沙海濱 尹麗娥 馬榮峰 徐佳鴻

(1勝利油田中心醫(yī)院，山東 東營 257000；2山東省省立醫(yī)院)

喉癌是成人頭頸部常見的一種惡性腫瘤，喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)是該病主要的病理類型。目前研究認(rèn)為喉癌是多種因素共同作用產(chǎn)生的結(jié)果，吸煙、飲酒、空氣污染、病毒感染、性激素是其主要危險(xiǎn)因素，這些危險(xiǎn)因素引起了機(jī)體組織細(xì)胞內(nèi)癌癥相關(guān)因子的異常進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生〔1,2〕。miRNA是長度為23 nt左右的非編碼類RNA分子，且其能與靶基因mRNA 3′非翻譯區(qū)的的特異性相結(jié)合，并經(jīng)過負(fù)性調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而參與到細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷徙等生物學(xué)的行為。因此其與多種疾病發(fā)生和發(fā)展緊密相關(guān)〔3,4〕。miR-126是一種位于表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7的第7個(gè)內(nèi)含子內(nèi)的miRNA，在癌癥中表達(dá)失調(diào)，并與腫瘤的血管生成、癌細(xì)胞增殖、侵襲、耐藥等過程密切相關(guān)。目前研究顯示miR-126在喉癌組織中低表達(dá)〔5,6〕，但具體機(jī)制未知，因此本研究分析miR-126對(duì)Hep2喉鱗狀細(xì)胞的遷移及侵襲能力產(chǎn)生的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均從美國Gibco公司購入；檢測(cè)BCA蛋白濃度的試劑盒從南通碧云天生物公司購入；miR-126 mimics及miR-126 NC均從上海吉馬生物公司購入；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)、鋅指結(jié)合蛋白(ZEB)1蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化(p)-AKT及甘油醛-3的磷酸脫氫酶(GAPDH)相關(guān)多克隆抗體從美國的Abcam公司購入；用于提取Trizol總RNA的試劑盒和LipofectamineTM3000脂質(zhì)體及反轉(zhuǎn)錄的試劑盒均從大連寶生物公司購入。Applied Biosystems7500型PCR儀從美國的ABI公司購入；NanoDrop ND-2000C型微量紫外分光光度計(jì)從美國的Thermo公司購入；Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀從美國的Beckman Coulter公司購入；ChemiDocTMXRS型凝膠成像系統(tǒng)從美國的伯樂公司購入。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 由中科院上海細(xì)胞庫提供細(xì)胞轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌的Hep2細(xì)胞。用無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基對(duì)LipofectamineTM3000和miR-126 mimics(miR-126 mimics組)及miR-126 NC(miR-126 NC組)進(jìn)行常規(guī)稀釋，將稀釋之后的LipofectamineTM3000同miRNA混勻，并在室溫的環(huán)境中放置約30 min，形成miRNA-LipofectamineTM3000的復(fù)合物。在肝癌細(xì)胞中加入復(fù)合物，并培養(yǎng)6 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加以10%的胎牛血清并培養(yǎng)48 h,使用Realtime-PCR法對(duì)細(xì)胞中miR-126的表達(dá)實(shí)施檢測(cè)。

1.3miR-126檢測(cè) 使用Realtime-PCR法對(duì)Hep2細(xì)胞中miR-126 的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并收集細(xì)胞，使用Trizol法對(duì)細(xì)胞總RNA實(shí)施提取，采用光度計(jì)對(duì)RNA純度進(jìn)行計(jì)測(cè)，若OD260nm/OD280nm=1.8時(shí)，則說明RNA的純度良好，且將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將cDNA作為模板，放置于熒光定量PCR儀上施以檢測(cè)，將U6記作內(nèi)參，計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)miR-126的相對(duì)表達(dá)量。

1.4細(xì)胞活力檢測(cè) 將Hep2細(xì)胞小心地平鋪于96孔板上，使用MTT法對(duì)細(xì)胞的活力進(jìn)行檢測(cè)，并培養(yǎng)24 h，根據(jù)“1.2”轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48 h，48 h后加入MTT后繼續(xù)孵育4 h，然后去除上清液，同時(shí)每孔細(xì)胞中放入150 μl的二甲基亞砜，以溶解結(jié)晶物，在波長560 nm處對(duì)OD值進(jìn)行測(cè)定。

