黃新新，李佳豪，李曉斌，李宏坤，賈怡琪，馬利鑫，李 超，賀林嬌

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】妊娠是復雜的持續(xù)性生理應(yīng)激過程，母體內(nèi)激素、免疫以及代謝等會發(fā)生明顯變化，且會出現(xiàn)低水平炎癥反應(yīng)以及胰島素抵抗現(xiàn)象[1-2]，導致妊娠期并發(fā)癥的產(chǎn)生。增加孕期腸道菌群多樣性，維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)對于緩解和治療孕期綜合癥具有一定的意義?！厩叭搜芯窟M展】腸道菌群穩(wěn)態(tài)對于調(diào)控免疫、代謝等病理生理過程發(fā)揮重要作用，在妊娠期生理狀態(tài)發(fā)生適應(yīng)性重構(gòu)過程中扮演重要角色[3-4]。腸道菌群失調(diào)是導致妊娠期并發(fā)癥產(chǎn)生的因素之一[5]。而益生菌在防治妊娠期并發(fā)癥的過程中存在一定潛力[6]。馬寧等[7]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌對妊娠母畜的繁殖性能及胎兒的生長性能有促進功能，且益生菌還有助于調(diào)節(jié)妊娠母體的妊娠期糖尿病。Asemi Z等[8]研究顯示，益生菌通過調(diào)節(jié)血糖水平能抑制孕晚期胰島素濃度上升，減緩胰島素抵抗癥狀。Yeganegi M等[9]研究顯示，鼠李糖乳桿菌上清液GR-1可調(diào)節(jié)胎盤LPS的表達量，對孕期炎癥癥狀有減輕作用?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關(guān)于益生菌對于妊娠母畜的研究主要集中在益生菌對母畜妊娠期疾病的影響，而針對益生菌對妊娠母畜腸道菌群的研究鮮見。而LGG具有調(diào)控腸道菌群、改變腸道環(huán)境和提高機體免疫能力等生物學作用[10]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以孕期小鼠為研究對象，分別為對照組和試驗組。在相同的飼養(yǎng)條件和日糧營養(yǎng)水平下，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上灌喂0.5 mL含有0.125 g鼠李糖乳桿菌的滅菌生理鹽水，試驗期21 d。在整個妊娠通過灌喂鼠李糖乳桿菌探究其對妊娠小鼠糞便菌群多樣性和豐度的影響，為鼠李糖乳桿菌在整個妊娠周期的應(yīng)用提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗選擇體重相近(23.33±1.55) g，配種日期相同的昆明妊娠小白鼠30只，采購于新疆醫(yī)科大學。

鼠李糖乳桿菌購自西安萬方生物科技有限公司，活菌數(shù)為1×1010CFU/g。

1.2 方 法

1.2.1試驗設(shè)計

將30只妊娠小鼠隨機分為2組，每組15只，分別為對照組和試驗組。在相同的飼養(yǎng)條件和日糧營養(yǎng)水平下，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組小鼠在飼喂基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上灌喂0.5 mL含有0.125 g鼠李糖乳桿菌的滅菌生理鹽水，在09:00進行灌喂。試驗期間每3只小鼠為一籠飼養(yǎng)，每組5個重復，隔天換墊料。試驗進行至小鼠臨產(chǎn)前，直腸采集小鼠糞便樣品。表1

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平(以風干物質(zhì)計，%)Table 1 Composition and nutrient levels of diet (Air-dry basis,%)

1.2.2 樣品采集

根據(jù)配種日期，臨產(chǎn)前1 d，直腸采集小鼠糞便樣品，同一組3只小鼠的樣品合為1個樣品，分裝于無RNA的凍存管內(nèi)，液氮冷凍保存。

1.2.3 指標測定

總DNA提取、PCR擴增及Illumina HiSeq測序及結(jié)果分析均委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司協(xié)助完成。最終結(jié)果以稀釋后的基因組DNA為模板，使用16S rDNA的V4區(qū)特異引物515F和806R進行PCR擴增。

515F：5’-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’

806R：5’-GCCAATGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’

1.3 數(shù)據(jù)處理

在Excel中先將數(shù)據(jù)進行預處理，在使用SPSS 18.0軟件進行獨立樣本T檢驗分析，試驗結(jié)果均以平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌喂鼠李糖乳桿菌對妊娠小鼠糞便中菌群ɑ多樣性的影響

