楊曉煒 劉鳳海 刁慧杰 石文秀 姚立巖

(牡丹江醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，黑龍江 牡丹江 157011)

缺血性腦卒中常伴不同程度的感覺、運動和認知功能等障礙，其致殘和致死性很高〔1，2〕。缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的重要病理過程。炎癥反應是造成缺血再灌注損傷的重要機制〔3〕。腫瘤壞死因子(TNF)-α是近年新發(fā)現的具有多種生物學效應的炎癥因子，參與缺血性腦卒中的炎癥免疫過程。TNF-α 是炎癥反應的始動因子，在腦缺血再灌注早期，TNF-α合成和釋放增加是促進缺血性腦卒中形成的重要原因〔4〕。因此，抗TNF-α等抗炎治療成為缺血性腦卒中治療的研究熱點。然而，抗炎治療在臨床實踐中卻常常達不到預期效果。如能探明 TNF-α 在腦缺血中損傷保護的平衡點及關鍵點，讓其在最適宜的時間發(fā)揮其最有利的作用對臨床缺血性腦卒中的治療將極為重要〔5〕。

抗TNF-α干預方法很多，益賽普〔注射用重組人Ⅱ型TNF受體-抗體融合蛋白(rhTNFR：Fc)〕是目前國內使用最廣泛的一種 TNF-α 拮抗劑，益賽普是細胞表面 TNF-α 受體的競爭性抑制劑，可以抑制 TNF-α 生物活性，從而阻斷 TNF-α介導的細胞反應〔6〕。益賽普在臨床上已長期應用，其抗炎效果及安全性比較可靠。本研究在建立了大鼠局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO/R)〔7〕基礎上，以益賽普作為抗TNF-α的干預用藥，于大鼠腦缺血再灌注不同時程嘗試用益賽普干預缺血再灌注后的腦損傷，并將各時點干預效果與常規(guī)用藥阿托伐他汀對比，論證最有效的干預時機及干預效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級健康老年雄性SD大鼠，224只，體重300～350 g。 溫度(25±1)℃，濕度50%±10%，自由覓食飲水，適應性飼養(yǎng)7 d后進行實驗。

1.2主要儀器和試劑

1.2.1主要儀器 -80℃冰箱(Haier 青島)、-20℃冰箱(Haier 青島)、4℃低速離心機(AXTDL5M-II 上海)、酶標儀(Bio-Rad Laboratories 上海)、微量加樣器(Research plus 德國)、分析天平(FA1204B 上海)、干燥箱(DZF 上海)。

1.2.2主要試劑 注射用重組人Ⅱ型TNF受體-抗體融合蛋白 (上海中信國健藥業(yè)有限公司)、阿托伐他汀：純度大于99.19%(廣東陽江制藥廠有限公司)、大鼠TNF-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、 TTC染色劑(Solarbio 北京索萊寶科技有限公司)、多聚甲醛、甲醛、磷酸鹽緩沖液(PBS)、生理鹽水。

1.3大鼠MCAO/R模型制作 大鼠禁食12 h且禁水6 h后，10%的水合氯醛(0.30 ml/100 g)腹腔注射麻醉，采用改良MCAO法，將直徑為0.26 mm的線栓預先經多聚賴氨酸浸漬，60℃烘干處理，處理后置入大鼠右側頸內動脈(CA)18～22 mm(根據動物大小調整插入線栓的深度)，阻塞右側大腦中動脈，記錄梗阻開始時間，固定外端的線栓縫合皮膚并標記留在皮膚外面線栓。大鼠未蘇醒時注意保暖。缺血2 h后，拔出線栓約10 mm，確保線栓退至頸總動脈分杈處，實現腦缺血再灌注。模型成功的標志：參照Longa等〔8〕的方法，對各組進行神經行為學評分：0分，無神經缺損癥狀；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，出現同側Horner征，行走時向對側轉圈；3分，站立不穩(wěn)，向對側傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。評分在1～3分的大鼠認為模型制作成功，納入實驗分組。操作過程中出現迷走神經損傷、線栓置入失敗或蛛網膜下隙出血、術后24 h 內出現感染的大鼠為造模失敗。造模失敗按照隨機抽樣原則補齊動物并重新造模。

1.4動物分組 隨機將大鼠分為6組：模型組16只，造模后3、6、12、24、48、72 h神經評分；內眥取血，測血清TNF-α；72 h取腦，其中8只測腦梗死體積比，另外8只測腦含水量。健康對照組16只，除不造模外其他操作同模型組。假手術組16只，除手術過程不插線外其他操作同模型組。預注射組16只，模型制備前0.5 h大鼠皮下注射益賽普0.6 mg/kg。TNF-α干預組80只，造模后將大鼠隨機分為5個亞組，每組16只。分別為造模后3、6、12、24、48 h組。每組于相應時點一次性經皮下注射益賽普0.6 mg/kg進行干預。他汀干預組80只，分組方式及指標測定同TNF-α干預組。干預方式為經腹腔注射阿托伐他汀20 mg/kg。