1.5細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)1 d后的細(xì)胞與transwell上室接種，且下室不予接種，加入10%的胎牛血清培養(yǎng)基，并培養(yǎng)48 h，48 h之后提取出小室。使用棉簽將上室細(xì)胞輕輕擦去，而下室細(xì)胞則采用多聚甲醛進(jìn)行固定，使用1%的結(jié)晶紫對(duì)其染色，并放置于200倍的顯微鏡下，以觀察和計(jì)數(shù)穿越濾膜的有關(guān)細(xì)胞，計(jì)數(shù)后取平均值為細(xì)胞遷移的數(shù)目。

1.6transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 基質(zhì)膠用DMEM培養(yǎng)液稀釋好，并平鋪于8 μm的transwell上室。將轉(zhuǎn)染1 d之后的有關(guān)細(xì)胞置于transwell上室內(nèi)接種，且下室不予接種，加入10%的胎牛血清培養(yǎng)基，并培養(yǎng)48 h，而后提取出小室。使用棉簽將上室細(xì)胞輕輕擦去，而下室細(xì)胞則采用多聚甲醛進(jìn)行固定，使用1%的結(jié)晶紫對(duì)其染色，并放置于200倍的顯微鏡下，以觀察和計(jì)數(shù)穿越濾膜的有關(guān)細(xì)胞，計(jì)數(shù)后取平均值為細(xì)胞遷移的數(shù)目。

1.7Western印跡法對(duì)細(xì)胞中蛋白表達(dá)進(jìn)行檢驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)之后細(xì)胞的培養(yǎng)皿放置于冰上，接著刮下細(xì)胞，并將含有蛋白酶抑制劑(PMSF)的液裂解細(xì)胞加入培養(yǎng)皿中，放置于4℃的環(huán)境中離心30 min，并收集其上清液。并對(duì)蛋白濃度的定量進(jìn)行測(cè)定，樣品上樣之后，跑十二烷基苯磺酸鈉的凝膠電泳，且轉(zhuǎn)膜約30 min。加入5%脫脂奶粉后，在室溫的環(huán)境下孵育1 h，一抗在溶液4℃的環(huán)境下過夜孵育，次日在室溫的環(huán)境下孵育二抗，將化學(xué)發(fā)光的試劑加于膜上，在凝膠成像的系統(tǒng)中曝光，分析目的為蛋白條帶的灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-126 mimics轉(zhuǎn)染情況 Realtime PCR測(cè)定的結(jié)果顯示：miR-126 mimics組中miR-126的表達(dá)量(2.28±0.23)顯著高于miR-126 NC組(1.00±0.12，P<0.05)。

2.2miR-126對(duì)Hep2細(xì)胞活力和遷移能力及侵襲能力的作用 MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：miR-126 mimics組細(xì)胞活力為(0.38±0.04)，明顯低于miR-126 NC組(0.57±0.06，P<0.05)。transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：miR-126 mimics組〔(38.43±3.84)個(gè)〕細(xì)胞遷移數(shù)目顯著少于miR-126 NC組〔(158.68±15.87)個(gè)，P<0.05〕；miR-126 mimics組〔(44.29±4.43)個(gè)〕細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著少于miR-126 NC組〔(199.36±18.40)個(gè)，P<0.05〕。見圖1、圖2。

圖1 miR-126對(duì)Hep2細(xì)胞遷移能力的影響(×200)

圖2 miR-126對(duì)Hep2細(xì)胞侵襲能力的影響(×200)

2.3miR-126對(duì)Hep2細(xì)胞中MMP2、MMP9、Snail、ZEB1蛋白表達(dá)的影響 Western印跡miR-126 mimics組MMP2、MMP9、Snail、ZEB1蛋白表達(dá)量均顯著低于miR-126 NC組(P<0.05)。見圖3、表1。

圖3 miR-126對(duì)Hep2細(xì)胞中MMP2、MMP9、Snail、ZEB1蛋白表達(dá)的影響

表1 miR-126對(duì)Hep2細(xì)胞中MMP2、MMP9、Snail、ZEB1、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)的影響

