邵延萱 羅文哲 張輝

(佳木斯大學(xué) 1臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，2018年的一項(xiàng)研究表明，全球胃癌的新發(fā)病例約為100萬例，死亡人數(shù)亦達(dá)到7.83萬例，分別位列所有惡性腫瘤的第五位和第三位〔1～3〕。

槲皮素又稱槲皮黃素，是一種廣泛存在于多種蔬菜和水果中的天然醇羥基黃酮類化合物，其在紅洋蔥、石榴、藕、紅提和芒果等食物中含量居多〔4〕。作為一種重要的多酚化合物，槲皮素具有廣泛的生物學(xué)和藥物學(xué)功效，主要包括抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗衰老、降糖和保護(hù)心血管等作用〔5〕。已有大量研究證實(shí)，槲皮素可經(jīng)不同的信號通路顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡〔6～9〕。如一項(xiàng)有關(guān)肺癌的研究報道，不同濃度的槲皮素均可顯著抑制A549、H1299和H460腫瘤細(xì)胞的活性，并誘導(dǎo)這些細(xì)胞發(fā)生凋亡，且該作用與其上調(diào)腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員6(FAS)、TNFR1等細(xì)胞死亡和凋亡相關(guān)通路基因和下調(diào)核因子(NF)-κB、蛋白激酶B(AKT)等細(xì)胞存活相關(guān)通路基因的表達(dá)有關(guān)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)通過研究不同濃度槲皮素對胃癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，探討和明確槲皮素治療胃癌的抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞、試劑、材料及儀器 SCG7901人胃癌細(xì)胞系購自美國模式菌種收集中心(ATCC)；槲皮素購自金穗生物公司；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)皿、離心管和Transwell細(xì)胞小室購自美國Corning公司；放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液、30%丙烯酰胺單體貯液、青鏈霉素雙抗購自碧云天生物技術(shù)公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自北京索萊寶科技有限公司；苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑購自北京百奧萊博科技有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Milipore公司；鼠抗p53單克隆抗體購自美國Abways公司；鼠抗β-肌動蛋白(actin)單克隆抗體購自北京中杉金橋公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑購自美國Thermo Fisher公司；cDNA第一鏈合成試劑盒和熒光定量試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；全自動化學(xué)發(fā)光圖像采集及分析系統(tǒng)購自上海天能公司；電泳儀、電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽購自北京六一生物科技有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱和全自動多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；倒置光學(xué)顯微鏡購自德國蔡司公司；高速冷凍離心機(jī)購自德國貝克曼公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將SCG7901人胃癌細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后接種于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃含5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對數(shù)生長期后，對細(xì)胞進(jìn)行消化、計數(shù)和分組，并將各組細(xì)胞分別重懸于含槲皮素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，對照組和槲皮素組培養(yǎng)基中的槲皮素終濃度分別為0、20、40和60 μmol/L。

1.3細(xì)胞增殖 將處于對數(shù)生長期的SCG7901人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板的各孔中，每孔接種的細(xì)胞數(shù)為2×103個；將培養(yǎng)孔中的細(xì)胞隨機(jī)分為對照組和槲皮素組，每組設(shè)5個復(fù)孔，各組細(xì)胞分別用含終濃度為0、20、40和60 μmol/L 槲皮素的100 μl RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)；在細(xì)胞于37℃含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h的各時間點(diǎn)上，分別棄除培養(yǎng)基，并向各孔中加入110 μl含10% CCK-8試劑的完全培養(yǎng)基；隨后將細(xì)胞培養(yǎng)孔板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h；最后利用酶標(biāo)儀讀取各孔板培養(yǎng)基在450 nm波長處的吸光度值，該值反映細(xì)胞活性和增殖情況。

