郭改艷 舒麗莎

(1河北北方學院，河北 張家口 075000； 2河北北方學院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科)

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤中其發(fā)病率和死亡率僅次于乳腺癌〔1〕。盡管在臨床上采用先進的放射和化學療法技術，由于宮頸癌患者局部復發(fā)和遠處轉移，目前患者的預后仍然不理想〔2〕。近年來，長鏈非編碼RNA(LncRNAs)是一組長度超過200個核苷酸的RNA，缺乏蛋白質編碼能力，可以調節(jié)基因轉率、翻譯和翻譯后修飾〔3〕。LncRNAs參與許多細胞功能，包括增殖、分化、遷移、侵襲和凋亡〔4〕。LncRNAs在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的生物學作用已被廣泛研究，一些LncRNA可作為預測預后或有望成為惡性腫瘤診斷的生物標志物〔5,6〕。LncRNA BLACAT1在多種癌癥中異常表達，包括膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、結直腸癌和宮頸癌等〔7～9〕。有薈萃分析表明BLACAT1高表達可預測總生存期縮短、TNM晚期、腫瘤分極差及淋巴結轉移〔10〕。LncRNA BLACAT1在卵巢癌組織和細胞中過表達，敲降BLACAT1通過調節(jié)Wnt/β-catenin通路抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲〔11〕。LncRNA BLACAT1在宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展的生物學作用尚未闡釋清楚。

miR-519d在宮頸癌組織和細胞中低表達。過表達miR-519d通過靶向HIF-2α抑制宮頸癌細胞增殖，促進細胞凋亡〔12〕。敲降miR-519d通過靶向Smad7促進宮頸癌的發(fā)生和轉移〔13〕。敲降BLACAT1通過調節(jié)miR-519d/Wnt/β-catenin通路抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲〔11〕。目前，關于BLACAT1通過調節(jié)miR-519d影響宮頸癌細胞生物學功能的研究尚未報道。本研究旨在探討B(tài)LACAT1在宮頸癌細胞中的表達和生物學功能的分子作用機制，為臨床宮頸癌早期診斷和治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1組織樣本 收集2018年1月至2019年10月12例來自河北北方學院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科的宮頸癌組織及配對的癌旁組織樣本，保存在液氮中。所有患者已確診為宮頸癌，且手術前未進行放化療等新輔助治療，患者家屬簽署本研究知情同意書，并經(jīng)倫理委員會同意。

1.2細胞系、主要試劑與儀器 人正常宮頸上皮細胞(End1/E6E7)和人宮頸癌細胞系(C33a、Caski、SiHa和HeLa)均購于中科院上海細胞研究所。NC shRNA、LncRNA BLACAT1、NC、miR-519d mimics轉染試劑盒購于上海吉瑪生物公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國 Hyclone公司。Trizol試劑、SYBR Green Qpcr Super Mix、Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司。Transwell細胞板、基質膠為美國BD公司。CCK-8試劑盒購于武漢華美公司。雙熒光素酶報告基因試劑盒和報告基因載體購于Promega公司?？贵wE-鈣黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)購于美國CST。酶標儀、PCR儀、凝膠成像儀均于買美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3細胞培養(yǎng)與轉染 人正常宮頸上皮細胞(End1/E6E7)和人宮頸癌細胞系(C33a、Caski、SiHa和HeLa)添加含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放入CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長到對數(shù)生長期時，傳代，接種6孔板，以備轉染實驗。

細胞轉染實驗Lipofectamine 2000慢病毒包裝質粒 NC shRNA、LncRNA BLACAT1、NC、miR-519d mimics分別轉染到HeLa細胞中。

1.4實時熒光定量PCR 收集宮頸癌組織及癌旁組織和細胞，用TRizol法提取總RNA。逆轉錄得到cDNA作為模板，SYBR Green Qpcr Super Mix 進行RT-PCR檢測。采用2-△△Ct法計算差異表達量。引物序列為BLACAT1-正義鏈： 5′-GCTGGAGTTTGTCCTGTCT-3′，BLACAT1-反義鏈： 5′-CTCATCGCCACCTGTTAT-3′；U6 snRNA-正義鏈:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 snRNA-反義鏈:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；hsa-miR-519d-正義鏈：5′-AAGTGCCTCCCTTTAGAGTGGT-3′，hsa-miR-519d-反義鏈： 5′-GGTGCA-GGGTCCGAGGTAT-3′。

1.5CCK-8檢測細胞增殖 將對數(shù)生長期的HeLa細胞接種于96孔板，每個實驗設計3個復孔。分組轉染后，在24、48、72 h加入10 μl CCK-8試劑，放回培養(yǎng)箱，2 h后拿出進行酶標儀檢測450 nm的吸光度(OD)值。

1.6Transwell檢測細胞遷移與侵襲 將轉染過的HeLa細胞，接種在Transwell小室的上室，細胞濃度為3×105個/ml，下室加10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，進行結晶紫染色，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，干燥，200倍倒置顯微鏡觀察。細胞侵襲能力在小室里加入基質膠。其他步驟與遷移實驗步驟相同。

1.7Western印跡檢測蛋白表達 細胞轉染后，用細胞蛋白提取試劑盒提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量。計算等量蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，然后將蛋白轉膜。加入5%脫脂牛奶封膜1 h，加入一抗放4℃冰箱過夜，一抗?jié)舛菶-cadherin(1 000∶1)、N-cadherin(800∶1)、Vimentin(1 500∶1)、GAPHD(500∶1)。洗膜，加入二抗，洗膜，加入化學發(fā)光劑進行顯影蛋白。采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度。