1.5神經行為評分 腦缺血再灌注后3、6、12、24、48、72 h分別對各組進行神經功能損害評分，評分標準參照Longa等〔8〕的方法，提起鼠尾離開地面33 cm左右，觀察兩前肢的伸展狀況；大鼠置于地面，觀察其行走情況。分數越高，說明其神經行為損傷越重。

1.6梗死范圍的確定 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.30 ml/100 g)〔9〕，斷頭取腦。將腦組織標本置于-20℃冰箱中20 min取出，切去額端1.0 mm，由前向后每隔2.0 mm作冠狀切片，共切5片。放置于1%TTC磷酸緩沖液(0.23 mol/L，pH7.5)中，37.5℃避光孵育，每隔15 min翻面一次，共孵育30 min。正常組織顯示出紅色，梗死組織顯示為白色。染色后數碼相機拍照，使用ImageJ圖像分析系統計算梗死體積。大鼠腦梗死體積百分比=(正常側大腦半球體積-梗死側非梗死區(qū)大腦半球的體積)/正常側大腦半球體積〔10〕。

1.7腦組織含水量測定 冰浴中斷頭，取右腦，除去小腦和低位腦干、嗅球，立即用分析天平稱其濕重。置160℃烤箱內，24 h后稱干重，以計算含水量。公式如下：含水量=(濕重-干重)/濕重×100%〔11〕。

1.8血樣處理及炎癥因子的測定 動物處死前各時點采用眼內眥靜脈叢取血，每次取血1～2 ml，室溫靜置2 h左右，將血樣4℃3 000 r/min，離心10 min。分離出血清，置于-80℃冰箱保存。檢測時按試劑盒說明書采用ELISA檢測血清TNF-α。

1.9統計處理 應用SPSS19.0 軟件進行t檢驗，方差分析，單因素方差分析，LSD-t檢驗，Dunnett-T檢驗。

2 結 果

2.1益賽普對腦缺血再灌注損傷的預防作用 大鼠腦缺血再灌注后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h間的TNF-α濃度有統計學差異(F=44.876，P=0.000)，健康對照組、假手術組、模型組、預注射組的TNF-α濃度有統計學差異(F=155.648，P=0.000)，健康對照組、假手術組、模型組、預注射組的TNF-α濃度隨時點變化規(guī)律不同(F=77.632，P=0.000)。模型組TNF-α造模后迅速升高，于腦缺血再灌注3 h開始顯著高于健康對照組及假手術組(P<0.01)，于24 h達到高峰，隨后開始下降，72 h仍高于假手術組及健康對照組(P<0.01)。預注射組與模型組比較，3、6、12、24 h TNF-α的含量顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 預注射對腦缺血再灌注損傷過程中不同時點TNF-α的影響

再灌注72 h，預注射組神經功能評分顯著低于模型組(t=5.938，P<0.01)；腦含水量顯著低于模型組，顯著高于健康對照組(F=51.843，P<0.01)；梗死體積百分比顯著小于模型組(t=11.502，P<0.01)。見表2。

表2 預注射對腦缺血再灌注72 h后腦損傷的影響

2.2各時點干預對腦缺血再灌注后不同時點梗死體積百分比、腦含水量、神經功能評分的影響 腦缺血再灌注3、6、12、24 h干預效果明顯，TNF-α干預組與他汀干預組都較模型組腦梗死體積明顯減小(P<0.05)，TNF-α干預組減小腦梗死體積的作用較他汀干預組更加明顯(P<0.05)。腦缺血再灌注48 h，他汀干預組與TNF-α干預組均不能減小梗死灶(P>0.05)。見表3及圖1。3、6、12、24 h TNF-α干預組與他汀干預組均較模型組顯著減少腦含水量(P<0.05)，TNF-α干預組效果更明顯(P<0.05)，48 h TNF-α干預組、他汀干預組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。24 h內 TNF-α干預組與他汀干預組均較模型組顯著減少神經功能評分(P<0.05)，3 h、6 h TNF-α干預組效果顯著好于他汀干預組(P<0.05)，12、24 h兩干預組效果無統計學差異(P>0.05)，48 h TNF-α干預組、他汀干預組分別與模型組比較無統計學差異(P>0.05)，見表5?？梢?，在腦缺血再灌注24 h內TNF-α對腦損傷有促進作用，超過24 h該作用將不再存在，抗TNF-α治療不再有效，因此，抗TNF-α治療越早越好，總體來看，對于減小梗死灶，減輕腦水腫及恢復神經功能，TNF-α干預效果好于阿托伐他汀。

表3 各時點干預后腦缺血再灌注各時點梗死體積比較

圖1 各組腦梗死灶TTC染色

表4 各時點干預后腦缺血再灌注各時點腦含水量的比較

表5 各時點干預后腦缺血再灌注各時點神經功能評分的比較分)

