款冬花炮制后咖啡?？鼘幩犷惢衔锖孔兓芯?/h1>
2021-11-18 08:41:10吳琪珍
亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2021年10期
吳琪珍
(贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學院，江西 贛州 341000)
款冬花是菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，歸肺經(jīng)，主治潤肺下氣，止咳化痰，用于新久咳嗽，喘咳痰多，勞嗽咳血[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》稱款冬花為“治嗽之最”，尤其是款冬具有甘溫清補的功效，因此為臨床常用止咳藥物[2]?？疃ㄖ泻休祁?、酚酸類、黃酮類、生物堿類、多糖類、甾醇類等成分，其中倍半萜類成分款冬酮為《中華人民共和國藥典》的含量指標性成分，目前對款冬花的成分分析研究主要集中于款冬酮和吡咯里西啶生物堿[3-4]，但對其他類型成分的含量研究較少。
款冬花中含有大量的咖啡酰奎寧酸類化合物，包括綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C等，研究[5]表明，這些化合物可顯著抑制小鼠咳嗽頻率，提高小鼠酚紅分泌水平及抗炎效果，具有良好的止咳化痰活性?？疃ǖ默F(xiàn)代炮制方法為蜜炙，蜜炙后可提高藥物療效，增強潤肺止咳效果[6]?，F(xiàn)代藥理研究[7]表明，款冬花生品與蜜炙品的水提物均有一定止咳作用。HPLC指紋圖譜分析研究[8]表明，綠原酸、異綠原酸A等10個化合物是款冬花生品與蜜炙品差異的主要標志物，基于NMR代謝組學技術的研究[9]發(fā)現(xiàn)，款冬花經(jīng)過蜜炙后，綠原酸、咖啡酸等有機酸的量有所降低。此外，款冬花古代也有甘草水浸的方法?？疃ń?jīng)甘草汁制后，總生物堿含量顯著減少，可降低毒性[10]。
本研究通過高效液相色譜法，對款冬花中4種咖啡酰奎寧酸類化合物(綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C)進行分析，明確款冬花炮制后咖啡?？鼘幩犷惢衔锖孔兓⒈容^不同炮制方法對其的影響，以期為該類化合物的止咳活性研究提供參考。
1 儀器與材料
1.1 儀器
1260型高效液相色譜儀(美國Angilent公司)；CPA225D 型 1 /10 萬分析天平(德國 Sartorius公司)；KQ-500E 臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
1.2 材料
對照品綠原酸(批號：J0120AS)、異綠原酸A(批號：D1018AS)、異綠原酸B(批號：J0202AS)、異綠原酸C(批號：M1123AS)均來自美倫生物技術有限公司，甲醇為色譜純(德國MERCK公司)，乙醇為分析純(西隴科學)。
款冬花中藥材購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學院吳琪珍鑒定為菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾。
2 方法與結果
2.1 款冬花炮制及浸膏制備
2.1.1 款冬花炮制 蜜款冬花：取凈款冬花50 g，加入煉蜜12.5 g，潤透，文火炒至不粘手，表面棕黃色，炒后蜜炙款冬花成品為50.1 g。
甘草制款冬花：取3 g甘草飲片，加水煎煮2次，合并煎液得30 mL，再加入凈款冬花50 g，浸潤24 h，烘箱60 ℃干燥，干燥后甘草制款冬花的成品為49.8 g。
2.1.2 款冬花浸膏制備 取款冬花生品20 g，加入6倍量體積70%乙醇，于60 ℃回流提取2 h，過濾后藥材繼續(xù)用5倍量體積70%乙醇回流提取1 h，重復2次，合并提取液，回收乙醇，水浴干燥，得到款冬花浸膏(KD-生品)。按同樣方法，制得蜜款冬花浸膏(KD-蜜炙)與甘草汁制款冬花浸膏(KD-甘草)。
2.2 色譜條件
色譜柱Welch Ultimate XB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；柱溫：25 ℃；流動相：0.1%甲酸(A)-甲醇(B)，流速0.8 mL/min；進樣量10 μL，梯度洗脫(0～8 min，85%～75% A；8～20 min，75%～70% A；20～21 min，70%～61% A；21～30 min，61%～60% A；30～35 min，60%～52% A；35～41 min，52% A；41～45 min，52%～40% A)，檢測波長326 nm。