研究表明，妊娠小鼠糞便中菌群α多樣性指數(shù)顯示對照組與試驗組之間差異均不顯著(P>0.05)，但試驗組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別比對照組降低了13.27%(P>0.05)、6.25%(P>0.05)。以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs，共得到810個OTUs，對照組385個，試驗組425個，共有OTUs 304個，特有的對照組71個，試驗組111個。表2

表2 糞便菌群α-多樣性Table 2 Fecal flora α-diversity

2.2 灌喂鼠李糖乳桿菌對妊娠小鼠糞便中門水平物種豐度的影響

研究表明，在門水平上top 9的物種如下，妊娠小鼠糞便中的菌門分別為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、unidentified_Bacteria、軟壁菌門、脫鐵桿菌門、藍細菌、酸桿菌門，其中厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門的豐度之和在90%以上。小鼠糞便中厚壁菌門，試驗組比對照組提高了20.12%(P<0.05)；但擬桿菌菌門和變形菌門試驗組分別比對照組降低了21.95%(P<0.05)、26.15%(P<0.05)。表3

表3 門水平物種的豐度變化Table 3 Abundance of phylum level species (%)

2.3 灌喂鼠李糖乳桿菌對妊娠小鼠糞便中科水平物種豐度的影響

研究表明，在科水平上top 9的物種如下。在科水平上，妊娠小鼠糞便中的物種分別為毛螺菌科、Muribaculaceae、乳酸細菌科、韋榮球菌科、不明梭菌屬、脫硫弧菌科、理研菌科、普雷沃氏菌科。毛螺菌科、乳酸細菌科和韋榮球菌科試驗組顯著高于對照組(P<0.05)，其中毛螺菌科和乳酸細菌科試驗組分別比對照組提高了23.57%(P<0.05)和50.24%(P<0.05)。其它科水平的物種試驗組與對照組之間差異不顯著(P>0.05)，但Muribaculaceae試驗組比對照組降低了6.64%(P>0.05)。表4

表4 科水平物種的豐度變化Table 4 Abundance of family level species (%)

2.4 灌喂鼠李糖乳桿菌對妊娠小鼠糞便屬水平菌群豐度的影響

研究表明，在屬水平上top 9的物種如下，妊娠小鼠糞便中的物種分別為乳酸桿菌屬、未確定毛螺菌科屬、Candidatus_Arthromitus、Ileibacterium、Lachnoclostridium、Faecalibaculum、脫硫弧菌屬、Turicibacter、Alistipes、羅氏菌屬。乳酸桿菌屬、Lachnoclostridium與未確定毛螺菌科屬試驗組顯著高于對照組(P<0.05)，其中乳酸桿菌屬與Lachnoclostridium試驗組分別比對照組提高了50.05%(P<0.05)、46.62%(P<0.05)。其它屬水平的物種試驗組與對照組之間差異不顯著(P>0.05)，但Candidatus_Arthromitus和Turicibacter試驗組分別比對照組降低了20.34%(P>0.05)和12.86%(P>0.05)。表5

表5 屬水平物種的豐度變化Table 5 Abundance of species of genus level (%)

2.5 LEfSe

研究表明，在屬和種水平上對照組有差異的菌分別是Candidatus_Arthromitus和unidentified-Clostridiales。圖1

2.6 主坐標分子

研究表明，圖中PC1為第一主坐標，對檢測到的總細菌的代表性貢獻率為53.88%，PC2位第二主坐標，貢獻率為21.60%。圖2

3 討 論

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnoides，LGG)屬于乳桿菌屬、鼠李糖乳桿菌種，為革蘭陽性兼性厭氧菌，是目前為止研究最廣的益生菌[11]。鼠李糖乳酸桿菌在調(diào)控腸道菌群和提高機體的免疫等方面有顯著作用[12]。妊娠期營養(yǎng)代謝需求增加，激素分泌水平改變，胃腸道發(fā)生系列重構(gòu)，腸道菌群組成也發(fā)生適應(yīng)性改變，來調(diào)控血糖穩(wěn)態(tài)、胰島素敏感性[13-15]。菌群失調(diào)刺激先天免疫系統(tǒng)，激活Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)和NOD樣受體(NOD-likereceptors，NLRs)，刺激腸上皮細胞或免疫細胞，促進腸道炎癥反應(yīng)發(fā)生[16]，炎癥遞質(zhì)破壞腸道屏障，腸腔滲透性增加，使腸道處于輕度慢性炎癥狀態(tài)，是導致孕期并發(fā)癥產(chǎn)生的原因之一。