2.4miR-126對(duì)Hep2細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 miR-126 mimics組PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)量均顯著低于miR-126 NC組(P<0.05)。見表1、圖4。

圖4 miR-126對(duì)Hep2細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

miR-126是從小鼠心臟和小腦中發(fā)現(xiàn)的一種位于表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7的第7個(gè)內(nèi)含子內(nèi)的miRNA，定位于人染色體9q34.3上。miR-126在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，miR-126在胚胎組織、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)具有高度特異性，特別是對(duì)于心血管系統(tǒng)的特異性最高〔7～9〕。miR-126在心臟、肺等血管豐富的組織中高表達(dá)，而在大多數(shù)腫瘤組織中低表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔7～9〕。miR-126在腫瘤的診斷、預(yù)后等方面具有重要意義。目前研究顯示miR-126通過調(diào)控如趨化因子受體4、人類溶質(zhì)載體家族7成員5等參與多種信號(hào)通路的調(diào)控作用〔7～9〕。魏梅等〔5〕研究表明miR-126的高表達(dá)可以提高男性喉癌患者的總生存率，這種作用可能是通過其靶基因調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝及凋亡過程實(shí)現(xiàn)的。Sun等〔6〕研究證實(shí)miR-126在喉癌患者的血漿中表達(dá)量顯著下調(diào)，并與腫瘤的分化程度密切相關(guān)，而且通過抑制鈣調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白抗體(Camsap)1表達(dá)參與喉癌的轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果說明miRNA轉(zhuǎn)染成功。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-126 mimics能顯著降低Hep2細(xì)胞活力,transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-126 mimics能顯著抑制Hep2細(xì)胞的遷移及侵襲能力，這些結(jié)果同在非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞〔10〕和膠質(zhì)瘤細(xì)胞〔11〕中miR-126的作用是相同的，提示miR-126的過表達(dá)可以抑制Hep2的細(xì)胞活力、遷移及侵襲能力。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是喉癌患者術(shù)后預(yù)后不良的重要原因，因此抑制癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移對(duì)于預(yù)后的改善具有重要意義。MMPs是一種幾乎能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)所有成分的鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，在組織重構(gòu)、血管生成、器官的發(fā)生發(fā)育、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞遷移等過程中發(fā)揮重要作用。Snail是近些年發(fā)現(xiàn)的一種定位于人染色體20q12.3的鋅轉(zhuǎn)錄因子，是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)的關(guān)鍵蛋白，在胚胎發(fā)育、傷口愈合、細(xì)胞的遷移侵襲、EMT的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。ZEB蛋白為核轉(zhuǎn)錄因子，含有ZEB1和ZEB2。ZEB1位于機(jī)體10號(hào)染色體的短臂，可以對(duì)高達(dá)32種miRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄〔12,13〕。研究表明ZEB1是EMT中非常重要的調(diào)控因子，對(duì)EMT的發(fā)生有促進(jìn)作用。本文結(jié)果顯示miR-126的過表達(dá)可以有效下調(diào)MMP2、MMP9、Snail、ZEB1的表達(dá)，可以對(duì)Hep2細(xì)胞的遷移及侵襲有效抑制。

PI3K/AKT信號(hào)通路別名為抗凋亡的信號(hào)通路，可以高度激活與多數(shù)的腫瘤組織中〔14,15〕。若PI3K被其上游生長的因子進(jìn)行刺激后，可以使磷脂酰二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)3′羥基獲得磷酸化，同時(shí)轉(zhuǎn)化為三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，使AKT的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化，在絲氨酸/蘇氨酸的位點(diǎn)磷酸化，活化的AKT對(duì)下游靶蛋白的表達(dá)施以進(jìn)一步的調(diào)控，并參與細(xì)胞增殖和血管生成、侵襲及遷移等生物學(xué)的行為〔14,15〕。因此本研究進(jìn)一步探討miR-126對(duì)Hep2細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路緊密相關(guān)蛋白的表達(dá)生成的影響，結(jié)果顯示miR-126過表達(dá)可以降低PI3K和p-AKT表達(dá)，進(jìn)而對(duì)Hep2細(xì)胞的遷移及侵襲進(jìn)行抑制。