劉慧蘭,趙愛國,侯安麗

[中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明) a.婦科;b.內(nèi)分泌科，深圳 518106]

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)分為自然絕經(jīng)和人工絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，是骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)中最常見的一種類型[1]。美國絕經(jīng)后婦女中30%患有PMOP，我國50歲以上婦女中超過50%發(fā)生PMOP[1]。PMOP最主要的并發(fā)癥是骨折和再發(fā)骨折的風(fēng)險增高。美國每年用于PMOP相關(guān)疾病的治療費(fèi)用高達(dá)130億美元[2]。國內(nèi)有研究顯示，PMOP致髖部骨折患者平均住院時間為35天，平均花費(fèi)為15737元[3]。同時婦科惡性腫瘤患者人工絕經(jīng)術(shù)后引發(fā)的低雌激素效應(yīng)，以及術(shù)后輔助性化療也可加重骨質(zhì)的流失[4]，由于該類患者增加等原因使PMOP的發(fā)病呈年輕化及驟增趨勢，進(jìn)一步增加了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松高發(fā)病率及其并發(fā)癥的高致殘率、高致死率，使PMOP成為我國醫(yī)療衛(wèi)生面臨的重大挑戰(zhàn)[5]。目前國內(nèi)外對雌激素下降所致的骨質(zhì)疏松癥常采用激素替代治療(hormone replacement therapy，HRT)。HRT雖然降低了骨質(zhì)疏松和骨折的危險性，但研究證實HRT是婦科惡性腫瘤術(shù)后發(fā)生發(fā)展的危險因素[6]，故術(shù)后引發(fā)的骨質(zhì)疏松癥，由于其用藥的局限性使得治療更是難中之難。本課題組前期實驗表明[7]，橄欖油可以延緩骨質(zhì)的流失，但作用成分及其療效尚不明確。本文在雌性SD大鼠PMOP模型上服用橄欖油中提取的橄欖苦苷，通過監(jiān)測動物骨密度變化、骨代謝指標(biāo)及子宮系數(shù)，明確橄欖苦苷不僅能延緩PMOP，而且不產(chǎn)生雌激素副作用，為防治PMOP開發(fā)天然藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗倫理 所有的實驗動物都經(jīng)過中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明)醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。動物手術(shù)均在5.2%氯胺酮腹腔注射麻醉下進(jìn)行。動物實驗管理依照實驗動物管理委員(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)會指導(dǎo)方案進(jìn)行。

1.2 實驗藥品 橄欖苦苷500g(藥編號32619-42-4)。己烯雌酚0.5mg片劑(藥編號H34021250)，5.2%氯胺酮(0.5mL/100g)。

1.3 實驗方法

1.3.1 PMOP動物模型的建立 將80只SD雌性大鼠在溫度18～25℃，濕度50%～60%的環(huán)境中飼養(yǎng)1周，在飼養(yǎng)的過程中沒有接觸過任何藥物[8]。飼養(yǎng)1周后,將80只SD大鼠分為假手術(shù)組(Sham,20例)，去勢組(OVX,60例)。假手術(shù)組SD大鼠接受雙側(cè)剖腹手術(shù)，去除卵巢周邊脂肪，但卵巢留在原位，OVX組SD大鼠通過腹側(cè)入路進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)[9]。

1.3.2 實驗動物的分組和藥物處理 將術(shù)后80只模型動物隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組,20例)，去勢組(OVX組,20例)，去勢+橄欖苦苷組(OVX+Oleuropein組,20例)，去勢+雌激素組(OVX+E2組,20例)；去勢+橄欖苦苷組和去勢+雌激素組除了分別每天以200μg橄欖苦苷和25μg/kg E2灌胃，其他飲食起居與Sham組和OVX組保持一致，連續(xù)飼養(yǎng)12周。

1.3.3 各組SD大鼠骨密度測量 采用變異系數(shù)<0.11%的高分辨率的雙能X光骨密度測量儀(DEXA,HOLOGIC Company,American)測量各組中SD大鼠的腰椎(L3，L4)和左股骨頸的骨密度。

1.3.4 各組中子宮的濕重 用5.2%胺碘酮麻醉各組SD大鼠，打開腹膜取出子宮，分離子宮周邊脂肪組織，計算各組子宮系數(shù)(子宮濕重/體重)，并進(jìn)行比較。

1.3.5 各組血清中OPG/RANKL 實驗12周后,各組SD大鼠拉頸處死，立即開胸，分別用5mL注射器抽取左心室血液，放于非抗凝管中，4℃ 3000r/min離心。用移液槍將血清吸出放于EP管中，-20℃保存，以備進(jìn)行血清學(xué)指標(biāo)的檢測，ELISA法檢測四組血清中OPG、RANKL含量。具體操作步驟按各試劑盒說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 SD大鼠飼養(yǎng)12周后各組骨密度的變化 各組SD大鼠飼養(yǎng)12周后，OVX組腰椎和左股骨的平均骨密度均低于其他三組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。OVX+橄欖苦苷組與OVX+E2及Sham組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明橄欖苦苷對維持骨密度有很好的效果(表1)。

