宜昌 443099;通訊作者,E-mail:angua1031@aliyun.com)

惡性外周神經(jīng)鞘瘤(malignant peripheral nerve sheath tumour,MPNST)是一種罕見的軟組織惡性腫瘤,起源于外周神經(jīng)分支和神經(jīng)鞘膜[1,2]。目前,手術切除是治療MPNST的主要手段,但MPNST的高度侵襲性、早期轉移和易復發(fā)等臨床特征極大縮短了患者的預期壽命[3]。因此,尋找新的治療靶點,抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力對開發(fā)靶向治療MPNST藥物具有臨床研究意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是19-24個核苷酸的非編碼RNA,與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關[4]。Ning等[5]研究顯示,靶向抑制miR-25-3p表達能夠顯著抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移,但miR-25-3p對MPNST細胞的影響及其作用機制尚不明確。因此,本研究旨在探索miR-25-3p過表達對MPNST細胞系ST88-14增殖、遷移及侵襲的影響,并初步研究其與2型神經(jīng)纖維瘤(neurofibromatosis 2,NF2)基因的靶向調控作用,為臨床提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

惡性外周神經(jīng)鞘瘤ST88-14細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心;RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清、噻唑藍(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)試劑、胰蛋白酶消化液(0.25%)、Trizol試劑盒、RIPA裂解液、逆轉錄試劑盒、Matrigel膠、ECL發(fā)光液(北京Solarbio,貨號10491、12100、P1022、11011-8611、M8180、T1350、15596-018、R0010、T2210-200T、356234、PE0010);miR-25-3p inhibitor、miR-25-3p NC由廣州市銳博生物科技有限公司設計合成;miR-25-3p、U6、NF2、β-肌動蛋白(β-actin)引物均由上海生工生物工程有限公司合成;Merlin兔抗人多克隆抗體、β-actin小鼠抗人單克隆抗體、山羊抗兔lgG(H+L)二級抗體、山羊抗小鼠lgG(H+L)二級抗體(美國Thermo Fisher Scientific,貨號PA5-96130、AM4302、A32731、A32723);PCR儀(德國Eppendorf公司,型號5333型);凝膠成相儀(北京麥思奇高科技有限公司,型號MSD-2000A);二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific,型號BBD6220);酶標儀(美國Bio-Rad,型號ELX-8081U);倒置顯微鏡(日本Nikon,型號MA100N)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將購買的ST88-14細胞置于37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)孵化6-8 h,胰酶消化、離心(1 200 r/min,5 min),用預熱的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸后,分裝進培養(yǎng)瓶,于37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng),培養(yǎng)至3-5代后,部分保種,部分繼續(xù)培養(yǎng)、傳代,收集后用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞分組及轉染 取1.2.1培養(yǎng)的ST88-14細胞,接種于6孔板上(1×105個/孔),待細胞匯合至80%左右,隨機分為對照組(不做任何處理)、miR-25-3p inhibitor組(轉染miR-25-3p inhibitor)、miR-25-3p NC組(轉染miR-25-3p NC)。按照轉染說明書步驟分別用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的miR-25-3p inhibitor儲存液、miR-25-3p NC儲存液與lipo2000轉染液對應處理以上各組ST88-14細胞,轉染4 h,對照組不做任何轉染處理,更換為DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集用于后續(xù)實時熒光定量(qPCR)實驗檢測轉染ST88-14細胞中miR-25-3p的相對表達量,MTT法檢測轉染ST88-14細胞的活性,Annexin Ⅴ-FITC/PI實驗檢測轉染ST88-14細胞的凋亡能力,劃痕實驗檢測轉染ST88-14細胞的遷移能力,Transwell侵襲實驗檢測轉染ST88-14細胞的侵襲能力,蛋白免疫印跡分析實驗檢測靶基因Merlin表達情況。

