夏愛華 徐平 高添藝 姜邦蓉 潘雪華 李劍蘭

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種由母體、胎兒和環(huán)境因素引起的妊娠期特有的多因素疾病，其臨床特征表現(xiàn)為妊娠20周后新發(fā)異常的高血壓（≥140/90 mmHg）和蛋白尿（≥300 mg/24 h）。研究顯示，滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)不充分和螺旋動(dòng)脈重塑失敗所致胎盤化不足是PE發(fā)病的關(guān)鍵因素[1]。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）通路與細(xì)胞增殖、遷移密切相關(guān)，抑制PI3K/Akt通路活性可導(dǎo)致胎盤絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層和合胞滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力受限而誘發(fā)PE[2]。第10號(hào)染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）基因是一個(gè)腫瘤抑制基因，可負(fù)調(diào)控PI3K/Akt通路抑制癌細(xì)胞增殖，同時(shí)，PTEN基因的轉(zhuǎn)錄后水平也受多種microRNA（miRNA）調(diào)控[3]。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-23c在PE患者和健康者之間存在差異表達(dá)，經(jīng)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-23c可與PTEN 3'UTR結(jié)合，提示miR-23c可能通過(guò)調(diào)控PTEN/Akt通路參與PE進(jìn)程。故本研究選取滋養(yǎng)層HTR8/SVneo細(xì)胞為研究對(duì)象，探討miR-23c對(duì)PTEN/Akt通路的調(diào)控機(jī)制以及對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，以期進(jìn)一步揭示PE發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2019年4月至2020年8月在北海市人民醫(yī)院行常規(guī)產(chǎn)前檢查的孕婦70例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕婦臨床資料完整；（2）年齡 20～35 歲；（3）單胎妊娠的初產(chǎn)婦。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）多胎妊娠；（2）合并自身免疫性疾病、肝腎臟疾病、糖尿病、原發(fā)性高血壓及精神疾病者；（3）胎兒為試管嬰兒；（4）醫(yī)學(xué)或非醫(yī)學(xué)妊娠丟失；（5）中途退出研究。其中PE者35例（PE組），年齡（29.71±3.05）歲；正常者 35例（正常組），年齡（28.83±2.74）歲。兩組對(duì)象年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），均于分娩前抽取靜脈血3 ml，于分娩后留取胎盤組織進(jìn)行研究。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，兩組對(duì)象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要材料和試劑 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/SVneo細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS購(gòu)自美國(guó) Gibco公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Realtime PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；Opti-MEM、Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；Transwell小室、Matrigel Matrix 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó) BD 公司；Akt、p-Akt、PTEN、βactin、羊抗兔二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；pmirGLO載體、PTEN 3'UTR-WT及 MUT、miR-23c模擬物（miR-23c mimic）及陰性對(duì)照（mimic-NC）、miR-23c抑制物（miR-23c inhibitor）及陰性對(duì)照（inhibitor-NC）購(gòu)自上海生工生物公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTR8/SVneo細(xì)胞接種于6孔板，1×105個(gè)/孔。次日待細(xì)胞融合度達(dá)60%～70%時(shí)，采用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分為Blank control組、mimic-NC組、miR-23c mimic組、inhibitor-NC組和miR-23c inhibitor組，共5組，Blank control組不做轉(zhuǎn)染處理，其余組分別轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)miR-23c模擬物或抑制物或其陰性對(duì)照。

1.2.3 miR-23c、PTEN mRNA、Akt mRNA 表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法。參照TRIzol抽提試劑盒說(shuō)明書，分別從血清、胎盤組織及處理的HTR8/SVneo細(xì)胞樣品中提取總RNA，依據(jù)相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA，并以此作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，U6為miRNA內(nèi)參，β-actin作為mRNA內(nèi)參；PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)；結(jié)果按2-ΔΔCt計(jì)算各mRNA相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物由華大基因合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 Akt、PTEN蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。RIPA裂解經(jīng)相應(yīng)處理的HTR8/SVneo細(xì)胞提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，蛋白變性后取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，于微量震蕩儀上輕輕震蕩，以5%脫脂奶粉TBST室溫下封閉2 h。分別孵育相應(yīng)Akt、p-Akt和PTEN蛋白及β-actin蛋白一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST振搖洗膜5 min×6次，孵育羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫1 h，TBST振搖洗膜5 min×6次。ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色后機(jī)器掃描存盤，以Image軟件進(jìn)行條帶分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用CCK-8法。按實(shí)驗(yàn)分組分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24 h，胰酶消化各組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為 4×104/ml，分別吸取 100 μl細(xì)胞懸液接種于96孔板，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)后48 h檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔添加10 μl CCK-8溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2h，用酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）。