1.4細(xì)胞遷移 將處于對數(shù)生長期的SCG7901人胃癌細(xì)胞分為對照組和槲皮素組，將2×104個細(xì)胞重置于100 μl培養(yǎng)基中接種于每個transwell上室中，各組所用的培養(yǎng)基分別為含終濃度為0、20、40、60 μmol/L槲皮素的無FBS RPMI1640培養(yǎng)基；各組transwell下室中為600 μl含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素RPMI1640完全培養(yǎng)基；將transwell單元在37℃含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；取出transwell單元，用醫(yī)用棉簽小心擦拭掉上室上表面未遷移的細(xì)胞；磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，將上室置于70%的乙醇固定液中于室溫環(huán)境下對細(xì)胞進(jìn)行固定30 min；用0.5%結(jié)晶紫染液于室溫環(huán)境下對遷移細(xì)胞進(jìn)行染色；自來水沖洗、晾干后，將tranwell遷移膜在顯微鏡下觀察、拍照和計數(shù)，每個膜隨機(jī)選擇5個視野的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 將細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)提取總RAN和定量后，合成cDNA第一鏈，利用熒光定量試劑盒和熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR并同時描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng)用融解曲線對各樣本的目的基因產(chǎn)物、非特異產(chǎn)物和引物二聚體進(jìn)行區(qū)分。分別計算目的基因p53和內(nèi)參基因β-actin的Ct值，應(yīng)用2-ΔΔCt法對p53的mRNA表達(dá)量進(jìn)行計算，公式為：ΔCt=Ct(p53)-Ct(β-actin)。

1.6Western印跡 將處于對數(shù)生長期的SCG7901人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板的各孔中，每孔接種的細(xì)胞數(shù)為1×106個；將培養(yǎng)孔中的細(xì)胞隨機(jī)分為對照組和槲皮素組，各組培養(yǎng)基分別為1 ml含終濃度為0、20、40和60 μmol/L槲皮素的RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)；細(xì)胞在37℃含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，棄除培養(yǎng)基后，用PBS清洗3次；向每孔中加入200 μl含1% PMSF的RIPA蛋白裂解液；劇烈吹打裂解細(xì)胞后，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移入離心管中；在4℃環(huán)境下將離心管于高速離心中機(jī)離心20 min(15 000 r /min)；吸取上清液并利用BCA蛋白定量試劑盒測定裂解液中各樣本蛋白濃度；配制12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠；分別將30 μg各組樣本總蛋白加入不同凝膠泳道中進(jìn)行垂直電泳；利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜，并用5%脫脂奶封閉液進(jìn)行室溫封閉1 h；PBS-吐溫(T)清洗3次后，將轉(zhuǎn)印膜分別置于p53(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)抗體稀釋液中，并在4℃冰箱中撫育過夜；次日，PBS-T清洗3次后，將轉(zhuǎn)印膜置于HRP標(biāo)記的二抗稀釋液中，并在37℃中孵育30 min；PBS-T清洗3次后，利用ECL和全自動化學(xué)發(fā)光圖像采集及分析系統(tǒng)對目的蛋白條帶進(jìn)行顯影并測定光密度值，以β-actin作為內(nèi)參對目的蛋白進(jìn)行半定量。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1槲皮素抑制SCG7901人胃癌細(xì)胞的增殖能力 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，與對照組比較，40、60 μmol/L槲皮素組細(xì)胞的增殖能力顯著降低；在48和72 h后，20、40、60 μmol/L槲皮素組細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.05;P<0.01)。見表1。

表1 不同濃度槲皮素不同培養(yǎng)時間影響SCG7901細(xì)胞增殖能力

2.2槲皮素抑制SCG7901人胃癌細(xì)胞的遷移能力 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，0、20、40、60 μmol/L槲皮素組細(xì)胞的遷移數(shù)分別為(356.00±26.99)個、(310.00±25.06)個、(261.20±19.08)個和(212.80±10.92)個。與對照組比較，20、40、60 μmol/L槲皮素組遷移細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.01)。40 μmol/L槲皮素組遷移細(xì)胞數(shù)顯著低于20 μmol/L槲皮素組(P<0.05)，60 μmol/L槲皮素組遷移細(xì)胞數(shù)顯著低于40 μmol/L槲皮素組(P<0.01)?？梢?，槲皮素抑制SCG7901細(xì)胞遷移能力具有劑量依賴性。