3 討 論

近年來缺血性腦血管病的發(fā)病機制研究取得了很大進展〔12〕。動脈粥樣硬化(AS)是缺血性腦卒中發(fā)病的一個獨立危險因素，研究發(fā)現，AS是一個由脂質與炎癥共同作用的慢性炎癥性疾病〔13〕，炎癥可通過一系列病理，生理變化促進動脈硬化、硬化斑塊破裂及在此基礎上的血小板聚集、血栓形成，最終導致動脈阻塞。因而，腦缺血早期的炎癥反應及其損傷作用日益受到關注，成為近年研究的熱點〔14〕。TNF-α是由單核巨噬細胞產生的一種肽類激素，是機體抗感染反應出現最早和最主要的炎癥因子之一〔15〕，可激活單核/巨噬細胞、中性粒細胞等，增強其吞噬殺傷功能，促進其釋放炎癥蛋白和炎性介質，是機體免疫炎性反應的重要調節(jié)因子〔16〕。TNF-α作為致炎因子除誘發(fā)和促進炎癥以外，還可通過細胞毒性、凝血等反應及多種凋亡途徑加劇缺血后損傷〔14〕。本研究采用經典的Longa 法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，即通過顱外置入線栓造成大腦中動脈缺血，這是目前研究MCAO-R最常用模型。該模型的主要優(yōu)點是操作成功率高、可重復性好、并發(fā)癥少、一致性腦梗死效果確實，能夠更好地反映缺血性腦卒中的臨床特點及病理過程〔17〕。本研究結果提示TNF-α在缺血性腦卒中的發(fā)病機制中起著重要作用。

TNF-α對缺血性腦卒中發(fā)病的促進作用不容忽視。TNF-α是缺血性腦卒中炎癥反應的啟動物質，是炎性組織中數量較大的早期介質之一，可上調其他炎癥因子〔如白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8等〕的產生，同時激活招募單核-巨噬細胞，參與AS及缺血性腦損傷形成的全過程。TNF-α也能增加脂質信號傳導介質如前列腺素和血小板激活因子，這些因子除影響血凝過程外，還可促成血管舒縮因子的下降和內皮素(ET)的增加從而引發(fā)血管收縮，增加局部腦卒中的危險性。因而，TNF-α早期的分泌合成與增加是腦梗死形成的主要原因〔18〕，此時下調炎性因子、阻止炎癥聯級反應，將對神經細胞具有一定的保護作用〔19〕。本研究進一步驗證了TNF-α在腦缺血再灌注形成中的作用。

急性腦梗死后腦組織局部過度的炎癥反應是造成腦損傷的主要原因之一，因此，阻斷腦梗死后的炎癥反應是改善梗死后腦損傷的重要手段〔20〕。然而，TNF-α對缺血性腦損傷的作用如何還存在爭議。國內多數研究支持腦缺血后TNF-α的表達具有神經毒性。TNF-α 可上調血管內皮細胞和白細胞上的黏附分子的表達，加劇腦內炎癥反應中性粒細胞與內皮細胞之間的黏附作用，阻礙腦組織的供血，損傷局部血管，導致血管通透性增加，促使腦缺血和水腫的發(fā)生，加重缺血性腦組織的損傷〔21〕。陳紅芳等〔22〕報道腦梗死急性期血中TNF-α含量明顯升高，且與ET、一氧化氮(NO)均呈正相關，證實了升高的TNF-α不僅嚴重地破壞了NO-ET軸的正向調節(jié)作用導致其失衡狀態(tài)，而且促發(fā)和加重了腦梗死程度。TNF-α除了在炎性反應啟動和維持中的作用外，也具有終止炎癥的作用〔23〕。有研究認為，腦缺血后2～7 d，TNF-α刺激成纖維細胞、小膠質細胞和星形細胞表達神經生長因子，這有助于改善缺血狀態(tài)和神經元生存。缺血后7～30 d，通過巨噬細胞和膠質細胞產生的絲氨酸激酶、微管蛋白-2激酶等，參與損傷組織吸收、修復和重塑〔24〕。臨床研究發(fā)現，缺血性腦卒中恢復期TNF-α水平處于較高水平者預后良好，表明血清TNF-α水平的升高與發(fā)病后腦組織損傷的修復有關〔25〕，本研究發(fā)現，抗TNF-α干預在缺血性腦卒中發(fā)生24 h內干預效果顯著，且干預越早，效果越好，而在缺血再灌注損傷恢復期尤其48 h 后再施加干預則無效。由此證實，缺血性腦卒中的不同時程TNF-α發(fā)揮不同作用。急性期表現為神經毒性作用，而恢復期則可能表現為神經修復作用，其修復作用尚需進一步驗證。在腦損傷早期施加抗TNF-α干預，降低其促炎效應，可能是今后治療腦缺血的一條新的有效途徑〔19〕。