李嘉熙,趙敏超,李家良,常素娥(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)療研究院,西安 710004;通訊作者,E-mail:suechang@xjtu.edu.cn)

胃癌(gastric cancer,GC),是世界十大惡性腫瘤之一。據(jù)2020年WHO全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù),胃癌的發(fā)病率和死亡率分別居第五位和第四位,其中胃癌發(fā)病108萬(占5.6%),胃癌死亡77萬(占7.7%),在我國惡性腫瘤中排第3位和第2位,占全球比接近一半[1]。近年來靶向治療和新輔助化療作為新型治療方法一定程度上改善了患者預(yù)后,且隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的改變,我國胃癌的死亡率和發(fā)病率總體呈逐漸下降趨勢,但是有明確的分子機制研究且可方便采取的干預(yù)措施相對較少,因此維生素D對胃癌發(fā)生發(fā)展的作用機制研究對人類防治胃癌提供依據(jù)有著重要的意義。

維生素D3是一種人體必需的營養(yǎng)物質(zhì),近年來基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究表明,維生素D3缺乏會提高多種腫瘤疾病發(fā)生的風(fēng)險[2,3],尤其是消化道癌癥疾病[4]。維生素D3為一種固醇類衍生物,其活性形式1,25(OH)2D3(1alpha,25-dihydroxyvitamin D3)主要通過和維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)結(jié)合,再與視黃醇X受體(retinoid X receptor,RXR)形成異源二聚體,在胞核中識別維生素D反應(yīng)元件(vitamin D response elements,VDREs),從而激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、遷移、侵襲和血管生成[5,6]。近年研究發(fā)現(xiàn)維生素D3也會以直接或間接地方式調(diào)控多種miRNAs(microRNAs)的表達(dá)水平[7],而miRNAs作為一類長20 nt左右的非編碼小分子RNA,廣泛存在于真核生物中,胃癌中存在多種miRNAs的異常表達(dá)參與胃癌細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展。本研究從維生素D3影響胃癌細(xì)胞中miRNA表達(dá)入手,研究維生素D3對胃癌細(xì)胞遷移的調(diào)控機制,為維生素D3在胃癌中的分子機制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

維生素D3粉末、結(jié)晶紫購自北京索萊寶科技有限公司,RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司,胰酶購自山東思科捷科學(xué)儀器有限公司,胎牛血清購自美國GEMINI公司,PBS購自GIBCO公司,miR-145抑制劑和引物購自上海生工生物工程有限公司,Lipofectamine2000、Trizol購自Invitrogen公司,二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。6孔板、12孔板、24孔板、培養(yǎng)瓶、凍存管購自美國Corning公司,Transwell小室購自Millpore公司。AGS、BGC-823、SGC-7901和GES-1細(xì)胞均受贈于西安交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)實驗中心。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌細(xì)胞AGS、BGC-823、SGC-7901和正常GES-1細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng),將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2及適宜濕度的培養(yǎng)箱中,每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài),隔天換液或傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和維生素D3處理

為觀察維生素D3對胃癌細(xì)胞遷移能力的影響,將胃癌細(xì)胞SGC-7901分為對照組和維生素D3組。將細(xì)胞種到12孔培養(yǎng)板內(nèi),待細(xì)胞達(dá)到70%匯合度,分別加入DMSO和維生素D3(終濃度500 nmol/L),然后用Transwell遷移實驗檢測胃癌細(xì)胞遷移能力。

為觀察維生素D3作用的分子通路,將胃癌細(xì)胞SGC-7901分為對照組、維生素D3組、miR-145抑制劑組和聯(lián)合處理組。先將細(xì)胞種到12孔培養(yǎng)板內(nèi),待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右,用DMSO處理對照組和miR-145抑制劑組,用維生素D3(終濃度500 nmol/L)處理維生素D3組和聯(lián)合處理組,1 d后再將miR-145抑制劑用lipo2000依照說明書轉(zhuǎn)染至miR-145抑制劑組和聯(lián)合處理組細(xì)胞,然后用Transwell遷移實驗檢測細(xì)胞遷移能力。

1.4 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR檢測VDR表達(dá)水平

提取胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、BGC-823、SGC-7901和正常GES-1細(xì)胞的RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以GES-1組為對照組,應(yīng)用實時定量PCR實驗檢測VDR在胃癌細(xì)胞系中的相對表達(dá)量。具體操作步驟見下:①RNA提取:將細(xì)胞分別種在6孔板中,待細(xì)胞狀態(tài)良好,達(dá)到90%匯合度,每孔加入Trizol 1 ml,依次加入氯仿,離心后收集水相,加入異丙醇,棄上清,加入75%乙醇(DEPC水稀釋),離心棄上清,加入50 μl DEPC水溶解沉淀,最后利用Nano-drop進(jìn)行濃度測定提取的RNA濃度。②RNA逆轉(zhuǎn)錄:依次加入反應(yīng)體系,5×primer Script Buffer 2 μl+RT Enzyme Mix 0.5 μl+逆轉(zhuǎn)錄引物0.5 μl+RNA(200 ng/μl)1 μl+RNAase free ddH2O 6 μl,設(shè)置反應(yīng)條件為:37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s。然后稀釋至50 ng/μl,-20 ℃凍存。③qRT-PCR:依次加入real-time PCR體系:SYBR premix ExTaq TM Ⅱ(2×)10 μl+F-primer 1 μl+R-primer 1 μl+cDNA(100 ng/μl)1 μl+ddH2O 7 μl,設(shè)置反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s,然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s進(jìn)行40個循環(huán)反應(yīng),完成后進(jìn)行溶解曲線繪制。VDR上游引物:5′-GAAGCTGAACTTGCATGAGGA-3′,下游引物:5′-GTCCTGGATGGCCTCAATC-3′;GAPDH上游引物:5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′,下游引物:5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。

