張旭東，王杰寧，季旻曄，李金平

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海 201801；2.上海市第七人民醫(yī)院，上海 200137)

高脂血癥由人體脂質(zhì)代謝紊亂引發(fā)，是常見的疾病之一。高脂血癥患者血清脂質(zhì)水平顯著高于正常人，該疾病已成為引起心血管疾病的主要原因之一，因此有必要尋找安全有效的治療藥物[1-2]。目前人們對天然中草藥治療疾病和改善健康狀況的作用越來越感興趣，并且已有大量研究證明其安全可靠。枸骨葉是一種天然野生冬青科植物枸骨的葉片，含有黃酮類、皂苷等多種有效物質(zhì)，具有抗氧化、抑菌、降血脂功效[3]。研究表明，枸骨葉能有效降低高脂血癥模型大鼠的血清血脂水平并調(diào)節(jié)血流異常情況[4]。本研究通過構(gòu)建高脂血癥大鼠模型，探究枸骨葉水提物(ICAE)對高脂血癥大鼠血脂水平及肝臟抗氧化活性的影響。

1 儀器與材料

1.1儀器 RT2100C型全自動酶標儀(德國IFP公司)；AU5800型全自動生化分析系統(tǒng)(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2試藥 辛伐他汀(浙江京新藥業(yè)股份有限公司)；總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)檢測試劑盒(批號分別為：SBJ-M0602、SBJ-R0195)，均購自南京森貝伽生物科技有限公司；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，批號分別為CD-107591-ELISA、CD-109021-ELISA，均購自武漢純度生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，批號分別為QYS-23028、QYS-23035，均購自齊一生物科技(上海)有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，批號E0101，上海寶曼生物科技有限公司)。

1.3動物 72只健康的雄性SD大鼠，體質(zhì)量為155～186 g，由武漢大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2008-0004，所有大鼠于正常明暗交替、相對濕度為40%～70%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由飲食。

2 方法

2.1ICAE的制備 枸骨葉購自安徽省冰源堂藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)醫(yī)院內(nèi)中醫(yī)藥專家鑒定為正品。將200 g枸骨葉以料液比為1∶10的比例加入去離子水煮沸提取2次(2 h·次-1)濃縮為200 mL，即枸骨葉含量為1 g·mL-1[4]。

2.2動物分組及給藥 將72只大鼠分為空白對照組與模型組，空白對照組(12只)以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型組(60只)以高脂飼料喂養(yǎng)[基礎(chǔ)飼料(790 g·kg-1)+蛋黃粉(100 g·kg-1)+豬油(100 g·kg-1)+膽固醇(10 g·kg-1)]，進行為期4周的模型建立，與造模前相比，造模后大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平顯著增加，HDL-C水平顯著降低即為造模成功[5]。造模成功后將模型組大鼠分為模型對照組、陽性對照組(辛伐他汀，1.33 mg·kg-1)、ICAE低劑量組(0.15 g·mL-1)、ICAE中劑量組(0.30 g·mL-1)和ICAE高劑量組(0.60 g·mL-1)[6]?？瞻讓φ战M及模型對照組以生理鹽水進行灌胃，其他組以相應(yīng)藥物灌胃，每日1次，劑量為10 mL·kg-1，為期6周。每周稱取1次體質(zhì)量以調(diào)整灌胃劑量[4]。

2.3血清指標檢測 于造模前、結(jié)束及藥物處理后分別進行尾靜脈取血(n=12)，以4 000 r·min-1離心10 min，取上清，檢測TC、TG、HDL-C和LDL-C水平，并計算動脈粥樣硬化指數(shù)(AI1和AI2)：AI1=(TC-HDL-C)÷HDL-C;AI2=LDL-C÷HDL-C。

2.4肝臟抗氧化指標檢測 取肝臟并稱質(zhì)量，計算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)=(肝臟質(zhì)量-體質(zhì)量)×100%；在研缽中將肝組織研磨成勻漿液，以 4 000 r·min-1離心10 min，取上清，再根據(jù)試劑盒說明書檢測SOD、MDA和GSH-Px水平(n=5)。

2.5蘇木精-伊紅(HE)染色 取肝臟組織用多聚甲醛固定后乙醇脫水，用石蠟包埋后切片(4 μm)，依次用二甲苯脫蠟及梯度乙醇處理后進行HE染色、脫水、封片，并用顯微鏡觀察(n=5)。