1.2.3 實時熒光定量(qPCR)實驗檢測轉染ST88-14細胞中miR-25-3p的相對表達量 收集1.2.2各組細胞,分別加入Trizol裂解液,提取總RNA,逆轉錄得cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。以各組cDNA為模板,對各組miR-25-3p、NF2進行PCR擴增。PCR反應條件設置:95 ℃預變性3 min,95 ℃變性20 s,58 ℃退火30 s,62 ℃延伸30 s,以上步驟進行40次循環(huán)。以U6、β-actin為內(nèi)參,計算各組miR-25-3p、NF2 mRNA相對表達量。miR-25-3p、NF2、U6、β-actin引物序列見表1。

表1 miR-25-3p、NF2、U6和β-actin引物序列Table 1 Primer sequences of miR-25-3p, NF2, U6 and β-actin

1.2.4 MTT法檢測轉染ST88-14細胞的活性 收集1.2.2各組ST88-14細胞,接種至96孔板(5×103個/孔),每組設置6個復孔,培養(yǎng)24 h。每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液,孵化4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔添加150 μl DMSO,搖床震蕩10 min(37 ℃),利用酶標儀在波長570 nm下測量各組吸光值(OD值),并計算存活率。細胞存活率=實驗孔OD值/空白對照孔OD值×100%。

1.2.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI實驗檢測轉染ST88-14細胞的凋亡能力 胰酶(不含EDTA)消化收集1.2.2各組ST88-14細胞,PBS洗滌2次,離心(1 000 r/min,5 min),用500 μl Binding Buffer懸浮各組細胞后,加入10 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI,充分混勻,室溫避光靜置10 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡率,以上每組設置6個復孔,凋亡率(%)=凋亡早期細胞比例+凋亡晚期細胞比例。

1.2.6 劃痕實驗檢測轉染ST88-14細胞的遷移能力 收集1.2.2中各組ST88-14細胞,調整細胞懸液密度為6×105個/ml,接種于6孔板上,每孔2 ml,每組設置6個復孔,待細胞融合至90%左右,用200 μl槍頭輕輕劃痕,培養(yǎng)24 h,以上每組設置6個復孔。顯微鏡下觀察并記錄各組ST88-14細胞遷移情況,使用Image J處理,計算劃痕愈合率。愈合率=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.2.7 Transwell侵襲實驗轉染ST88-14細胞的侵襲能力 收集1.2.2各組ST88-14細胞,用無血清培養(yǎng)基調整細胞濃度為1×106個/ml,取200 μl加入預鋪設Matrigel稀釋液的上室中,另取500 μl含血清的培養(yǎng)基加入下室,孵育24 h。取出小室,4%多聚甲醛固定后(25 min),染色25 min,顯微鏡下隨機選取不同視野觀察、拍照并計數(shù),計算侵襲細胞數(shù)均值。以上每組設置5個復孔。

1.2.8 蛋白免疫印跡分析實驗檢測靶基因Merlin蛋白表達情況 用預冷的PBS漂洗1.2.2各組細胞2次,每組設置6個復孔,加RIPA低溫裂解,離心(12 000 r/min,20 min)收集上清蛋白樣品。利用8% SDS-PAFE膠電泳,轉膜后,5%脫脂牛奶封閉4 h(37 ℃),依次加入一抗Merlin、β-actin(1 ∶1 000),4 ℃孵化過夜。洗膜并加入二抗,孵化1.5 h。曝光顯影,觀察條帶并記錄。用Image-J處理各組圖片,以β-actin為內(nèi)參,計算Merlin/β-actin比值。

1.2.9 雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證靶向關系 再次培養(yǎng)ST88-14細胞,接種于24孔板上(2.5×105個/孔),按照1.2.2中方法將1 μg野生型NF2 3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)質粒(NF2-3′UTR-WT)載體和突變型NF2 3′非翻譯區(qū)質粒(NF2-3′UTR-MUT)載體與miR-25-3p NC、miR-25-3p inhibitor分別轉染,依次作為:NF2-3′UTR-WT+miR-25-3p NC組、NF2-3′UTR-WT+miR-25-3p inhibitor組、NF2-3′UTR-MUT+miR-25-3p NC組及NF2-3′UTR-MUT+miR-25-3p inhibitor,每組設置6個復孔,培養(yǎng)24 h,測定各組ST88-14細胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組細胞miR-25-3p表達水平情況