1.2.6 細(xì)胞遷移情況檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板（4×105個(gè)/孔）正常培養(yǎng)，細(xì)胞融合約90%時(shí)，按實(shí)驗(yàn)分組分別轉(zhuǎn)染miR-23c模擬物或抑制物及其陰性對(duì)照。用200 μl滅菌槍頭垂直于孔底劃痕，PBS漂洗至劃痕處無(wú)細(xì)胞殘留，于倒置顯微鏡下拍照，后將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，24 h后再次拍照，分析細(xì)胞遷移情況，細(xì)胞遷移率=（T0h面積-T24h面積）/T0h面積×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 細(xì)胞侵襲情況檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。取100 μl稀釋好的基質(zhì)膠鋪于Transwell小室上表面，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中放置6 h。轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為1×105/ml，分別取200 μl細(xì)胞懸液于上室，下室加600 μl完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，用棉簽輕輕拭去小室上層未浸潤(rùn)過(guò)底膜的細(xì)胞和基質(zhì)膠。4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色，至于倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞。

1.2.8 miR-23c對(duì)PTEN靶向作用驗(yàn)證 采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。將HTR8/SVneo細(xì)胞用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將野生型的PTEN基因3'UTR（PTEN 3'-UTR WT）及其突變體（PTEN 3'-UTR MUT）構(gòu)建到pmirGLO載體中，獲得pmirGLO-WT和pmirGLO-MUT，不含任何外源片段的空載體作為陰性對(duì)照。pmirGLO載體的螢火蟲熒光素酶luc2作為主要報(bào)告基因，海參熒光素酶hRluc-neo為對(duì)照?qǐng)?bào)告基因，按照Lipofectamine 3000脂質(zhì)體說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將miR-23c mimic分別與pmirGLO-WT和pmirGLO-MUT轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，同時(shí)以mimic-NC作為對(duì)照。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)12 h，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性，以海參熒光素酶hRluc-neo的活性作為校正報(bào)告基因。

2 結(jié)果

2.1 PE組與正常組血清、胎盤組織中miR-23c表達(dá)水平比較 與正常組相比，PE組血清及胎盤組織中miR-23c表達(dá)水平均顯著降低（均P＜0.05），見表2。

表2 PE組與正常組血清、胎盤組織中miR-23c表達(dá)水平比較

2.2 各組細(xì)胞miR-23c表達(dá)水平比較 與Blank control組相比，miR-23c mimic組miR-23c表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），miR-23c inhibitor組 miR-23c表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Blank control組與 mimic-NC組、inhibitor-NC組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表 3。

2.3 各組細(xì)胞活性、侵襲數(shù)及遷移率比較 與Blank control組相比，miR-23c mimic組細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05），侵襲數(shù)顯著增加（P＜0.05），遷移率顯著升高（P＜0.05）；而 miR-23c inhibitor組細(xì)胞活性顯著減弱（P＜0.05），侵襲數(shù)顯著減少（P＜0.05），遷移率顯著降低（P＜0.05）。Blank control組與mimic-NC組、inhibitor-NC組細(xì)胞活性、侵襲數(shù)及遷移率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P ＞0.05），見表 4、圖 1-2。

表4 各組細(xì)胞活性、侵襲數(shù)及遷移率比較

圖1 各組細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)所見（×100）

圖2 各組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)所見（×40）

2.4 各組細(xì)胞PTEN、Akt mRNA和蛋白表達(dá)水平比較與Blank control組相比，miR-23c mimic組p-Akt/Akt水平顯著升高（P＜0.05），PTEN mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低（均 P＜0.05）；miR-23c inhibitor組 p-Akt/Akt水平顯著降低（P＜0.05），PTEN mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高（均P＜0.05）。Blank control組與mimic-NC組、inhibitor-NC組p-Akt/Akt水平及PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），各組Akt mRNA和蛋白表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表5、圖3。

圖3 各組細(xì)胞磷酸酶與張力蛋白同源物（PTEN）、蛋白激酶B（Akt）蛋白表達(dá)電泳圖

表5 各組細(xì)胞PTEN、Akt mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

2.5 miR-23c對(duì)PTEN的靶向作用 在轉(zhuǎn)染pmirGLOWT質(zhì)粒的細(xì)胞中，與mimic-NC相比，miR-23c mimic顯著降低了熒光素酶活性（P＜0.05）；在轉(zhuǎn)染pmirGLOMUT質(zhì)粒及空載質(zhì)粒的細(xì)胞中，miR-23c mimic與mimic-NC均未明顯降低熒光素酶活性（均P＞0.05），表明miR-23c可以靶向PTEN 3'-UTR并降低PTEN基因的表達(dá)，見圖4。

圖4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（PTEN為磷酸酶和張力蛋白同源物；*P＜0.05）