1.5 Transwell細(xì)胞遷移實驗

通過Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移能力,實驗分為對照組、維生素D3組、miR-145抑制劑組和聯(lián)合處理組,按照1.3中提到的方法處理細(xì)胞。具體實驗步驟:將轉(zhuǎn)染后1 d的各組細(xì)胞分別用胰酶消化,培養(yǎng)基洗3遍,1% FBS的RPMI-1640重懸細(xì)胞,將不同組細(xì)胞濃度稀釋到5x105cells/ml,取200 μl加入Transwell上室中,下室加入600 μl完全培養(yǎng)基,孵育培養(yǎng)20-24 h后,取出小室,棉簽擦去上室非侵襲細(xì)胞,于超凈臺中倒置風(fēng)干,在24孔培養(yǎng)板中加入600 μl 0.1%結(jié)晶紫,將小室置于其中浸沒到結(jié)晶紫中,37 ℃染色30 min;取出小室,用PBS沖洗小室及24孔板,到清洗的PBS無紫色。在顯微鏡下對不同組小室進(jìn)行觀察,直徑上取5個視野進(jìn)行照相,利用Image J統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)量,并計算相對遷移率。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 13.0軟件包,兩組樣本之間的比較采用獨立樣本t檢驗,所有結(jié)果重復(fù)3次。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 維生素D3抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的遷移

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,維生素D3組細(xì)胞穿過Transwell小室膜的細(xì)胞明顯減少(見圖1),兩組間相對遷移率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,見圖1)。表明維生素D3對胃癌細(xì)胞的遷移有抑制作用。

與對照組比較,**P<0.01圖1 維生素D3對胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移的影響 (×20)Figure 1 The effect of miR-145 on the cell migration of SGC-7901 cells (×20)

2.2 VDR在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

相對于正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1,胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、BGC-823和SGC-7901細(xì)胞系中,VDR表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,見圖2)。提示維生素D3可能通過VDR影響下游靶基因的表達(dá)。

與GES-1比較,**P<0.01圖2 VDR在胃癌細(xì)胞中的相對表達(dá)量Figure 2 Relative expression of VDR in gastric cancer cell lines

2.3 維生素D3通過miR-145抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的遷移

結(jié)果顯示,相對于對照組,miR-145抑制劑組遷移細(xì)胞數(shù)多,兩組間相對遷移率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,見圖3);相對于維生素D3處理組,聯(lián)合處理組遷移細(xì)胞數(shù)有一定增加,兩組間相對遷移率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,見圖3)。提示維生素D3對胃癌細(xì)胞遷移功能的影響可能通過miR-145實現(xiàn)。

圖3 miR-145抑制劑對維生素D3抑制胃癌細(xì)胞遷移作用的影響 (×20)Figure 3 Effect of miR-145 inhibitor on the inhibitory effect of vitamin D3 on gastric cancer cell migration (×20)

3 討論

近年來,流行病學(xué)和動物研究發(fā)現(xiàn)低水平的維生素D與癌癥風(fēng)險增加相關(guān),且維生素D缺乏已經(jīng)影響總?cè)丝诘?0%[3]。已有研究顯示,只有8.1%的胃癌患者達(dá)到足夠的維生素D3水平,且57.9%患者處于缺失水平,低水平維生素D與低生存率有顯著的相關(guān)性,維生素D水平可作為胃癌的獨立預(yù)后因素[8]。關(guān)于維生素D3抑制腫瘤發(fā)生和生長的作用已有諸多報道,主要在細(xì)胞的生長、增殖、凋亡、遷移和侵襲等經(jīng)典癌癥途徑研究方面。

維生素D3主要通過結(jié)合并激活受體VDR發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),在惡性腫瘤中,通過ChIP-seq在癌細(xì)胞的基因組發(fā)現(xiàn)上千個VDRE位點,多種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞程序性死亡的蛋白表達(dá)受到VDR的影響[9],此外,miRNA作為一類重要的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA,其本身在癌癥異常表達(dá)并參與調(diào)控腫瘤增殖分化等生物學(xué)功能,維生素D3對miRNAs表達(dá)的影響以及是否通過VDR進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控,為維生素D3發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)增加一種新的分子機制,關(guān)于miRNA參與維生素D3在癌細(xì)胞中的調(diào)控機制,已有多項研究報道,例如Kong等[10]研究表明VDR信號抑制癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞釋放外泌體miR-10a-5p,并限制其對胰腺癌細(xì)胞的支持作用;我們之前的研究表明,miR-145作為VDR的靶基因直接參與了維生素D3對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用[11]。在本文中,我們進(jìn)一步研究說明維生素D3能夠抑制胃癌SGC-7901的細(xì)胞遷移,且挽救實驗證實miR-145在其中發(fā)揮重要的中間分子作用,進(jìn)一步說明維生素D3在調(diào)控胃癌細(xì)胞的分子機制中,可能通過遷移相關(guān)的靶基因抑制胃癌細(xì)胞遷移,且miR-145有多個已經(jīng)證實的遷移相關(guān)靶基因通過Sp1/NF-κB等介導(dǎo)的信號通路抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[12]。近兩年也有較多關(guān)于miR-145受上游基因調(diào)控再通過靶基因所在經(jīng)典的腫瘤細(xì)胞信號通路而影響癌細(xì)胞遷移,例如PVT1通過調(diào)節(jié)miR-145-5p/ITGB8軸并抑制MEK/ERK信號通路,敲低PVT1可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)其凋亡[13]。我們也將進(jìn)一步研究miR-145在胃癌中的信號通路,為維生素D3在胃癌中的作用機制提供新的理論基礎(chǔ)。