◎ 何旭東，徐佳寧，方維明，尹永祺

（1.揚(yáng)州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

大豆在鹽、低氧、高溫和低溫等非生物脅迫下發(fā)芽是富集γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）的有效方式[1]。但是大豆是一種敏感型作物，在脅迫下增加γ-氨基丁酸的同時(shí)其生長發(fā)育和生物產(chǎn)量也受到嚴(yán)重影響[2]。研究發(fā)現(xiàn)亞精胺（Spermidine，Spd）可直接參與抗逆境脅迫反應(yīng)等植物體內(nèi)多種生理活動(dòng)。杜紅陽等[3]證實(shí)亞精胺通過提高大豆幼苗抗氧化酶活力，降低細(xì)胞內(nèi)部丙二醛和過氧化氫含量等，進(jìn)而緩解鹽脅迫帶來的生長抑制效應(yīng)。同時(shí)，亞精胺本身即為植物γ-氨基丁酸合成途徑中多胺降解途徑的前體物質(zhì)之一[4]。因此，本論文研究不同濃度亞精胺對(duì)鹽脅迫下發(fā)芽大豆的生長、γ-氨基丁酸含量及其關(guān)鍵合成酶活性的影響，篩選出最適外源亞精胺濃度從而獲得鹽脅迫下發(fā)芽大豆富集γ-氨基丁酸的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云鶴大豆籽粒，產(chǎn)地吉林省，編號(hào)YH-NJ，于-18 ℃保存?zhèn)溆?。亞精胺和?氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Sigma公司，其他試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；BX-802發(fā)芽機(jī)（永康市貝欣五金電器廠）；PGX-150型智能光照培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大豆發(fā)芽處理

稱量籽粒飽滿、無蟲蛀、無異色的大豆，經(jīng)去離子水洗滌后浸泡于1%（v/v）次氯酸鈉水溶液中消毒15 min，消毒后用去離子水沖洗至pH中性，再置于30 ℃、大豆體積2.5倍的去離子水中避光浸泡4 h，將浸泡好的大豆置于發(fā)芽機(jī)中，于30 ℃的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。不同發(fā)芽機(jī)中培養(yǎng)液分別設(shè)以下處理：①對(duì)照（去離子水）。②鹽脅迫處理（50 mmol·L-1NaCl）。③鹽脅迫聯(lián)合亞精胺 處 理（分 別 為50 mmol·L-1NaCl+0.05 mmol·L-1、0.10 mmol·L-1和0.15 mmol·L-1亞精胺）。發(fā)芽周期為4 d，培養(yǎng)液每隔24 h更換一次，發(fā)芽結(jié)束后進(jìn)行取樣測定指標(biāo)。

1.3.2 GABA含量的測定

參照尹永祺等[5]采用高效液相色譜法進(jìn)行測定。

1.3.3 丙二醛含量的測定

丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[6]測定。

1.3.4 谷氨酸脫羧酶和氨基醛脫氫酶活性的測定

谷氨酸脫羧酶（Glutamic Acid Decarboxygenase，GAD）和氨基醛脫氫酶（Amino-Aldehyde Dehydrogenase，AMADH）是γ-氨基丁酸合成途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶，谷氨酸脫羧酶和氨基醛脫氫酶活性參照周新勇等[7]方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度亞精胺處理下發(fā)芽大豆形態(tài)、芽長和丙二醛含量變化

圖1 所示，相較單獨(dú)鹽處理組相比，施加亞精胺后大豆生長抑制得到緩解。不同濃度亞精胺緩解效果具有差異，亞精胺濃度為0.10 mmol·L-1時(shí)緩解效果優(yōu)于0.05 mmol·L-1和0.15 mmol·L-1。大豆發(fā)芽4 d后，鹽脅迫下的大豆芽長僅是對(duì)照的37.3%，經(jīng)0.10 mmol·L-1和0.15 mmol·L-1亞精胺處理后其芽長分別是單獨(dú)鹽脅迫處理的1.38倍和1.26倍（圖2）。此外，如圖3所示，鹽脅迫及其聯(lián)合0.05 mmol·L-1、0.10 mmol·L-1和0.15 mmol·L-1亞精胺處理的發(fā)芽大豆中丙二醛含量分別是對(duì)照的116%、90%、77%和68%。與鹽處理相比，外源亞精胺處理可顯著降低丙二醛含量（p＜0.05）。

圖2 NaCl脅迫下外源Spd處理對(duì)發(fā)芽大豆芽長的影響圖

圖3 NaCl脅迫下外源Spd處理對(duì)發(fā)芽大豆丙二醛含量的影響圖

2.2 不同濃度亞精胺處理下發(fā)芽大豆GABA合成關(guān)鍵酶活性變化

谷氨酸脫羧酶（GAD）和氨基醛脫氫酶（AMADH）分別是植物GABA合成兩條途徑（GABA支路和多胺降解途徑）中的關(guān)鍵酶。圖4顯示，大豆經(jīng)鹽脅迫及其 聯(lián) 合0.05 mmol·L-1、0.10 mmol·L-1和0.15 mmol·L-1亞精胺處理后其GAD活性分別是對(duì)照的324%、363%、609%和446%。經(jīng)0.10 mmol·L-1亞精胺處理的發(fā)芽大豆中GAD活性顯著提高，是對(duì)照處理的1.68倍。

圖4 NaCl脅迫下外源Spd處理對(duì)發(fā)芽大豆GAD活性的影響圖

由圖5可看出，相較對(duì)照處理，NaCl及其聯(lián)合Spd處理下大豆中AMADH活性均顯著增加（p<0.05）。NaCl脅 迫 下 分 別 經(jīng)0.05 mmol·L-1、0.10 mmol·L-1和0.15 mmol·L-1Spd處理的大豆中AMADH活力分別是單獨(dú)NaCl處理的107%、124%和137%。

圖5 NaCl脅迫下外源Spd處理對(duì)發(fā)芽大豆AMADH活性的影響圖

2.3 不同濃度亞精胺處理下發(fā)芽大豆GABA含量變化

由圖6可知，大豆發(fā)芽4 d后較對(duì)照相比，鹽脅迫及其聯(lián)合亞精胺處理的大豆中GABA含量均顯著增增加（p＜0.05），分別是對(duì)照的165%、172%、226%和201%。0.10 mmol·L-1亞精胺處理的大豆中GABA含量最高，含量達(dá)1.171 mg·g-1DW。

圖6 NaCl脅迫下外源Spd處理對(duì)發(fā)芽大豆GABA含量的影響圖

3 結(jié)論

鹽脅迫聯(lián)合0.10 mmol·L-1亞精胺處理的大豆發(fā)芽4 d是富集γ-氨基丁酸的最佳工藝條件，γ-氨基丁酸含量達(dá)1.171 mg·g-1DW。