2.3 溶液制備
2.3.1 對照品溶液制備 取綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C對照品適量，精密稱定，置同一容量瓶中，加入50%甲醇制成濃度依次為94.0、84.8、88.8、93.2 μg/mL的混合對照品儲備液。其他質量濃度的混合對照品由50%甲醇稀釋對照品儲備液得到。
2.3.2 供試品溶液制備 取“2.1”項下樣品KD-生品15 mg置10 mL容量瓶中，精密稱定，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。
2.4 方法學考察
2.4.1 系統(tǒng)適用性實驗 按“2.2”項下色譜條件進行分析，4個成分理論塔板數(shù)均大于5 000，各色譜峰分離良好，分離度大于1.5。對照品溶液與供試品溶液色譜見圖1。
注：1.綠原酸；2.異綠原酸B；3.異綠原酸A；4.異綠原酸C。
2.4.2 檢測限與定量限 在色譜條件下，通過稀釋不同濃度的混合對照品儲備液得到各個化合物的檢測限與定量限。見表1。
2.4.3 線性和范圍考察 取混合對照品儲備液，逐步稀釋2倍，得到系列對照品溶液。精密吸取10 μL進樣并測定峰面積，以峰面積(Y)對分析物濃度(X)作線性回歸曲線，得到回歸方程和相關系數(shù)。見表1。
表1 款冬花中4種分析物的線性曲線、線性范圍及定量限和檢測限
2.4.4 精密度試驗 精密吸取同一份混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。4種化合物的RSD值范圍均在0.17%～1.75%，表明精密度良好。
2.4.5 重復性實驗 精密稱取KD-生品浸膏6份，按“2.3.2”制備成供試品溶液，測定峰面積，計算 4種咖啡?？鼘幩犷惓煞值暮浚浜縍SD范圍均在 0.47%～0.70%，表明方法重復性良好。
2.4.6 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一份供試品溶液10 μL，依次于0 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、24 h進樣，測定峰面積。4種化合物的RSD值范圍均在0.11%～0.40%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.4.7 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品15 mg，平行6份，分別精密加入一定量的混合對照品溶液(約1∶1)，按照“2.3.2”項下制備供試品溶液，依法進樣，計算回收率。見表2。
表2 加樣回收測定結果 (n=6)
2.5 樣品含量測定
分別精密稱取款冬花生品、蜜炙品及甘草汁制品浸膏，按“2.3.2”項制成供試品溶液，進樣，測定峰面積，計算含量。見表3、圖2。
表3 款冬花炮制后4種化合物的含量 (μg/mg)
圖2 款冬花炮制后咖啡?？鼘幩犷惢衔锟偤?/p>
3 討論
咖啡酰奎寧酸類化合物主要檢測方法有高效液相色譜法、超高效液相色譜及液質聯(lián)用色譜等[11]，其中HPLC簡便易得，可準確對款冬花中咖啡?？鼘幩犷惢衔镞M行定量鑒別。綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B及異綠原酸C為款冬花主要成分，其中三個異綠原酸成分為同分異構體，在加熱過程中會相互異構化[12]，這為含量檢測帶來了一定難度。為保證檢測結果準確性及樣品穩(wěn)定性，本次檢測方法選擇了先將款冬花提取物干燥，得到浸膏再進行檢測。
本研究結果表明，款冬花經(jīng)過炮制后，蜜炙品與甘草制品的4種咖啡?？鼘幩犷惢衔锖烤陀诳疃ㄉ?。從浸膏中4種成分總含量看，KD-生品(7.78%)、KD-蜜炙(4.03%)、KD-甘草(1.68%)，經(jīng)過炮制后，款冬花其他成分浸提量增加，而咖啡?？鼘幩犷惢衔餄舛冉档?。從藥材總含量看，款冬花蜜炙品總含量為生品的76%，甘草制品為生品的28.7%。因此，經(jīng)炮制后，款冬花蜜炙品與甘草制品的含量均有下降。尤其是甘草汁浸款冬花對該類成分的影響極大，這或許影響了款冬花的止咳活性。臨床也極少見到將款冬花經(jīng)甘草炮制用于止咳的應用。
隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的發(fā)展，款冬花傳統(tǒng)的炮制方法也得以改良。例如，劉效栓等[13]通過正交實驗法改良了款冬花蜜炙的用蜜含量和炒炙溫度；宋藝君等[14-15]優(yōu)化了蜜款冬花微波炮制工藝，以及甘草制款冬花的微波炮制工藝。本研究可進一步為款冬花的炮制工藝改良提供借鑒，今后還應結合款冬花的止咳藥效藥理研究，深入探索款冬花炮制原理及工藝優(yōu)化。
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吳琪珍
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款冬花中含有大量的咖啡酰奎寧酸類化合物，包括綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C等，研究[5]表明，這些化合物可顯著抑制小鼠咳嗽頻率，提高小鼠酚紅分泌水平及抗炎效果，具有良好的止咳化痰活性?？疃ǖ默F(xiàn)代炮制方法為蜜炙，蜜炙后可提高藥物療效，增強潤肺止咳效果[6]?，F(xiàn)代藥理研究[7]表明，款冬花生品與蜜炙品的水提物均有一定止咳作用。HPLC指紋圖譜分析研究[8]表明，綠原酸、異綠原酸A等10個化合物是款冬花生品與蜜炙品差異的主要標志物，基于NMR代謝組學技術的研究[9]發(fā)現(xiàn)，款冬花經(jīng)過蜜炙后，綠原酸、咖啡酸等有機酸的量有所降低。此外，款冬花古代也有甘草水浸的方法?？疃ń?jīng)甘草汁制后，總生物堿含量顯著減少，可降低毒性[10]。
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1 儀器與材料
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1.2 材料
對照品綠原酸(批號：J0120AS)、異綠原酸A(批號：D1018AS)、異綠原酸B(批號：J0202AS)、異綠原酸C(批號：M1123AS)均來自美倫生物技術有限公司，甲醇為色譜純(德國MERCK公司)，乙醇為分析純(西隴科學)。
款冬花中藥材購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學院吳琪珍鑒定為菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾。
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甘草制款冬花：取3 g甘草飲片，加水煎煮2次，合并煎液得30 mL，再加入凈款冬花50 g，浸潤24 h，烘箱60 ℃干燥，干燥后甘草制款冬花的成品為49.8 g。
2.1.2 款冬花浸膏制備 取款冬花生品20 g，加入6倍量體積70%乙醇，于60 ℃回流提取2 h，過濾后藥材繼續(xù)用5倍量體積70%乙醇回流提取1 h，重復2次，合并提取液，回收乙醇，水浴干燥，得到款冬花浸膏(KD-生品)。按同樣方法，制得蜜款冬花浸膏(KD-蜜炙)與甘草汁制款冬花浸膏(KD-甘草)。
2.2 色譜條件
色譜柱Welch Ultimate XB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；柱溫：25 ℃；流動相：0.1%甲酸(A)-甲醇(B)，流速0.8 mL/min；進樣量10 μL，梯度洗脫(0～8 min，85%～75% A；8～20 min，75%～70% A；20～21 min，70%～61% A；21～30 min，61%～60% A；30～35 min，60%～52% A；35～41 min，52% A；41～45 min，52%～40% A)，檢測波長326 nm。
2.3 溶液制備
2.3.1 對照品溶液制備 取綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B與異綠原酸C對照品適量，精密稱定，置同一容量瓶中，加入50%甲醇制成濃度依次為94.0、84.8、88.8、93.2 μg/mL的混合對照品儲備液。其他質量濃度的混合對照品由50%甲醇稀釋對照品儲備液得到。
