朱杰華 杜文勝 陳莉 陳光紅 羅軍敏

(遵義醫(yī)科大學(xué) 1附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，貴州 遵義 563000；2檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室)

肺結(jié)核(TB)是一種由結(jié)核分枝桿菌侵及肺部而引起的慢性傳染病，在我國患病率較高，近年來由于耐藥菌株數(shù)量的不斷增加，給TB治療帶來新的挑戰(zhàn)〔1〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度超過200個(gè)核苷酸的RNA分子，可參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程〔2〕。有研究發(fā)現(xiàn)LINC00943參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展，可能成為潛在的治療靶點(diǎn)〔3〕。然而，LINC00943在TB中的作用機(jī)制尚未明確。微小RNA(miRNA)是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可通過靶向作用于靶基因的3′-UTR，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，且可調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程〔4〕。既往研究表明，miRNA在宿主-致病原作用網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用，可調(diào)節(jié)感染后細(xì)胞免疫反應(yīng)及限制細(xì)菌增殖〔5〕。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p在TB患者和結(jié)核分枝桿菌感染的細(xì)胞中高表達(dá)，參與TB的發(fā)生發(fā)展〔6〕。本研究通過使用結(jié)核分枝桿菌感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞構(gòu)建TB體外細(xì)胞模型，旨在探討LINC00943對TB體外細(xì)胞模型細(xì)胞遷移能力的影響，為TB治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑 小鼠巨噬細(xì)胞(MH-S細(xì)胞系)和結(jié)核分枝桿菌(H37Ra菌株)均購自美國ATCC；胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素及RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；LINC00943的野生型(LINC00943-WT)和突變型(LINC00943-MUT)熒光素酶報(bào)告載體均由北京易科潘搏生物科技有限公司構(gòu)建；pmirGLO熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)質(zhì)粒購自上海海吉浩格生物科技有限公司；LINC00943小干擾RNA(si-LINC00943)及陰性對照小干擾RNA(si-NC)由吉瑪生物科技有限公司合成；miR-125b-5p模擬物(miR-125b-5p mi)及陰性對照寡核苷酸(miR-NC)均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因載體(pmirGLO載體)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Promega公司；miScfipt SYBR Green PCR Kit miRNA定量擴(kuò)增反應(yīng)體系，購自德國Qiagen公司；一抗熱休克蛋白(HSP)65(ab92416)，二抗山羊抗鼠IgG H&L(FITC)(ab6785)均購自英國Abcam公司；ProFlex PCR 系統(tǒng)購自美國ThermoFisher公司；FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠巨噬細(xì)胞MH-S置于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3模型構(gòu)建及轉(zhuǎn)染前分組 將MH-S細(xì)胞隨機(jī)分為對照組和模型組，對照組常規(guī)培養(yǎng)；模型組細(xì)胞使用感染復(fù)數(shù)為10的H37Ra菌株感染，在感染后4 h用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3次，并加入新鮮的完全培養(yǎng)基中。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后分組 使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑并根據(jù)操作說明將si-NC、si-LINC00943、miR-NC miR-125b-5p mi轉(zhuǎn)染至MH-S細(xì)胞，并依次設(shè)為si-NC組、si-LINC00943組、miR-NC組、miR-125b-5p mi組，其中miR-NC組、miR-125b-5p mi組僅用于雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。

1.5激光共聚焦顯微鏡下觀察MH-S細(xì)胞感染細(xì)菌情況 細(xì)胞感染方法同1.3。感染H37Ra后，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞 15 min，滴加山羊血清封閉液室溫封閉20 min，加入一抗(稀釋度1∶1 500)4℃過夜，而后加入綠色熒光標(biāo)記的二抗(稀釋度1∶500)室溫孵育2 h，封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，使用 Image J軟件分析細(xì)菌熒光強(qiáng)度。

