張媛媛,馬 靜,何會(huì)娜,郭 銀,李香蘭,池 菲(河北省胸科醫(yī)院急診科,石家莊 0500;河北省胸科醫(yī)院消化內(nèi)科;河北省胸科醫(yī)院護(hù)理部;河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院放療科;通訊作者,E-mail:chi-fei@6.com)

肺癌是全球人類癌癥相關(guān)死亡的首要原因,而其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌85%左右,盡管手術(shù)及化療對(duì)其治療具有一定療效,但患者預(yù)后5年生存率仍然令人擔(dān)憂,造成該結(jié)果的主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥性的產(chǎn)生[1]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)具有自我更新、分化能力,并且對(duì)常規(guī)放化療藥物治療具有強(qiáng)大耐藥性及促進(jìn)癌細(xì)胞遷移的能力,且與患者的復(fù)發(fā)密切相關(guān),因此有必要對(duì)NSCLC細(xì)胞干性及耐藥性機(jī)制進(jìn)行深入研究[1]。人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)作為腫瘤抑制基因,已被證明其與癌細(xì)胞遷移、增殖及化學(xué)耐藥性有關(guān)[2-4]。研究發(fā)現(xiàn),在NSCLC PTEN水平顯著下調(diào);PTEN過表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞順鉑、厄洛替尼等藥物耐藥性以及細(xì)胞干性[4-7]。Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑是一個(gè)進(jìn)化高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),可用于決定細(xì)胞增殖、凋亡和分化,研究發(fā)現(xiàn)NSCLC中,Notch1的表達(dá)顯著增加[8]。有研究發(fā)現(xiàn),在NSCLC細(xì)胞中Notch1可通過抑制PTEN表達(dá)來促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[9]。但Notch1是否可通過調(diào)控PTEN表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞干性及耐藥性產(chǎn)生影響還未可知,因此本研究通過對(duì)其進(jìn)行探究,以期為NSCLC的細(xì)胞干性及耐藥機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

鹽酸多柔比星(阿霉素)(25 mg/瓶，貨號(hào)：D8740)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；青霉素-鏈霉素(貨號(hào)：LM1200K)購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；胰酶溶液(貨號(hào)：PYG0065)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：YCL-0016、164210-500、PM150210)購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司；MTT檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗抗體(貨號(hào)：BTN111105、K12862、WE0381-QAN)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；蛋白提取試劑盒(貨號(hào)：CD-13559-ML)購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司；兔抗β-actin、PTEN(貨號(hào)：4970、9559)購(gòu)自Cell Signaling Technology；兔抗c-Myc、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2，MMP-2)、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor，OCT4)、CD133、醛脫氫酶1A1(aldehyde dehydroge-nase 1A1，ALDH1A1)抗體(貨號(hào)：ab32072、ab16663、ab76003、ab37150、ab19857、ab19898、ab52492)購(gòu)自abcam；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(貨號(hào)：11668027)購(gòu)自賽默飛世爾科技；即用型熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào)：XY-TE-0731)購(gòu)自上海烜雅生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒(貨號(hào)：AR1200-100T)購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司；QIAGEN反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：QIAGEN)購(gòu)自上?？泼羯锟萍加邢薰?。

QuantStudio 3 & 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)、iBright蛋白免疫印跡成像系統(tǒng)購(gòu)自賽默飛世爾科技。

1.2 A549細(xì)胞培養(yǎng)

將A549細(xì)胞接種到DMEM培養(yǎng)基后置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),兩天更換一次培養(yǎng)基直至細(xì)胞融合至80%左右時(shí)用胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染

設(shè)置對(duì)照組、NC-shRNA組、Notch1-shRNA組、Notch1-shRNA+bpV(phen)組,取A549細(xì)胞接種到6孔板中,以密度為2×106培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后,每組5個(gè)復(fù)孔,根據(jù)LipofectamineTM2000說明書以5 nmol/L為最終濃度將NC-shRNA轉(zhuǎn)染至NC-shRNA組細(xì)胞中,Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染至Notch1-shRNA組細(xì)胞中,Notch1-shRNA+bpV(phen)組細(xì)胞經(jīng)Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染后添加100 nmol/L PTEN抑制劑bpV(phen)[10]培養(yǎng)48 h,用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果并檢測(cè)Notch1表達(dá)情況。