妊娠期代謝機能發(fā)生變化，腸道菌群的構(gòu)成和豐度也隨之改變[17]。GOHIR等[18]發(fā)現(xiàn)正常飲食條件下，小鼠孕期某些優(yōu)勢菌豐度顯著增高，擬桿菌門相對豐度在整個孕期高于未孕鼠，雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)豐度在孕早期達頂峰，后逐漸下降至豐度與未孕鼠相似，艾克曼菌(Akkermansia)孕早期較為豐富，孕中晚期豐度下降。試驗結(jié)果顯示，在孕后期，門水平豐度較高的菌分別是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、unidentified-Bacteria、軟壁菌門、脫鐵桿菌門、藍細菌門和酸桿菌門。對照組和試驗組厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的豐度之和分別是96.95%和97.16%。其中試驗組厚壁菌門豐度顯著高于對照組(P<0.05)，而擬桿菌門和變形菌門豐度菌顯著低于對照組(P<0.05)。鼠李糖乳桿菌能夠提高妊娠后期小鼠糞便厚壁菌門的豐度。由于厚壁菌門豐度與擬桿菌門豐度呈一定比例關(guān)系[19]，使得試驗中試驗組擬桿菌門顯著低于對照組的原因。同時糞便中大多數(shù)的有益菌隸屬于厚壁菌門和擬桿菌門[20-21]，在試驗中試驗組厚壁菌門和擬桿菌門豐度升高可能是試驗組變形菌門豐度降低的原因，鼠李糖乳桿菌能夠抑制腸道中有害菌的增殖，提高有益菌的豐度[22]。劉月靜[23]研究結(jié)果顯示，給正常雌性小鼠喂食鼠李糖乳桿菌菌液，在第0 d、第16 d和第24 d擬桿菌門逐漸增多；厚壁菌門先增多后減少，但整體比0 d時減少；而變形桿菌門逐漸減少。與試驗結(jié)果有差異的原因，一方面試驗僅采集妊娠后期小鼠的糞便，未對妊娠初期糞便菌群豐度做研究，無法判斷菌群豐度前后變化的規(guī)律；另一方面由于試驗小鼠處于妊娠期，所以可能是導致與劉靜月[23]研究結(jié)果差異的原因。

在科水平試驗組毛螺菌科、乳酸細菌科和韋榮球菌科豐度均顯著高于對照組(P<0.05)。在屬水平，乳酸桿菌屬、Unidentified_Lachnospiraceae屬和Lachnoclostridium試驗組顯著高于對照組(P<0.05)。郭佳汶等[24]研究結(jié)果顯示，給雄性小鼠補喂LGG，第4周LGG組的優(yōu)勢物種為Akkermansia屬(16.31%)、Lactobacillus屬(11.24%)Unidentifified_Lachnospiraceae屬(6.64%)。與試驗結(jié)果檢測到的優(yōu)勢菌有差異主要可能與飼養(yǎng)管理、性別等有關(guān)。

在試驗結(jié)束時小鼠糞便中Shannon、Simpson、Chao1和ACE試驗組和對照組均無顯著性變化(P>0.05)。郭佳汶等[24]研究結(jié)果顯示，給雄性小鼠補喂LGG，試驗第1周Shannon、Simpson、Chao1和ACE分別為2.02、0.60、366.06和385.76，試驗第4周分別為5.17、0.93、283.28和281.63，隨著試驗的進行Shannon和Simpson在升高，而Chao1和ACE指數(shù)在降低，LGG對小鼠糞便菌群多樣性具有一定影響。

4 結(jié) 論

灌喂鼠李糖乳桿菌對小鼠糞便菌群多樣性無顯著性影響。在門水平上，厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的豐度之和在90%以上，厚壁菌門試驗組顯著高于對照組(P<0.05)，但擬桿菌菌門和變形菌門試驗組分別比對照組降低了21.95%(P<0.05)、26.15%。在科水平上，毛螺菌科、乳酸細菌科和韋榮球菌科試驗組顯著高于對照組。在屬水平上，乳酸桿菌屬、未確定毛螺菌科屬與Lachnoclostridium試驗組顯著高于對照組。給妊娠期小鼠灌喂鼠李糖乳桿菌，對小鼠糞便菌群多樣性無顯著性影響，但可以提高小鼠腸道細菌物種豐度，對厚壁菌門、毛螺菌科、乳酸細菌科、韋榮球菌科、乳酸桿菌屬、未確定毛螺菌科屬和Lachnoclostridium豐度具有顯著性影響。