唐雙陽 丁 霜 申海艷 伍虹蓉 胡 煜 廖雅琪 熊雨棱 李 樂

1（南華大學病原生物學研究所 特殊病原體防控湖南省重點實驗室 衡陽 421001）

2（南華大學公共衛(wèi)生學院 衡陽 421001）

3（南華大學衡陽醫(yī)學院 衡陽 421001）

電離輻射能通過多種信號轉導通路引發(fā)細胞損傷，促進細胞凋亡［1］。有研究報道，凋亡是放射線導致腫瘤細胞死亡的主要方式之一［2］，腫瘤細胞對輻射的敏感性主要取決于輻射后細胞內的DNA損傷修復水平和輻射引發(fā)的信號轉導機制，從而導致凋亡相關基因表達、細胞凋亡及細胞周期進程的改變。

人死亡結構域相關蛋白（hDaxx）是一種高度保守的多功能蛋白，能使受損DNA無法修復而使細胞發(fā)生凋亡［3-4］，從而可能促進放射治療后腫瘤細胞的凋亡。細胞凋亡是由Caspase-8誘導的一種“細胞自殺程序”，Caspase-8不會引起組織損傷，是死亡受體介導的凋亡途徑的關鍵啟動子。Daxx在影響細胞凋亡的作用機制方面尚未完全明確。Daxx作為HIF-1a/HDAC1/Slug軸介導癌細胞浸潤的抑制子，有可能成為抑制癌癥轉移的一個潛在的治療靶點［5］。

課題組前期研究表明，Daxx高表達可下調宮頸癌HeLa細胞中HPV16E6蛋白對Caspase-8的抑制作用，從而促進凋亡［6］。本研究選用HeLa細胞為研究對象，通過研究過表達Daxx對經γ射線照射細胞的凋亡的影響，探討Daxx與輻射誘導細胞凋亡之間的關系及其機制，為開辟宮頸癌放射治療新途徑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

真核表達載體pcDNA3.1（+）/Daxx以及pcDNA3.1（+）-C1空載體由南華大學病原生物學研究所提供；改良eagle培養(yǎng)基（DMEM）購自Gibco公司（USA）；MTT，LipofectamineTM2000購于Invitrogen公司（USA）；鼠抗人Daxx單克隆抗體購自Santa Cruz公司（USA）；Hoechst33342、Caspase-8活性測定試劑盒購自北京Solarbio公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海聯科生物公司。

1.2 細胞及細胞轉染

人宮頸癌HeLa細胞株由南華大學病原生物學研究所提供。取對數生長期宮頸癌HeLa細胞，分別接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，次日細胞生長至約75%時，將pcDNA3.1（+）/Daxx真核表達載體按照脂質體轉染方法轉染HeLa細胞，同時設pcDNA3.1（+）-C1空載體陰性轉染組，加入含1%青霉素和1%鏈霉素的無血清細胞培養(yǎng)基，5%CO2、37℃培養(yǎng)6h，然后更換成含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。通過轉染將HeLa細胞分為正常對照組（NC組）、空質粒轉染陰性對照組（Mock組）與Daxx真核表達載體轉染組（Daxx組）。

1.3 電離輻射

使用137Cs γ射線生物細胞輻照儀照射細胞，劑量率為321cGy/min，劑量分別為0Gy、2Gy、4Gy和8Gy，照后培養(yǎng)0h、6h、12h和24h觀察細胞形態(tài)。

1.4 Western blot檢測Daxx蛋白表達

轉染細胞培養(yǎng)24h后，分別給予0Gy、2Gy、4Gy、8Gy γ射線照射，12h后收獲細胞，細胞裂解，BCA法測定蛋白濃度，上樣20μg蛋白行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用凝膠成像系統拍照掃描顯色條帶，使用ImageJ灰度掃描軟件分析光密度值，檢測Daxx蛋白表達水平。