1.4 qRT-PCR法檢測(cè)A549細(xì)胞中Notch1 mRNA表達(dá)情況

使用RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞樣本總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并以此為模板通過qRT-PCR檢測(cè)Notch1表達(dá)量;β-actin作為內(nèi)參對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,2-ΔΔCt分析其表達(dá)水平(n=5)。Oligo 7和Primer 3.0所設(shè)引物見表1,由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.5 腫瘤成球?qū)嶒?yàn)分析腫瘤成球率

將培養(yǎng)48 h后的A549以104個(gè)/孔的密度接種到添加含有干細(xì)胞培養(yǎng)液[DMEM培養(yǎng)液中添加2% B27、肝素5 mg/L、人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)20 μg/L及人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)10 μg/L]的24孔板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)10 d后于倒置顯微鏡下觀察(×100)，并記錄直徑>75 μm的腫瘤個(gè)數(shù)，腫瘤成球率(%)=(成球個(gè)數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將培養(yǎng)48 h后的A549細(xì)胞以2×105個(gè)/ml的密度接種于含有1.5中有效成分培養(yǎng)基的6孔板中,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí),通過用200 μl移液槍槍頭劃痕后吸去培養(yǎng)基除去死細(xì)胞,再加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h觀察A549細(xì)胞遷移情況并用IPP軟件測(cè)量遷移距離(D):遷移率(%)=(D48 h-D0 h)/D0 h×100%。

1.7 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞內(nèi)OCT4、CD133、ALDH1A1、PTEN、MMP-9、MMP-2、c-Myc、CyclinD1蛋白表達(dá)情況

使用裂解液對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行裂解后,用BCA蛋白試劑盒測(cè)定各組A549細(xì)胞總蛋白含量;SDS-PAGE電泳分離蛋白、低溫轉(zhuǎn)至PVDF膜上,脫脂奶粉進(jìn)行為時(shí)1 h的封閉,加入兔抗β-actin、OCT4、CD133、ALDH1A1、PTEN、MMP-9、MMP-2、c-Myc、CyclinD1一抗孵育(4 ℃)過夜后再用二抗孵育2 h,蛋白凝膠成像儀定量分析各蛋白含量(n=5)。

1.8 MTT檢測(cè)A549細(xì)胞活力

活力檢測(cè):將各組A549細(xì)胞中以1×104個(gè)/孔的密度(每孔100 μl,n=5)接種于96孔板中培養(yǎng)48 h后,以20 μl/孔的濃度添加MTT(5 g/L),4 h后棄上清培養(yǎng)液加入DMSO 100 μl,震蕩至MTT反應(yīng)結(jié)晶充分溶解后,在570 nm處測(cè)定吸光度OD值,計(jì)算A549細(xì)胞存活率(%)=(OD處理組/OD對(duì)照組)×100%。

耐藥性檢測(cè):在進(jìn)行48 h培養(yǎng)前每組分別添加0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,6.4 mg/ml阿霉素,其余步驟與活力檢測(cè)相同,并計(jì)算細(xì)胞對(duì)阿霉素的半抑制濃度(half-inhibitory concentration,IC50),A549增殖抑制率(%)=(1-OD處理組/OD對(duì)照組)×l00%;逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=Notch1-shRNA組IC50/Notch1-shRNA+bpV(phen)組IC50。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Notch-1轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

相較于對(duì)照組,NC-shRNA組A549細(xì)胞中Notch1表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05),Notch1-shRNA組其表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,見圖1)。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果發(fā)現(xiàn),Notch1-shRNA組綠色熒光強(qiáng)度明顯低于NC-shRNA組(見圖2)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05圖1 A549細(xì)胞中Notch1的表達(dá)情況Figure 1 The expression of Notch1 in A549 cells

綠色熒光代表轉(zhuǎn)染強(qiáng)度圖2 熒光顯微鏡觀察 Notch-1轉(zhuǎn)染效率 (×100)Figure 2 Observation on Notch-1 transfection efficiency under fluorescence microscope (×100)