1.8熒光素酶報告基因驗證LncRNA BLACAT1與miR-519d靶向關系 HeLa細胞轉染后處于對數(shù)生長期時接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后，擴增LncRNA BLACAT1與miR-519d結合片段并導入到熒光素酶載體中構建野生型質粒。將其結合片段進行核苷酸突變，即為突變型質粒。參照Lipofectamine 2000操作說明進行轉染NC，miR-519d mimic，培養(yǎng)24 h后，收集細胞。根據(jù)雙熒光素酶試劑盒說明書進行染色，酶標儀檢測螢火蟲和海腎熒光活性值。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1LncRNA BLACAT1在宮頸癌組織中的表達 與癌旁組織(1.02±0.09)相比，LncRNA BLACAT1在宮頸癌組織中的mRNA表達水平(6.13±0.27)升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=62.20，P=0.000)。

2.2LncRNA BLACAT1在宮頸癌細胞系中高表達 與End1/E6E7細胞(1.00±0.06)相比，LncRNA BLACAT1在宮頸癌細胞系(C33a、SiHa、Caski和 HeLa)中mRNA表達水平(2.19±0.20、3.53±0.17、4.27±0.21、5.09±0.19)顯著升高(t=8.34、17.73、22.92、28.66，均P=0.000)，且HeLa細胞中LncRNA BLACAT1的mRNA表達水平最高。

2.3敲降LncRNA BLACAT1抑制宮頸癌細胞增殖 與NC shRNA組(1.03±0.05)相比，BLACAT1 shRNA組中LncRNA BLACAT1 mRNA表達水平(0.41±0.02)顯著降低(t=19.94，P=0.000)。與NC shRNA組相比，BLACAT1 shRNA組在24、48、72 h時細胞活力顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 敲降LncRNA BLACAT1對宮頸癌細胞活力的影響

2.4敲降LncRNA BLACAT1抑制宮頸癌細胞遷移與轉移 與NC shRNA組相比，BLACAT1 shRNA組中HeLa細胞遷移與侵襲細胞數(shù)目降低，差異有統(tǒng)計學意義(均P=0.000)。見圖1，表2。

表2 敲降LncRNA BLACAT1對宮頸癌細胞遷移與侵襲的影響個)

圖1 敲降LncRNA BLACAT1對宮頸癌細胞遷移與侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

2.5各組N-cadherin、Vimentin及E-cdaherin蛋白表達比較 與NC shRNA組相比，BLACAT1 shRNA組N-cadherin和Vimentin蛋白水平顯著減少，E-cadherin蛋白水平顯著增加(P<0.01)。見表3。

表3 敲降LncRNA BLACAT1后對宮頸癌細胞內E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達量的影響

2.6LncRNA BLACAT1靶向調節(jié)miR-519d 通過Stabase 2在線分析軟件預測miR-519d可能是LncRNA BLACAT1的靶基因。野生型組(WT)中，過表達miR-519d 熒光素酶活性(0.45±0.02)顯著低于NC組(0.98±0.03)，差異有統(tǒng)計學意義(t=25.46，P=0.001)。與NC shRNA組(0.49±0.11)相比，BLACAT1 shRNA組中miR-519d表達水平(0.98±0.12)顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.214,P=0.003)。

3 討 論

迄今為止，在宮頸癌的預防、診斷和治療方面取得了相當大的進展〔14〕。但由于宮頸癌的轉移和復發(fā)，傳統(tǒng)手術、放射治療和化療對患者的治療仍然有限〔15〕。如果宮頸癌患者可得到早期診斷和早期治療，5年生存率可高達90%〔16〕。然而，宮頸癌的早期癥狀并不明顯。70%的宮頸癌患者都是女性，中晚期約占總發(fā)病率的31%，宮頸癌經(jīng)治療后會復發(fā)，且預后極差〔17,18〕。因此，尋找有效的治療靶點和預后標志物是宮頸癌診斷和治療的迫切需要

LncRNAs是一種新的基因表達調控因子，在各種疾病病理生理過程中起關鍵作用。近年來，LncRNAs已成為多種人類惡性腫瘤的研究熱點〔19〕。先前研究表明LncRNA BLACAT1在多種腫瘤中過度表達，如乳腺癌〔20〕、頭頸鱗癌〔21〕和骨肉瘤癌〔22〕。然而，BLACAT1在宮頸癌中的作用尚不清楚。目前發(fā)現(xiàn)BLACAT1在宮頸癌組織和細胞中的表達異常增加。LncRNAs在細胞增殖、遷移和侵襲中的作用已被廣泛報道〔23,24〕。據(jù)報道在小鼠體內，BLACAT1基因敲除降低了胃癌腫瘤的生長〔25〕。研究報道BLACAT1基因敲除可抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔26〕。本文結果表明，敲降BLACAT抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲，表明BLACAT1在癌癥進展中起抑癌基因的作用。

LncRNAs可能作為miRNAs發(fā)揮作用“海綿”來減弱不同miRNAs的水平。例如：LncRNA LIPE-As1在宮頸癌組織中過表達，可以預測宮頸癌的生存率低，通過調節(jié)miR-195-5p/MAPK促進癌細胞增殖與轉移〔27〕。有研究報道過表達miR-519d通過靶向HIF-2α抑制宮頸癌細胞增殖，促進細胞凋亡〔12〕。敲降miR-519d通過靶向Smad7促進宮頸癌的發(fā)生和轉移〔13〕。因此，敲降BLACAT1可能通過調節(jié)miR-519d抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上，BLACAT1在宮頸癌組織和細胞中表達上調，通過靶向負調節(jié)miR-519d參與宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲功能。本研究為BLACAT1在宮頸癌中生物學功能提供了理論基礎，為宮頸癌早期診斷和治療提供科學依據(jù)。