2.3.2 供試品溶液制備 取“2.1”項下樣品KD-生品15 mg置10 mL容量瓶中，精密稱定，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。
2.4 方法學考察
2.4.1 系統(tǒng)適用性實驗 按“2.2”項下色譜條件進行分析，4個成分理論塔板數(shù)均大于5 000，各色譜峰分離良好，分離度大于1.5。對照品溶液與供試品溶液色譜見圖1。
注：1.綠原酸；2.異綠原酸B；3.異綠原酸A；4.異綠原酸C。
2.4.2 檢測限與定量限 在色譜條件下，通過稀釋不同濃度的混合對照品儲備液得到各個化合物的檢測限與定量限。見表1。
2.4.3 線性和范圍考察 取混合對照品儲備液，逐步稀釋2倍，得到系列對照品溶液。精密吸取10 μL進樣并測定峰面積，以峰面積(Y)對分析物濃度(X)作線性回歸曲線，得到回歸方程和相關系數(shù)。見表1。
表1 款冬花中4種分析物的線性曲線、線性范圍及定量限和檢測限
2.4.4 精密度試驗 精密吸取同一份混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。4種化合物的RSD值范圍均在0.17%～1.75%，表明精密度良好。
2.4.5 重復性實驗 精密稱取KD-生品浸膏6份，按“2.3.2”制備成供試品溶液，測定峰面積，計算 4種咖啡?？鼘幩犷惓煞值暮浚浜縍SD范圍均在 0.47%～0.70%，表明方法重復性良好。
2.4.6 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一份供試品溶液10 μL，依次于0 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、24 h進樣，測定峰面積。4種化合物的RSD值范圍均在0.11%～0.40%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.4.7 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品15 mg，平行6份，分別精密加入一定量的混合對照品溶液(約1∶1)，按照“2.3.2”項下制備供試品溶液，依法進樣，計算回收率。見表2。
表2 加樣回收測定結果 (n=6)
2.5 樣品含量測定
分別精密稱取款冬花生品、蜜炙品及甘草汁制品浸膏，按“2.3.2”項制成供試品溶液，進樣，測定峰面積，計算含量。見表3、圖2。
表3 款冬花炮制后4種化合物的含量 (μg/mg)
圖2 款冬花炮制后咖啡?？鼘幩犷惢衔锟偤?/p>
3 討論
咖啡酰奎寧酸類化合物主要檢測方法有高效液相色譜法、超高效液相色譜及液質聯(lián)用色譜等[11]，其中HPLC簡便易得，可準確對款冬花中咖啡?？鼘幩犷惢衔镞M行定量鑒別。綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B及異綠原酸C為款冬花主要成分，其中三個異綠原酸成分為同分異構體，在加熱過程中會相互異構化[12]，這為含量檢測帶來了一定難度。為保證檢測結果準確性及樣品穩(wěn)定性，本次檢測方法選擇了先將款冬花提取物干燥，得到浸膏再進行檢測。
本研究結果表明，款冬花經(jīng)過炮制后，蜜炙品與甘草制品的4種咖啡?？鼘幩犷惢衔锖烤陀诳疃ㄉ?。從浸膏中4種成分總含量看，KD-生品(7.78%)、KD-蜜炙(4.03%)、KD-甘草(1.68%)，經(jīng)過炮制后，款冬花其他成分浸提量增加，而咖啡?？鼘幩犷惢衔餄舛冉档?。從藥材總含量看，款冬花蜜炙品總含量為生品的76%，甘草制品為生品的28.7%。因此，經(jīng)炮制后，款冬花蜜炙品與甘草制品的含量均有下降。尤其是甘草汁浸款冬花對該類成分的影響極大，這或許影響了款冬花的止咳活性。臨床也極少見到將款冬花經(jīng)甘草炮制用于止咳的應用。
隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的發(fā)展，款冬花傳統(tǒng)的炮制方法也得以改良。例如，劉效栓等[13]通過正交實驗法改良了款冬花蜜炙的用蜜含量和炒炙溫度；宋藝君等[14-15]優(yōu)化了蜜款冬花微波炮制工藝，以及甘草制款冬花的微波炮制工藝。本研究可進一步為款冬花的炮制工藝改良提供借鑒，今后還應結合款冬花的止咳藥效藥理研究，深入探索款冬花炮制原理及工藝優(yōu)化。
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