表1 SD大鼠飼養(yǎng)3個月后各組腰椎及左股骨骨密度的變化

2.2 各組中子宮濕重與子宮系數(shù)的比較 與Sham組相比，OVX組和OVX+oleuropein組的子宮濕重和子宮系數(shù)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；OVX+E2和OVX+oleuropein組的子宮濕重和子宮系數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明橄欖苦苷不具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生的雌激素作用。見表2。

表2 各組中子宮濕重與子宮系數(shù)的比較

2.3 四組血清中OPG/RANKL含量的比較 與其他三組相比較，OVX組血清中OPG水平較低(P<0.05);與Sham組相比較，OVX+E2和OVX+oleuropein組中OPG水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但后兩組的OPG水平并無差異(P>0.05)。與OVX組相比，Sham、OVX+E2、OVX+oleuropein組血清中RANKL明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而OVX+oleuropein組與OVX+E2組相比，血清中RANKL含量更低(P<0.05)，見表3。

表3 四組中OPG/RANKL水平比較

3 討 論

橄欖苦苷是從天然橄欖油中提取出來的酚類化合物，屬于裂環(huán)烯醚萜類。研究表明，橄欖苦苷不僅能減少骨質(zhì)流失預(yù)防骨質(zhì)疏松[10]，而且還具有抗氧化、抗炎[11]、抗子宮內(nèi)膜癌的作用和抗乳腺癌特性[12]，同時能預(yù)防心血管疾病[13]。目前，使用橄欖苦苷預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，OVX+橄欖苦苷與OVX組相比，SD大鼠的腰椎及左股骨的骨密度明顯增加(P<0.05)，并且與OVX+E2及Sham組相比骨密度無差異(P>0.05)。表明橄欖苦苷能通過提高骨密度防止骨質(zhì)的流失。

對于骨骼系統(tǒng)，雌激素通過與雌激素受體結(jié)合來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖、分化、基質(zhì)沉積、礦化、機(jī)械應(yīng)力反應(yīng)和基質(zhì)蛋白合成。當(dāng)雌激素與成骨細(xì)胞中的雌激素受體結(jié)合時，成骨細(xì)胞會分泌膠原酶、細(xì)胞因子和生長因子來促進(jìn)骨形成。有研究[14]提出，雌激素受體β在MG63細(xì)胞破骨細(xì)胞分化過程中的基質(zhì)蛋白合成中起重要作用。雌激素水平在誘導(dǎo)絕經(jīng)后狀態(tài)下顯著降低，導(dǎo)致骨質(zhì)流失和骨質(zhì)疏松。橄欖苦苷和雌激素具有相同的芳香結(jié)構(gòu)，并具有拮抗作用，競爭性結(jié)合雌激素受體[15]。然而，橄欖苦苷是否具有與雌激素相同的作用尚不清楚。本研究表明，與OVX+E2組相比，OVX+oleuropein組的子宮濕重和子宮系數(shù)降低(P<0.05)；與OVX組相比，OVX+E2組的子宮濕重和子宮系數(shù)顯著增加(P<0.05)，OVX+橄欖苦苷組的子宮濕重和子宮系數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明橄欖苦苷不具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生的雌激素作用，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。骨質(zhì)疏松癥的特征是骨組織微結(jié)構(gòu)的減少和惡化，從而增加骨的脆弱性和骨折易感性，骨丟失主要是由于破骨細(xì)胞的數(shù)量增加和功能增強(qiáng)[16]。其中OPG、RNAK和RANKL在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的相互作用中起著重要作用。OPG和RANKL是腫瘤壞死因子受體家族的成員，RANKL與RANK結(jié)合，增加破骨細(xì)胞分化和活性，抑制破骨細(xì)胞凋亡[17]。OPG可以與RANKL結(jié)合，減少破骨細(xì)胞的激活[18]。本實驗顯示，與OVX組相比，OVX+oleuropein組血清中OPG水平明顯升高(P<0.05);而與OVX+E2組相比，OPG水平無顯著差異(P>0.05)；與OVX組相比，OVX+oleuropein血清中RANKL明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且與OVX+E2組相比，血清中RANKL含量也降低(P<0.05)。本研究結(jié)果顯示，橄欖苦苷可增加去勢SD大鼠血清中OPG表達(dá)，同時降低RANKL水平。表明橄欖苦苷可能通過調(diào)節(jié)OPG及RANKL的水平來防止骨的吸收，從而達(dá)到防治骨質(zhì)疏松，但更深入的機(jī)制還有待后續(xù)的實驗研究進(jìn)一步證明。

綜上，橄欖苦苷可通過增加絕經(jīng)后骨密度延緩骨質(zhì)疏松，無雌激素副作用，是一種很有前途的治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物。但其作用機(jī)制尚未完全闡明，有待于進(jìn)一步探索。