與對照組和miR-25-3p NC組相比,miR-25-3p inhibitor組ST88-14細胞miR-25-3p表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1)。

與對照組相比,*P<0.05;與miR-25-3p NC組相比,#P<0.05圖1 各組細胞miR-25-3p相對表達量Figure 1 Relative expression of miR-25-3p in each group

2.2 miR-25-3p inhibitor轉染對ST88-14細胞存活率的影響

與對照組和miR-25-3p NC組相比,miR-25-3p inhibitor組ST88-14細胞存活率顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2)。

與對照組相比,*P<0.05;與miR-25-3p NC組相比,#P<0.05圖2 miR-25-3p inhibitor轉染后ST88-14細胞存活率變化Figure 2 Changes of survival rate of ST88-14 cells transfected with miR-25-3p inhibitor

2.3 miR-25-3p inhibitor轉染對ST88-14細胞凋亡的影響

與對照組和miR-25-3p NC組相比,miR-25-3p inhibitor組ST88-14細胞凋亡率顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3)。

與對照組相比,*P<0.05;與miR-25-3p NC組相比,#P<0.05圖3 流式細胞儀檢測分析各組ST88-14細胞凋亡率Figure 3 Flow cytometry analysis of apoptosis rate of ST88-14 cells in each group

2.4 miR-25-3p inhibitor轉染對ST88-14細胞遷移能力的影響

與對照組和miR-25-3p NC組相比,miR-25-3p inhibitor組ST88-14細胞劃痕愈合率顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖4)。

與對照組相比,*P<0.05;與miR-25-3p NC組相比,#P<0.05圖4 劃痕實驗檢測各組ST88-14細胞遷移率 (×100)Figure 4 Migration rate of ST88-14 cells in each group by Scratch test (×100)

2.5 miR-25-3p inhibitor轉染對ST88-14細胞侵襲能力的影響

與對照組和miR-25-3p NC組相比,miR-25-3p inhibitor組ST88-14細胞侵襲數(shù)量顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖5)。

與對照組相比,*P<0.05;與miR-25-3p NC組相比,#P<0.05圖5 miR-25-3p inhibitor轉染對ST88-14細胞侵襲能力的影響 (×100)Figure 5 Effect of miR-25-3p inhibitor transfection on invasion ability of ST88-14 cells (×100)

2.6 miR-25-3p inhibitor轉染對ST88-14細胞NF2表達的影響

與對照組和miR-25-3p NC組相比,miR-25-3p inhibitor組ST88-14細胞中NF2 mRNA及Merlin蛋白表達水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖6)。

與對照組相比,*P<0.05;與miR-25-3p NC組相比,#P<0.05圖6 miR-25-3p inhibitor轉染對各組細胞NF2 mRNA、Merlin蛋白表達情況Figure 6 Effects of miR-25-3p inhibitor on the expression of NF2 mRNA and Merlin protein

2.7 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證miR-25-3p與NF2靶向關系

經(jīng)mirtarbase數(shù)據(jù)庫預測數(shù)據(jù)庫預測顯示,miR-25-3p與NF2 mRNA 3′UTR區(qū)有結合位點(見圖7)。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,與NF2-3′UTR-WT+miR-25-3p NC組比較,NF2-3′UTR-WT+miR-25-3p inhibitor組熒光素酶活性降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖7)。

與NF2-3′UTR-WT+miR-25-3p NC組相比,*P<0.05B.雙熒光素酶報告基因檢測結果圖7 miR-25-3p與NF2靶向關系研究Figure 7 Study on the ralationship between miR-25-3p and NF2

