劉利利，李 銀，周 英，劉穎新

(湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412012)

肝臟是人體重要的代謝器官，肝損傷是各種肝臟疾病的常見病理基礎(chǔ)，長期的肝損傷往往導(dǎo)致肝纖維化，嚴重時可導(dǎo)致肝硬化、肝癌，嚴重威脅人類的健康和生活質(zhì)量，因此研發(fā)高效保肝藥物具有十分重要的意義。

二至丸收載于2020年版《中華人民共和國藥典：一部》(以下簡稱《中國藥典》)，由酒女貞子及墨旱蓮2味藥組成，具有補益肝腎、滋陰止血之功效，臨床上用于治療肝腎陰虛、眩暈耳鳴、咽干鼻燥、腰膝酸痛、月經(jīng)量多等癥[1]。二至丸具有保肝作用[2-3]，但中藥復(fù)方成分較多，在質(zhì)量控制上存在一定問題，而探索成分配伍則可為中藥復(fù)方研究提供思路。本實驗采用CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型，結(jié)合均勻試驗設(shè)計，優(yōu)選二至丸有效成分配伍與劑量，并探討可能的作用機制，為二至丸的臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

SPF級昆明小鼠雄性100只，體質(zhì)量為(18.0±2.0)g，購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK(湘)2014-0011。小鼠常規(guī)喂養(yǎng)，自由飲水，實驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。特女貞苷(PS0331-0025MG)、蟛蜞菊內(nèi)酯(PS0649-0020MG)，純度>98%，購于成都普思生物科技股份有限公司；紅景天苷(GZDD-0170)，純度≥98%，購自貴州迪大科技有限公司；CCl4(20201109)為國產(chǎn)分析純，購于天津科貿(mào)化學(xué)試劑有限公司，臨用時用花生油配制成0.5% CCl4溶液；聯(lián)苯雙酯滴丸(200601)購于北京協(xié)和藥廠；ALT(20201209)、AST(20201204)、MDA(20201209)、SOD(20201209)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器

AE240型電子分析天平(METTLER TOLEDO公司)，全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher，Multiskan GO)，H1650臺式高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，超低溫冰箱(中科美菱低溫科技股份有限公司，DW-HL668)。

2 方法與結(jié)果

2.1 動物分組及給藥

根據(jù)2020年版《中國藥典》中二至丸用量的相關(guān)規(guī)定，結(jié)合3種活性成分在二至丸中的平均含量[4-5]，分別確定3個成分的劑量范圍為特女貞苷130～190 mg/kg、蟛蜞菊內(nèi)酯2～8 mg/kg、紅景天苷15～45 mg/kg。按照U7(74)均勻設(shè)計表安排實驗，得到均勻設(shè)計實驗方案，見表1。將實驗小鼠100只，隨機分為10組：空白對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯(陽性藥)組、二至丸有效成分均勻設(shè)計配伍7組，每組10只。二至丸有效成分各配伍組根據(jù)表2方案，按劑量配比均以生理鹽水為溶劑配制灌胃液，灌胃給藥；聯(lián)苯雙酯組灌胃給予聯(lián)苯雙酯150 mg·kg-1；空白對照組和模型組灌胃給予生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，模型組、聯(lián)苯雙酯組及二至丸有效成分配伍各劑量組一次性腹腔注射0.5% CCl4花生油溶液10 mL·kg-1，制作急性肝損傷模型，正常組腹腔注射等量花生油。造模后24 h，以小鼠摘眼球法取血，3 500 r/min離心5 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂zALT、AST。取血后脫頸處死小鼠，剖腹，取一小塊肝臟組織，加5 mL冷生理鹽水制成10%的肝勻漿，-80 ℃冰箱保存?zhèn)錅yMDA、SOD。

表1 因素水平

表2 有效成分配伍劑量 (mg·kg-1)

2.2 生化指標(biāo)檢測

按照試劑盒相應(yīng)的說明書操作步驟測定小鼠血清ALT、AST 水平；硫代巴比妥酸法測定肝組織勻漿中MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD 活力。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