2.2 Notch-1對(duì)腫瘤成球率的影響

與對(duì)照組相比,腫瘤成球率在NC-shRNA組無顯著變化(P>0.05),在Notch1-shRNA組顯著降低(P<0.05);與Notch1-shRNA組相比,Notch1-shRNA+bpV(phen)組腫瘤成球率顯著增加(P<0.05,見圖3,4)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與Notch1-shRNA組比較,#P<0.05圖3 Notch-1對(duì)腫瘤成球率的影響Figure 3 The influence of Notch-1 on tumor sphere formation rate

圖4 Notch-1對(duì)腫瘤成球率的影響 (×400)Figure 4 The influence of Notch-1 on tumor sphere formation rate (×400)

2.3 MTT法檢測(cè)Notch1對(duì)細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組相比,NC-shRNA組細(xì)胞存活率、c-Myc、CyclinD1表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05),Notch1-shRNA組上述指標(biāo)顯著降低(P<0.05);與Notch1-shRNA組相比,Notch1-shRNA+bpV(phen)組細(xì)胞存活率、c-Myc、CyclinD1表達(dá)水平顯著增加(P<0.05,見表2,圖5)。

表2 MTT法檢測(cè)Notch1對(duì)細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effect of Notch1 on cell proliferation by MTT

圖5 Notch1對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 The effect of Notch1 on the expression of cell proliferation-related proteins

2.4 Notch-1對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響

與對(duì)照組相比,NC-shRNA組細(xì)胞遷移率及MMP-9、MMP-2表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05),Notch1-shRNA組上述指標(biāo)顯著降低(P<0.05);與Notch1-shRNA組相比,Notch1-shRNA+bpV(phen)組細(xì)胞遷移率及MMP-9、MMP-2表達(dá)水平顯著增加(P<0.05,見表3,圖6,7)。

圖6 Notch-1對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響Figure 6 The effect of Notch-1 on the migration of A549 cells

圖7 Notch-1對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 7 The effect of Notch-1 on the expression of migration-related proteins in A549 cells

表3 Notch-1對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響Table 3 The effect of Notch-1 on the migration of A549

2.5 Notch-1對(duì)細(xì)胞干性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,NC-shRNA組細(xì)胞內(nèi)OCT4、CD133、ALDH1A1表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05),Notch1-shRNA組上述指標(biāo)顯著降低(P<0.05);與Notch1-shRNA組相比,Notch1-shRNA+bpV(phen)組細(xì)胞內(nèi)OCT4、CD133、ALDH1A1表達(dá)水平顯著增加(P<0.05,見圖8,表4)。

表4 Notch-1對(duì)細(xì)胞干性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Table 4 The effect of Notch-1 on the expression of cell stemness-related

圖8 Notch-1對(duì)細(xì)胞干性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 8 The effect of Notch-1 on the expression of cell stemness-related proteins

2.6 MTT法檢測(cè)Notch1對(duì)細(xì)胞阿霉素耐藥性的影響

與對(duì)照組相比,NC-shRNA組A549細(xì)胞對(duì)阿霉素的IC50無顯著變化(P>0.05),Notch1-shRNA組IC50顯著降低(P<0.05);與Notch1-shRNA組相比,Notch1-shRNA+bpV(phen)組細(xì)胞對(duì)阿霉素的IC50則顯著增加(P<0.05,見表5,圖9),逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.88倍。

圖9 MTT法檢測(cè)Notch1對(duì)細(xì)胞阿霉素耐藥性的影響Figure 9 Effect of Notch1 on cell resistance to adriamycin by MTT method

表5 MTT法檢測(cè)Notch1對(duì)細(xì)胞阿霉素耐藥性的影響Table 5 Influence of Notch1 on cell resistance to adriamycin by MTT

2.7 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中PTEN的表達(dá)情況

與對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)水平在NC-shRNA組無顯著變化(P>0.05),在Notch1-shRNA組顯著增加(P<0.05);與Notch1-shRNA組相比,Notch1-shRNA+bpV(phen)組細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,見表6,圖10)。

圖10 各組細(xì)胞中PTEN的表達(dá)情況Figure 10 The expression of PTEN in cells in each group