2.6油紅O染色 取2.5項下所余肝臟組織，制作冰凍切片(7 μm)，油紅染液染色30 min后異丙醇分色，用蘇木精染色2 min，蒸餾水清洗至無色后甘油明膠封片，選取玻片10張1組，每張選取6個視野進行圖像分析(200×)。

3 結(jié)果

3.1造模后各組大鼠血脂變化情況 與空白對照組相比，造模4周后，模型組大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平顯著增加(P<0.05)，而HDL-C水平顯著降低(P<0.05)，說明造模成功。見表1。

表1 造模前、后各組大鼠血脂變化情況

3.2大鼠體質(zhì)量變化情況 6周后模型對照組大鼠與空白對照組相比體質(zhì)量顯著增加(P<0.05)；與模型對照組相比，陽性對照組、ICAE低、中和高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠體質(zhì)量變化情況

3.3ICAE對高脂血癥大鼠血脂水平的影響 模型對照組大鼠與空白對照組相比，血清中TC、TG和LDL-C水平顯著增加，而HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；與模型對照組相比，陽性對照組、ICAE低、中和高劑量組大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平顯著降低，而HDL-C水平顯著增加(P<0.05)。見表3。

表3 ICAE對高脂血癥大鼠血脂水平的影響

3.4ICAE對高脂血癥大鼠動脈粥樣硬化指數(shù)的影響 模型對照組大鼠與空白對照組相比，AI1和AI2顯著增加(P<0.05)；與模型對照組相比，陽性對照組、ICAE低、中和高劑量組大鼠AI1和AI2顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 ICAE對高脂血癥大鼠動脈粥樣硬化指數(shù)的影響

3.5ICAE對高脂血癥大鼠肝臟抗氧化活性的影響 模型對照組大鼠與空白對照組相比，肝臟中MDA顯著增加，SOD和GSH-Px顯著降低(P<0.05)；與模型對照組相比，陽性對照組、ICAE低、中和高劑量組大鼠肝臟中MDA顯著降低，SOD和GSH-Px顯著增加(P<0.05)。見表5。

表5 ICAE對高脂血癥大鼠血清抗氧化活性的影響

3.6ICAE對高脂血癥大鼠肝臟指數(shù)的影響 模型對照組大鼠與空白對照組相比，大鼠肝臟指數(shù)顯著增加(P<0.05)；與模型對照組相比，陽性對照組、ICAE低、中和高劑量組大鼠肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表6。

表6 ICAE對高脂血癥大鼠肝臟指數(shù)的影響

3.7各組大鼠肝臟組織病理學(xué)檢測 空白對照組大鼠肝細胞整齊緊密，呈放射狀排列，肝小葉輪廓清晰可見，無空泡變性現(xiàn)象；模型對照組肝組織細胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡現(xiàn)象，變性嚴重，細胞排列紊亂，肝小葉界限模糊不清，炎性細胞浸潤現(xiàn)象嚴重；陽性對照組及ICAE低、中和高劑量組隨著藥物劑量的增加細胞排列逐漸整齊，脂肪空泡及炎性細胞浸潤現(xiàn)象減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)逐漸清晰。見圖1。

圖1 肝臟組織病理學(xué)觀察 (HE，200×)

3.8各組肝臟油紅O染色結(jié)果比較 空白對照組肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，模型對照組肝組織中出現(xiàn)橘紅色脂質(zhì)沉積現(xiàn)象，而陽性對照組及ICAE低、中、高劑量組隨著藥物劑量的增加橘紅色脂質(zhì)沉積逐漸減少。見圖2。

圖2 肝臟油紅O染色結(jié)果比較 (200×)