3 討論

目前,MPNST治療手段有限,局部復發(fā)率為45%-62%,5年生存率為24%-69%,嚴重威脅著患者的生命安全[6]。Amirnasr等[7]研究證實,miRNA表達譜與MPNST密切相關,部分miRNA會影響MPNST細胞系的遷移和侵襲能力,尋找與MPNST發(fā)生發(fā)展有關聯(lián)的miRNA,并研究其作用機制,可能有助于MPNST的臨床治療。

miRNA是細胞行為的重要調節(jié)劑,對人類癌癥的發(fā)生、疾病進展和治療具有重要作用,并已成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物標記物[8]。丁元杰等[9]發(fā)現(xiàn),miR-25-3p在食管鱗癌患者血清中高表達,與結腸癌的發(fā)生發(fā)展相關;在轉移的結腸癌患者中,miR-25-3p表達水平顯著高于未轉移的結腸癌患者,可能作為轉移結腸癌患者的血液生物標記[10];本研究首先構建了miR-25-3p低表達體系,結果顯示,與對照組和miR-25-3p NC組相比,miR-25-3p inhibitor組ST88-14細胞miR-25-3p表達水平顯著降低,提示轉染成功。Liu等[11]研究發(fā)現(xiàn),miR-25在非小細胞肺癌患者中高表達,過表達miR-25增強非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲,但對細胞的增殖和凋亡幾乎沒有作用。本研究結果顯示,與對照組和miR-25-3p NC組相比,miR-25-3p inhibitor組ST88-14細胞存活率顯著降低、凋亡率顯著升高,提示抑制miR-25-3p表達能夠抑制ST88-14細胞增殖,并誘導凋亡。

高轉移率是造成MPNST預后不良和腫瘤復發(fā)的的重要因素,而腫瘤轉移與腫瘤細胞的遷移和侵襲能力聯(lián)系緊密[3,12]。研究表明,抑制miR-25能顯著抑制三陰乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力[13],此外,miR-25-3p過表達能夠抑制胰腺癌細胞[14]和人肺癌細胞[15]的遷移和侵襲。本研究結果顯示,與對照組和miR-25-3p NC組相比,miR-25-3p inhibitor組ST88-14細胞劃痕愈合率、侵襲數(shù)量顯著降低,提示抑制miR-25-3p表達水平可能抑制MPNST細胞的遷移和侵襲行為,推測miR-25-3p可能成為治療MPNST術后腫瘤復發(fā)和轉移的目標miRNA,為MPNST的臨床治療提供了新的思路。

NF2是編碼Merlin蛋白的基因,是常見的腫瘤抑制因子[16,17]。Merlin蛋白能夠與膜肌動蛋白細胞骨架結合,被認為是控制細胞骨架動力學的因素[18]。Den等[19]研究發(fā)現(xiàn),NF2基因的失活突變是2型神經(jīng)纖維瘤發(fā)病的潛在原因。另有研究顯示[20],在偶發(fā)性和家族性NF2神經(jīng)鞘瘤病例中,均發(fā)現(xiàn)NF2基因突變,但NF2與MPNST的發(fā)生發(fā)展是否存在聯(lián)系尚不明確。本研究結果顯示,與對照組和miR-25-3p NC組相比,miR-25-3p inhibitor組ST88-14細胞中NF2 mRNA及Merlin蛋白表達水平顯著升高,提示抑制miR-25-3p表達能夠促進NF2 mRNA及Merlin蛋白表達,miR-25-3p與NF2可能存在靶向關系。經(jīng)mirtarbase數(shù)據(jù)庫預測顯示,miR-25-3p與NF2 mRNA 3′UTR區(qū)有結合位點。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,與NF2-3′UTR-WT+miR-25-3p NC組比較,NF2-3′UTR-WT+miR-25-3p inhibitor組熒光素酶活性降低,提示miR-25-3p與NF2存在靶向關系,推測miR-25-3p可能通過靶向促進NF2表達,抑制MPNST細胞的增殖、遷移和侵襲,而NF2過表達可能是MPNST發(fā)展的潛在抑癌基因。

綜上所述,下調miR-25-3p表達水平可能通過靶向促進NF2表達,抑制人外周神經(jīng)鞘瘤細胞的增殖、遷移及侵襲,表明miR-25-3p在MPNST轉移中的潛在診斷和治療價值,可能為臨床靶向治療MPNST提供了參考依據(jù)。但鑒于MPNST患者發(fā)病機制的復雜性,以及體內(nèi)外試驗研究的差異性,本文將進一步針對miR-25-3p與MPNST腫瘤疾病的調控機制進行更深入的探索。