1.5 MTT檢測細胞增殖

細胞培養(yǎng)24h后，給予4Gy γ射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)8h后棄上清液，每孔加200μL無血清培養(yǎng)基及20μL MTT，37℃孵育4h后棄上清液，每孔加入200μL二甲基亞砜，置渦旋振蕩器上振蕩裂解10min，使藍色結晶溶解，酶標儀測定450nm吸光度值，計算細胞增殖抑制率（PI率），檢測Daxx過表達對輻照后宮頸癌細胞增殖的影響。

1.6 ELISA檢測Caspase-8相對活性

細胞培養(yǎng)24h后，給予4Gy γ射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)12h后，收集細胞并裂解，取上清液，經酶標儀測定樣品。Caspase水解底物的pNA吸光度為樣品A405減去空白對照A405。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡

將密度為5.0×105mL-1的細胞培養(yǎng)于含有蓋玻片的24孔培養(yǎng)皿中24h，4Gy γ射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)6h，加入終濃度為10μg/mL的Hoechst33342，37℃孵育30min，固定封片，于熒光顯微鏡下觀察。

培養(yǎng)轉染細胞于CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24h后，給予4Gy吸收劑量照射，照射結束后繼續(xù)培養(yǎng)6h，離心收集細胞，按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書避光染色，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.8 統計學分析

使用SPSS19.0統計軟件完成實驗數據分析，采用GraphPad Prism5軟件繪圖，計量資料結果以（xˉ±s）表示，兩組間樣本均數比較采用t檢驗，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，p＜0.05表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 輻照細胞的形態(tài)觀察

生物顯微鏡觀察經0Gy、2Gy、4Gy和8Gy γ射線照射的宮頸癌細胞形態(tài)。輻照后6h各輻射組細胞均出現不同程度的形態(tài)異常，隨著吸收劑量增加，細胞數量逐漸減少，部分細胞變圓，細胞間隙加大；隨著照后時間的延長，各輻射組細胞數量逐漸減少、變形、皺縮，漂浮細胞逐漸增加；其中4Gy照射組在輻照后12h，出現少部分細胞皺縮、變形，8Gy組在輻照后12h，已少見正常形態(tài)細胞，大部分細胞皺縮、變形（圖1）。

圖1 顯微鏡觀察輻照細胞形態(tài)Fig.1 Morphology of irradiated cells observed by microscope

2.2 輻照細胞中Daxx的表達

收取經0Gy、2Gy、4Gy和8Gy γ射線照射后12h的細胞，經Western blot檢測細胞中Daxx的表達水平，Daxx表達水平隨著吸收劑量增加而升高，4Gy組、8Gy組與0Gy組比較，差異均有統計學意義（p＜0.05，p＜0.01）（圖2）。表明Daxx表達水平與吸收劑量相關。

圖2 輻照細胞中Daxx的表達：(a)各組的Western blot條帶圖;(b)各組的蛋白表達水平；★p＜0.05，★★p＜0.01Fig.2 Expression of Daxx protein in irradiated cells:(a)representative Western blot for protein expression;(b)densitometry analysis of protein levels;★p＜0.05,★★p＜0.01

2.3 Daxx對輻照細胞增殖的影響

MTT檢測輻照12h后細胞的增殖情況，以未輻照組為對照，計算各實驗組細胞增殖抑制率。轉染Daxx的輻照細胞組明顯高于其對應的未輻照組、空質粒輻照組以及正常細胞輻照組，差異均有統計學意義（p＜0.01）（圖3）。提示Daxx有利于輻照導致的細胞增殖抑制。

圖3 MTT檢測Daxx對輻照細胞的增殖抑制的影響；★★p＜0.01Fig.3 Proliferation inhibition of Daxx protein on irradiated cells by MTT;★★p＜0.01