1.6劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 將細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到100%融合度時(shí)，用10 μl無菌槍頭在6孔板中央劃痕，用PBS沖洗細(xì)胞殘?jiān)?～3次，在無血清培養(yǎng)基，37℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、24 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕愈合情況。細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。每組細(xì)胞做3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LINC00943與miR-125b-5p的結(jié)合關(guān)系 采用生物信息軟件starbase在線預(yù)測LINC00943的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC00943和miR-125b-5p含有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，隨后對二者的靶向關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。分別將含有LINC00943-WT和LINC00943-MUT的熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染進(jìn)MH-S細(xì)胞中，隨后將miR-125b-5p mi或miR-NC共轉(zhuǎn)染至MH-S細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h，收集各組細(xì)胞檢測熒光素酶活性。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-125b-5p的表達(dá)量 取MH-S細(xì)胞，按照說明書要求采用TRIzol試劑提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用miScfipt SYBR Green PCR Kit miRNA定量擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。實(shí)時(shí)PCR條件為：95℃預(yù)變性8 min，隨后以93℃ 15 s、 55℃ 30 s和72℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-125b-5p的相對表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1敲低LINC00943對MH-S細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌熒光強(qiáng)度和細(xì)胞感染比例的影響 與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌熒光強(qiáng)度及細(xì)胞感染比例顯著增加(P<0.01)；與si-NC組相比，si-LINC00943組細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌熒光強(qiáng)度及細(xì)胞感染比例顯著降低(P<0.05，P<0.001)，說明MH-S細(xì)胞感染H37Ra菌株的模型建立成功。見圖1和表1。

表1 各組細(xì)菌熒光強(qiáng)度比較

2.2敲低LINC00943對MH-S細(xì)胞遷移能力的影響 與對照組〔(23.54±2.67)%〕相比，模型組細(xì)胞遷移率〔(64.15±2.32)%〕顯著提高(P<0.001)；與si-NC組〔(62.77±1.64)%〕相比，si-LINC00943組細(xì)胞遷移率〔(43.56±4.75)%〕顯著降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移(×100)

2.3雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LINC00943與miR-125b-5p的結(jié)合關(guān)系 starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測LINC00943與miR-125b-5p存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-125b-5p mi組中含LINC00943-WT熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，而miR-125b-5p mi組中含LINC00943-WT熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性無差異(P>0.05)，見表2。

表2 各組熒光素酶活性比較

圖3 LINC00943含有與miR-125b-5p互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)

2.4LINC00943對miR-125b-5p表達(dá)水平的影響 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-LINC00943組中miR-125b-5p的表達(dá)水平(1.56±0.09)較si-NC組(0.98±0.11)顯著增加(P<0.01)。

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，而肺泡巨噬細(xì)胞是其主要的宿主和靶細(xì)胞〔7〕。近年來LncRNA的生物功能被探索與研究，發(fā)現(xiàn)其功能和基因表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔8〕。如在帕金森病中，敲低LINC00943可提高M(jìn)PP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞的細(xì)胞活力及抑制細(xì)胞凋亡，并通過miR-15b-5p/RAB3IP軸減輕炎癥性和氧化性神經(jīng)元損傷〔9〕；其他研究報(bào)道也發(fā)現(xiàn)，敲低LINC00943可通過調(diào)節(jié)miR-7-5p/CXCL1212軸減輕MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，LINC00943可作為帕金森病的治療靶點(diǎn)〔10〕。另外，LINC00943在胃癌中高表達(dá)，并與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，敲低LINC00943可抑制胃癌細(xì)胞增殖，通過靶向miR-101-3p調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖和化學(xué)敏感性〔11〕。本研究結(jié)果說明敲低LINC00943對MH-S細(xì)胞的染菌能力及遷移能力均有抑制作用。

LncRNA可作為miRNA的“分子海綿”而降低miRNA豐度，并與miRNA競爭性結(jié)合〔12,13〕。miR-125b-5p是一類miRNA，研究表明其可作為抑癌基因參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展〔14〕。既往研究表明miR-125b-5p在結(jié)核分枝桿菌BCG感染的RAW264.7巨噬細(xì)胞中顯著上調(diào)，并通過靶向DRAM2抑制細(xì)胞自噬〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)LINC00943可與miR-125b-5p靶向結(jié)合，且敲低LINC00943可顯著促進(jìn)miR-125b-5p的表達(dá)。