3 討論

PE是一種妊娠期特有的疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前研究表明妊娠時(shí)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)不足是誘導(dǎo)PE的關(guān)鍵因素。滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入動(dòng)脈壁異常，導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈由小直徑向大直徑血管轉(zhuǎn)換受阻，進(jìn)而導(dǎo)致胎盤血流灌注不足誘發(fā)PE；正常妊娠時(shí)，滋養(yǎng)層細(xì)胞不僅侵襲蛻膜，還侵襲肌肉層參與胎盤形成，滋養(yǎng)層細(xì)胞缺失和浸潤(rùn)不足導(dǎo)致胎盤淺埋也是PE發(fā)病的關(guān)鍵，表明滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖侵襲和遷移在PE的發(fā)病過(guò)程中至關(guān)重要[1]。滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲受到多種因素影響，目前尚未清楚確切分子機(jī)制。研究表明，miRNA通過(guò)影響滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲參與PE的發(fā)病過(guò)程[4]。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PE患者血清和胎盤組織中miR-23c異常低表達(dá)，推測(cè)其可能在PE發(fā)病機(jī)制中起重要作用。故本研究在人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/SVneo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-23c模擬物和抑制物，探討miR-23c對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響及調(diào)控機(jī)制。

miRNA是一種豐富的內(nèi)源性非編碼類RNA小分子，含18～25個(gè)核苷酸，它們通過(guò)靶向mRNA發(fā)揮降解和翻譯抑制作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA在不同的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)展和干細(xì)胞分裂等，研究表明miRNA在許多人類疾病中異常表達(dá)，與疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。miR-23c最早發(fā)現(xiàn)于結(jié)直腸癌組織且呈高表達(dá)狀態(tài)[6]，可抑制肝細(xì)胞癌的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]，過(guò)表達(dá)miR-23c抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與其下調(diào)異粘蛋白（metadherin，MTDH）表達(dá)有關(guān)[7]。miR-23c還可能通過(guò)靶向基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α） 抑制血管生成，調(diào)節(jié)傷口愈合[8]。上述研究表明miR-23c在細(xì)胞增殖、侵襲等過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究將miR-23c mimic和miR-23c inhibitor分別轉(zhuǎn)染HTR8/SVneo細(xì)胞，檢測(cè)miR-23c對(duì)細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移的影響，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-23c能增強(qiáng)細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移，而抑制miR-23c表達(dá)后，細(xì)胞活性、侵襲及遷移能力均顯著下降，表明miR-23c具有促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移的作用。

PTEN作為一個(gè)重要的腫瘤抑制因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡和侵襲等過(guò)程。PTEN通過(guò)其磷酸肌醇磷酸酶活性將磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate,PIP3）去磷酸化為磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2）來(lái)拮抗PI3K活性，進(jìn)而阻礙下游的Akt磷酸化，發(fā)揮拮抗PI3K/Akt信號(hào)通路的作用[3]。PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)維持細(xì)胞基本過(guò)程、細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、死亡和代謝的完整性至關(guān)重要[9]。研究發(fā)現(xiàn)，激活滋養(yǎng)層細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路后，細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)，抑制劑LY294002抑制PI3K活性，可導(dǎo)致HTR8/SVneo細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力減弱[2，10]。這表明PI3K/Akt通路參與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲，在PE中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21 inhibitor通過(guò)增加PTEN的表達(dá)，進(jìn)而降低p-Akt的水平，抑制成纖維細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡[11]。薛平平等[12]研究發(fā)現(xiàn)，重度PE患者胎盤組織中PTEN表達(dá)顯著升高，且PTEN通過(guò)下調(diào)Akt活性降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和 MMP-9表達(dá)而抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移。上述研究表明PTEN蛋白調(diào)節(jié)的Akt磷酸化水平在滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究中，HTR8/SVneo細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-23c時(shí)，細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)下調(diào)，p-Akt/Akt水平顯著上調(diào)，細(xì)胞增殖、遷移能力顯著增強(qiáng)；相反，抑制miR-23c表達(dá)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)上調(diào)，p-Akt/Akt水平下調(diào)，細(xì)胞增殖、遷移能力顯著降低，表明miR-23c通過(guò)抑制PTEN表達(dá)促進(jìn)Akt發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活PI3K/Akt通路增強(qiáng)HTR8/SVneo細(xì)胞的增殖、遷移能力。

既往研究發(fā)現(xiàn)miR-221和miR-26a均可靶向PTEN基因，抑制其表達(dá)，增強(qiáng)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖[13-14]。Li等[15]進(jìn)行微陣列分析發(fā)現(xiàn)PTEN基因是miR-23c潛在的靶點(diǎn)。為進(jìn)一步確認(rèn)HTR8/SVneo細(xì)胞中miR-23c與PTEN基因是否存在確切的結(jié)合活性，本研究預(yù)測(cè)并設(shè)計(jì)PTEN基因3'-UTR的野生型序列及其突變體，分別與miR-23c mimc共轉(zhuǎn)染到HTR8/SVneo細(xì)胞中，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-23c對(duì)PTEN基因的靶向作用。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pmirGLO-WT質(zhì)粒的細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低，而轉(zhuǎn)染pmirGLOMUT質(zhì)粒與空載質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著差異，均不能明顯降低熒光素酶活性，證實(shí)miR-23c可以靶向PTEN 3'-UTR并降低其表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-23c通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)，激活PI3K/Akt信號(hào)通路活性，進(jìn)而促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，表明miR-23c參與調(diào)控PE的發(fā)病機(jī)制，并在滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)異常而導(dǎo)致的胎盤化不足機(jī)制中發(fā)揮有益作用。這進(jìn)一步揭示了PE的發(fā)病機(jī)制，提示miR-23c有望成為PE診斷或治療的靶標(biāo)，值得進(jìn)一步研究。