2.3槲皮素上調(diào)SCG7901人胃癌細(xì)胞p53 mRNA和蛋白表達(dá) 實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明，槲皮素處理SCG7901細(xì)胞后，與對照組相比，24 h后，60 μmol/L槲皮素組細(xì)胞p53 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高，48和72 h后各濃度槲皮素組的p53 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增高(P<0.05；P<0.01)。見表2、3。

表2 培養(yǎng)不同時間不同濃度槲皮素影響SCG7901細(xì)胞p53 mRNA表達(dá)

表3 不同濃度槲皮素影響SCG7901細(xì)胞p53 蛋白表達(dá)

3 討 論

研究已證實(shí)，槲皮素對人體多種腫瘤細(xì)胞均具有抑癌活性，包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等〔11〕。與以往研究結(jié)果相似，本研究表明不同濃度的槲皮素可顯著抑制人SCG7901胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，且槲皮素可在mRNA和蛋白水平上調(diào)SCG7901細(xì)胞腫瘤抑制基因p53的表達(dá)。

p53是一個與人類多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的重要基因，它位于染色體17p13，包括突變型和野生型兩類〔12〕。功能研究證實(shí)，p53基因可通過形成一個四聚體轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而抑制和(或)活化下游目標(biāo)基因來發(fā)揮生物學(xué)作用，這些作用涉及細(xì)胞分化、凋亡、免疫應(yīng)答、癌癥發(fā)生、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和DNA功能等多個方面〔13〕。目前認(rèn)為，野生型p53是一種腫瘤抑制基因，而突變型p53則具有促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力〔12〕。研究證實(shí)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激損傷時(如DNA損傷)，野生型p53可精確控制細(xì)胞周期并誘導(dǎo)發(fā)生損傷的細(xì)胞以凋亡形式死亡〔14〕。野生型p53對細(xì)胞凋亡的影響與其通過與促凋亡基因Bax啟動子區(qū)發(fā)生特異性結(jié)合來轉(zhuǎn)錄激活Bax基因有關(guān)〔15〕。野生型p53對細(xì)胞周期的調(diào)控主要是通過誘導(dǎo)激活其下游產(chǎn)物p21，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期素依賴激酶(CDK)的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞周期阻滯于G1期〔16〕。此外，研究顯示野生型p53還可激活細(xì)胞衰老相關(guān)信號通路，在抗腫瘤藥物奧沙利鉑治療大腸癌中發(fā)揮重要作用〔17〕。然而，當(dāng)p53基因發(fā)生突變或損傷后，可產(chǎn)生突變型p53，后者可促進(jìn)受損DNA發(fā)生凝聚，結(jié)果會使細(xì)胞發(fā)生異常轉(zhuǎn)化甚至發(fā)展為腫瘤〔14〕。實(shí)驗(yàn)表明，在不同的腫瘤組織中，p53基因均可發(fā)生不同程度的突變，且其在胃癌和胰腺癌等消化系統(tǒng)腫瘤中的突變率可達(dá)50%左右〔18〕。此外，研究證實(shí)p53基因在子宮頸癌患者中突變率也高達(dá)50%～65%，且突變型p53陽性且強(qiáng)表達(dá)的癌組織侵襲能力更強(qiáng)〔14，19〕。

大量研究已證實(shí)p53基因在槲皮素發(fā)揮抗腫瘤活性中具有重要作用〔20～23〕。如在宮頸癌的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，槲皮素可誘導(dǎo)HeLa和SiHa細(xì)胞G2期阻滯和細(xì)胞凋亡，增加p53下游兩個效應(yīng)物p21基因的轉(zhuǎn)錄和促凋亡Bax蛋白的水平，同時還發(fā)現(xiàn)伴有p53及其核信號的增加〔23〕。綜上，槲皮素可顯著抑制SCG7901胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，該機(jī)制是通過其活化和上調(diào)p53腫瘤抑制基因，并進(jìn)而影響腫瘤惡性進(jìn)程得以實(shí)現(xiàn)的。