2.4 Daxx對輻照細胞Caspase-8活性的影響

ELISA檢測輻照后12h各組細胞的Caspase-8相對活性。轉染Daxx的輻照組細胞的A405值明顯高于其對應的未輻照細胞組、空質粒輻照組以及正常細胞輻照組，差異均有統計學意義（p＜0.05）（圖4）。提示Daxx能增強輻照細胞Caspase-8的相對活性。

2.5 Daxx對輻照細胞凋亡的影響

熒光顯微鏡觀察輻照12h后細胞的凋亡。輻照組核固縮細胞的比例高于未輻照組，其中轉染Daxx的輻照組核固縮細胞最高（圖5）。

圖5 熒光顯微鏡觀察輻照細胞凋亡形態(tài)Fig.5 Apoptotic morphology of irradiated cells observed by fluorescence microscope

流式細胞術檢測發(fā)現，轉染Daxx的輻照組的細胞凋亡率明顯高于其對應的未輻照組、空質粒輻照組以及正常細胞輻照組，差異均有統計學意義（p＜0.05）（圖6）。提示Daxx參與輻照細胞的凋亡。

圖6 流式細胞術檢測Daxx對輻照細胞凋亡的影響：(a)各組的代表性流式細胞圖；(b)各組的凋亡率；★p＜0.05Fig.6 Daxx protein on apoptosis of irradiated cells detected by flow cytometry:(a)representative flow cytometry data;(b)apoptotic rate;★p＜0.05

3 討論與結論

放射治療已經成為治療宮頸癌的主要手段之一，約80%的宮頸癌患者接受單獨或聯合的放射治療，尤其對不能手術的Ⅱ期以下或晚期宮頸癌患者，可取得較為理想的效果。Daxx在細胞中的不同表達情況有可能導致細胞的生長與凋亡不同。有研究認為，Daxx在胰腺神經內分泌腫瘤組織病變中出現基因突變［7］或表達缺失［8］；在泌尿道上皮組織癌細胞中，Daxx的分布區(qū)域及其核分布區(qū)域的大小都有變化［9］；食管鱗癌組織內Daxx的定位和表達與臨床患者的生存指數密切相關［10］。

本研究結果顯示：Daxx表達水平隨著吸收劑量增加而升高，由此推測Daxx參與細胞中輻照引發(fā)某些生物學效應；而過表達Daxx能明顯上調輻照細胞的Caspase-8活性，促進細胞凋亡。有研究表明：增強Caspase-8與Fas-Daxx之間的相互作用能促進細胞凋亡［11］。Caspase-8是Fas/FasL系統的重要效應子。經典的Fas誘導的細胞凋亡途徑是Fas受體通過FADD-Caspase-8通路及其下游的Caspase家族成員而實現的。因為FADD（Fas相關死亡結構域）能夠與Caspase-8（或-10）前體蛋白結合形成死亡誘導信號復合物（DISC），激活Caspase-8（或-10），進一步激活Caspase級聯，導致細胞凋亡［12］，故Daxx通過與Fas受體結合，激活級聯酶，誘導細胞凋亡［13］。有研究表明：在輻射條件下，γ干擾素誘導的溶酶體巰基還原酶（GILT）可通過上調Daxx表達而抑制盒配對基因3，從而誘導自噬，增加人黑色素瘤細胞死亡［14］。Daxx對0.7Gy電離輻射誘導的腫瘤也具有抑制作用［4］。高表達果蠅的Daxx樣蛋白，能有效通過Daxx-ASK1-JNK途徑誘導凋亡，而該蛋白的缺失增強了對氧化應激以及UV照射的抵抗作用［15］。然而，也有研究認為，在卵巢癌細胞中過表達Daxx能保護癌細胞免受X射線以及化療誘導的DNA損傷，促進癌細胞增殖，增強癌細胞對放療與化療等的抵抗性［16］。

綜上所述，在宮頸癌HeLa細胞中，Daxx能夠促進經γ射線照射的細胞凋亡，其作用機制可能是在輻照細胞內，Daxx通過正反饋Caspase-8活性，從而抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，具體的作用機制還有待進一步研究。