4 討論

高脂血癥已被證明是動脈粥樣硬化及引發(fā)心血管疾病的重要危險因素之一，具體表現(xiàn)為LDL-C、HDL-C等水平失衡[7-9]。高脂血癥還包括TC和TG水平均升高的高三酰甘油血癥及混合性高脂血癥[10]。已有研究表明，LDL-C水平升高可導(dǎo)致動脈內(nèi)斑塊積聚，從而增加心肌梗死、中風(fēng)等心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險，而HDL-C可清除體內(nèi)膽固醇，其水平升高可降低動脈粥樣硬化性心血管疾病的風(fēng)險[11]。目前治療高脂血癥的他汀類藥物治療效果差且會產(chǎn)生不良反應(yīng)，因此有必要尋找更加安全有效的治療藥物。目前已有大量研究證明，中藥治療疾病和改善健康狀況的安全性高。研究表明，新疆芹菜根可降低高脂血癥大鼠血清中TC和TG水平，升高HDL-C和SOD水平，減輕肝臟脂肪變性程度，表現(xiàn)出有效的降血脂和抗氧化作用[12]。還有研究表明，復(fù)方四味余甘子方通過降低肝臟三羥基三甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)陽性細胞數(shù)量及血清TG、TC、LDL-C和MDA含量起到降血脂和抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用[13]。此外，有研究表明，在高脂血癥大鼠中丹紅的降血脂功能及促進脂肪酸氧化的作用與激活腺苷酸激活蛋白激酶/膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白/乙酰輔酶A羧化酶(AMPK/SREBP-1/ACC)通路有關(guān)[14]。

枸骨葉是一種天然野生中藥，具有抗炎、抑菌、降血壓、降血脂、抗脂肪肝和提高抗氧化能力的功效，研究表明，其能有效降低高脂血癥大鼠血清血脂水平并調(diào)節(jié)血流異常情況[4,15-16]。ICAE能通過降低高脂飲食(HFD)小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、皮下脂肪含量、TC和TG水平達到預(yù)防肥胖的目的，并且可通過抑制脂肪分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(PPARγ)的表達來抑制脂肪分化[15]。另有研究表明，ICAE通過降低磷酸化表皮生長因子受體(p-EGFR)在肝臟中的表達水平來降低高脂飲食小鼠的血脂水平[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥模型對照組大鼠與空白對照組相比體質(zhì)量、TC、TG、LDL-C、AI1和AI2顯著增加，而HDL-C顯著降低；與模型對照組相比，陽性對照組及ICAE低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量、TC、TG、LDL-C、AI1和AI2顯著降低，而HDL-C顯著增加，與其他研究結(jié)果一致，這表明ICAE具有有效降低體質(zhì)量、降血脂和降低動脈粥樣硬化患病風(fēng)險的功效。

機體內(nèi)活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，疾病的產(chǎn)生可導(dǎo)致這一平衡失調(diào)，從而對機體造成損傷，抗氧化系統(tǒng)在這一過程中起重要作用[1]。MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可反映機體脂質(zhì)過氧化程度[18-19]。SOD和GSH-Px是細胞酶系統(tǒng)中重要的抗氧化劑，SOD能有效清除體內(nèi)ROS以降低氧化損傷，而GSH-Px可抑制多不飽和脂肪酸的過氧化，因此兩者在機體內(nèi)具有重要的抗氧化作用[18,20-21]。相關(guān)研究表明，枸骨葉提取物能夠通過降低血清MDA含量、增加SOD活性來提高高脂血癥大鼠的抗氧化能力[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對照組大鼠與空白對照組相比，肝臟中MDA顯著增加，而SOD和GSH-Px顯著降低；與模型對照組相比，陽性對照組及ICAE高、中、低劑量組大鼠MDA顯著降低，而SOD和GSH-Px顯著增加。該結(jié)果表明，ICAE能通過增加SOD和GSH-Px水平、降低MDA水平提高高脂血癥大鼠肝臟的抗氧化能力。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)，模型對照組大鼠與空白對照組相比，肝臟指數(shù)顯著增加、肝臟脂肪病變程度加深及脂肪沉積嚴重，而陽性對照組及ICAE低、中和高劑量組大鼠肝臟指數(shù)、肝臟脂肪病變程度及脂肪沉積現(xiàn)象與模型對照組比較明顯減輕，這表明ICAE能通過降血脂作用有效降低高脂血癥大鼠脂肪肝的形成。

綜上所述，ICAE可有效降低高脂血癥大鼠血脂水平，并提高大鼠肝臟抗氧化能力，預(yù)防脂肪肝的形成。本研究在已有研究的基礎(chǔ)上進一步研究ICAE對高脂血癥大鼠肝臟抗氧化能力的影響，為ICAE治療高脂血癥提供充足的理論依據(jù)，但關(guān)于ICAE治療高脂血癥的最佳劑量還需進一步探索。