表6 各組細(xì)胞中PTEN的表達(dá)情況Table 6 The expression of PTEN in cells in each

3 討論

NSCLC作為肺癌的主要類型,其患者5年預(yù)后不良現(xiàn)象嚴(yán)重,而造成這一現(xiàn)象的主要原因是由于手術(shù)及化療無法根除癌細(xì)胞的侵襲性及致死性,除此之外,由于NSCLC對(duì)常規(guī)化療藥物的耐藥性,也使得治療效果受到極大的限制[11,12]。研究發(fā)現(xiàn)CSCs對(duì)常規(guī)放化療藥物具有強(qiáng)大耐藥性及促進(jìn)癌細(xì)胞遷移的能力,其與患者復(fù)發(fā)密切相關(guān),因此有必要對(duì)NSCLC細(xì)胞干性及耐藥性機(jī)制進(jìn)行深入研究[1]。

Notch1作為最重要細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)Notch途徑組成之一,具有促腫瘤作用。近期有相關(guān)報(bào)道稱Notch1與阿霉素等化療藥物耐藥性有關(guān),研究表明Notch1高表達(dá)使小細(xì)胞肺癌(SCLC)對(duì)高濃度阿霉素產(chǎn)生耐藥性[13];抑制Notch1表達(dá)可提高乳腺癌、結(jié)腸癌等多種癌癥的化療敏感性[14,15]。研究發(fā)現(xiàn),Notch信號(hào)通路還參與調(diào)控阿霉素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞富集的過程[14]。在A549細(xì)胞中,Notch1表達(dá)沉默可抑制CD133陽(yáng)性細(xì)胞富集,并增加順鉑(CDDP)等藥物敏感性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,Notch1-shRNA組腫瘤成球率、細(xì)胞遷移率、增殖、MMP-9、MMP-2、OCT4、CD133、ALDH1A1、c-Myc、CyclinD1表達(dá)水平、阿霉素耐藥性降低,該結(jié)果表明Notch1表達(dá)降低能夠抑制A549細(xì)胞干性及阿霉素耐藥性。

PTEN已被發(fā)現(xiàn)可通過調(diào)節(jié)各種細(xì)胞信號(hào)通路或被其他上游因子調(diào)控,在細(xì)胞存活、增殖和凋亡中起重要作用,其表達(dá)異常與NSCLC等多種癌癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[17,18]。研究發(fā)現(xiàn),lnc ARSR過表達(dá)可通過抑制PTEN表達(dá)來促進(jìn)蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)表達(dá),從而誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[19]。PTEN過表達(dá)可抑制耐吉非替尼的A549細(xì)胞的腫瘤成球率[20]。肺腺癌細(xì)胞中PTEN過表達(dá)可提供A549細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性[21]。還有研究發(fā)現(xiàn),PTEN表達(dá)沉默與Notch1上調(diào)表達(dá)可協(xié)同促進(jìn)NSCLC惡性生物學(xué)進(jìn)程[22]。PTEN是p53的下游產(chǎn)物之一,Notch1可通過抑制p53表達(dá)來抑制PTEN表達(dá),從而激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)PI3K/AKT信號(hào)通路,以此促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),Notch1-shRNA組PTEN水平遠(yuǎn)高于對(duì)照組;本研究參考陸天飛等[10]研究中所用的PTEN抑制劑濃度處理細(xì)胞,在Notch1-shRNA成功抑制PTEN表達(dá)后,腫瘤成球率、細(xì)胞遷移率、增殖、MMP-9、MMP-2、OCT4、CD133、ALDH1A1、c-Myc、CyclinD1表達(dá)水平、阿霉素耐藥性部分恢復(fù),提示PTEN可逆轉(zhuǎn)Notch1沉默降低A549細(xì)胞干性及阿霉素耐藥性作用,Notch1可能通過促進(jìn)PTEN表達(dá)發(fā)揮此作用。

綜上所述,Notch1可通過促進(jìn)PTEN表達(dá)抑制A549細(xì)胞干性及阿霉素耐藥性,本研究不僅對(duì)NSCLC細(xì)胞干性及其耐藥性機(jī)制的研究具有重要參考價(jià)值,還為NSCLC化療耐藥性的靶向治療機(jī)制研究提供了新的參考,但在未來的研究中還需對(duì)A549細(xì)胞干性與阿霉素耐藥性間的關(guān)系進(jìn)行研究,使研究更為完善。