表3 指標(biāo)評分

3 結(jié)果

3.1 對小鼠血清中ALT、AST的影響

各組小鼠ALT、AST水平見表4。由表4可知，與空白對照組相比，模型組血清ALT、AST水平明顯升高(P<0.01)，說明實驗造模成功。與模型組相比，二至丸有效成分各配伍組血清ALT、AST水平均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，表明二至丸有效成分各配伍組可以減輕CCl4所致小鼠急性肝損傷。

表4 有效成分配伍對CCl4肝損傷小鼠血清ALT、AST 活力的影響

3.2 二至丸保肝活性成分配比優(yōu)選

分別以ALT、AST綜合得分為指標(biāo)，經(jīng)二次多項式逐步回歸法對數(shù)據(jù)進行處理，經(jīng)二次多項式逐步回歸，得到回歸方程：Y=62.3+1.05×10-3X1-5.72×10-2X2X3(X1為特女貞苷，X2為蟛蜞菊內(nèi)酯，X3為紅景天苷)。方程經(jīng)調(diào)整后r=0.993 7，F(xiàn)=157.5，P<0.05，回歸方程顯著。此方程中各因素的最優(yōu)配比為：X1=190 mg·kg-1；X2=2 mg·kg-1；X3=15 mg·kg-1。

3.3 對小鼠肝臟MDA、SOD的影響

各組小鼠MDA與SOD活力見表5。由表5可知，模型組與空白對照組比較，肝臟MDA含量明顯增高，SOD水平明顯降低(P<0.01)，說明實驗造模成功。與模型組比較，二至丸有效成分各配伍組肝組織MDA含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)，SOD活力明顯增高(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果表明，二至丸保肝活性成分配伍可能具有一定的抗氧化作用。

表5 二至丸有效成分配伍對CCl4肝損傷小鼠肝臟MDA含量、SOD活性的影響

4 討論

(1)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型是常用的動物模型，重現(xiàn)性較好，其作用機制較復(fù)雜。一般認為，CCl4可誘導(dǎo)活性氧生成增多，使磷脂分子中的不飽和脂肪酸氧化生成過氧化脂質(zhì)，破壞細胞膜、細胞器膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而造成肝細胞損傷[7]。CCl4誘導(dǎo)肝細胞損傷后，細胞膜通透性增大或被破壞，使大量的ALT、AST釋放入血，此時血清中的ALT及AST的活性升高，因此ALT、AST是反映肝損傷的重要指標(biāo)[8]。

SOD是體內(nèi)普遍存在的一種抗氧化酶，可以清除超氧陰離子自由基，防止其他活性氧形成。當(dāng)CCl4誘導(dǎo)活性氧生成增多時，SOD因參與抗氧化而使其活性降低，抗氧化作用減弱，從而使質(zhì)膜發(fā)生過氧化，最終造成肝細胞損傷[9]。在活性氧促使磷脂分子中的不飽和脂肪酸氧化生成過氧化脂質(zhì)后，進一步分解可生成MDA等醛類物質(zhì)[10]。因此，SOD及MDA既可作為反映脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)，也是反映細胞損傷程度的指標(biāo)，SOD活性越小或MDA含量越高，說明肝損傷的情況越嚴重。

本實驗結(jié)果顯示，模型組與空白對照組比較，血清中ALT及AST活性顯著升高，肝臟中的SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明肝細胞出現(xiàn)明顯損傷，提示造模成功。

(2)關(guān)于特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯、紅景天苷對肝損傷的保護作用已有報道，但特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯、紅景天苷3種活性成分配伍后對肝損傷的保護作用未見報道。本次實驗應(yīng)用均勻?qū)嶒炘O(shè)計，對二至丸中特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯、紅景天苷3種成分配伍與劑量進行優(yōu)選。均勻設(shè)計法是一種應(yīng)用廣泛的實驗設(shè)計方法，可減少實驗次數(shù)，以回歸方程獲得理論上的最優(yōu)實驗方案[11-12]，從而得出最優(yōu)化的有效成分配伍與劑量，使實驗結(jié)果更加可靠，因此可對二至丸的臨床應(yīng)用提供參考。

研究結(jié)果顯示，與模型組比較，二至丸有效成分均勻設(shè)計配伍7組中小鼠的血清ALT與AST活性顯著降低，肝臟中SOD活性顯著升高、MDA含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，表明特女貞苷、蟛蜞菊內(nèi)酯、紅景天苷3種活性成分配伍對急性肝損傷具有明顯的保護作用。