楊穎 汪銳 成薇婷

(武漢市第一醫(yī)院腫瘤科一病區(qū)，湖北 武漢 430000)

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一，每年大約180萬人被診斷為肺癌，160萬人死于肺癌，患者5年生存期為4%～17%〔1〕。非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%，靶向治療是其主要的治療方式，但患者逐漸顯現(xiàn)的耐藥性是臨床治療的主要障礙〔2〕。研究肺癌發(fā)展的分子機制，為其提供新的治療靶點或抑制劑可有效改善患者生存期。研究表明，銅代謝MURR1結構域(COMMD)8在NSCLC中高表達，參與LINC00657靶向miR-26b-5p/COMMD8信號通路，可促進NSCLC的進展〔3〕，但其具體作用機制尚未明確。COMMD8在肝癌中也表達上調(diào)，促進肝癌細胞的增殖和侵襲〔4〕。本課題以肺癌細胞H1299為主要研究對象，假設轉染si-COMMD8可抑制肺癌增殖、遷移和侵襲和促進凋亡，增強其順鉑敏感性，并對此假設進行驗證，以期為肺癌治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1材料 人正常肺上皮細胞株BEAS-2B和人肺癌細胞株H1299、SPC-A-1、H446購自ATCC；胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；PI3K/Akt信號通路通路激動劑胰島素樣生長因子(IGF)-1(HPLC≥98%)購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；順鉑(DDP)購自上海源葉生物科技有限公司，胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司；COMMD8 RNA干擾劑(si-COMMD8)和陰性對照si-con購自上海吉瑪制藥有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑Trizol、 實時熒光聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；COMMD8抗體、Ki-67抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、多藥耐藥基因(MDR)1抗體、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體、p-PI3K抗體、p-AKT抗體和β-actin抗體購自英國Abcam公司；CCK-8試劑盒及二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒及流式細胞儀購自美國BD公司，實時熒光PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將人正常肺上皮細胞株BEAS-2B培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液中，將肺癌細胞H1299、SPC-A-1和H446培養(yǎng)在含10 % FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液中均添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，將細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，洗滌消化傳代。

1.2.2Real-time PCR檢測COMMD8 mRNA的表達 收集培養(yǎng)好的BEAS-2B、H1299、SPC-A-1和H446細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，檢測cDNA的濃度和純度，置于-80℃保存。以cDNA為模板按照實時熒光PCR的說明書進行反應，合成COMMD8 mRNA。引物如下：COMMD8上游引物：5′-TGTGGTCGAGCTTATCCTGTG-3′，下游： 5′-GTGCAAGCTTTACCTGCCAA-3′。運用2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3Western印跡檢測蛋白表達 收集培養(yǎng)好的BEAS-2B、H1299、SPC-A-1和H446細胞，或轉染si-COMMD8后的H1299細胞，裂解細胞，收集細胞總蛋白，收集蛋白并用BCA法檢測蛋白濃度。然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(COMMD8抗體1∶1 000、Ki-67抗體1∶1 000、MMP-2抗體1∶3 000、MDR1抗體1∶1 000、酶切caspase-3抗體1∶2 000、p-PI3K抗體1∶1 000、p-AKT抗體1∶1 000和β-actin抗體1∶3 000)，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液洗膜3次，然后加入稀釋的辣根過氧化物酶標二抗，室溫孵育2 h，顯色，拍照。以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白相對表達水平。

1.2.4細胞轉染 將H1299細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞融合度達到70%時，按照轉染試劑說明書進行轉染si-COMMD8，以轉染si-con為對照。轉染分組：空白(NC)組(不轉染)，對照(轉染si-con)組和si-COMMD8(轉染si-COMMD8)組。si-COMMD8試驗組(轉染si-COMMD8的H1299細胞)、si-COMMD8+IGF-1(轉染si-COMMD8后用100 ng/ml IGF-1培養(yǎng)48 h)、si-COMMD8+PBS(轉染si-COMMD8加入與IGF-1等量的PBS進行培養(yǎng)48 h)，轉染48 h后收集細胞進行驗證。轉染成功后用100 ng/ml P13K/Akt信號通路激動劑IGF-1培養(yǎng)細胞48 h。

1.2.5Western印跡檢測蛋白表達 收集轉染si-COMMD8 后的H1299細胞，將細胞洗滌2次，加入RIPA裂解液重懸細胞，室溫裂解細胞20 min，冰浴超聲破碎細胞，收集蛋白并用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度。每個樣本取30 μg蛋白進行SDS-PAGE，轉膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗〔COMMD8抗體1∶1 000、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體1∶3 000、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體1∶2 000和β-actin抗體1∶4 000〕，4℃孵育過夜，洗膜3次后加入稀釋的辣根過氧化物酶標二抗，室溫孵育2 h，顯色，拍照。以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白表達水平。

1.2.6CCK-8實驗檢測細胞存活率 將轉染后或(和)IGF-1處理過的H1299細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化后將細胞稀釋為2×104個/ml，以2×103個/孔(100 μl細胞)接種于96微孔板中，加入10 μl CCK-8液體，將各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀檢測450 nm 處的吸光度(A)值。細胞存活率%=試驗組A值/對照組A值%。

1.2.7Transwell實驗檢測遷移和侵襲數(shù) 遷移實驗：將1.2.5分組的各組H1299細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集并消化細胞，用無血清培養(yǎng)液將細胞稀釋為1×106個/ml，Transwell上層小室中加入100 μl細胞，,下層培養(yǎng)孔加入500 μl含10%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，取出用棉簽拭去上層小室內(nèi)層未遷移的細胞，冰甲醛固定細胞，結晶紫染色，然后顯微鏡取5個視野計數(shù)遷移細胞，取平均值。

侵襲實驗：將液化的基質(zhì)膠以1∶4比例用4℃無血清培養(yǎng)基稀釋，稀釋后取100 μl加入上層Transwell小室，使其平鋪入上層小室，37℃放置3～5 h使其固態(tài)化，以下步驟同遷移實驗，上層加入100 μl細胞，下層加入無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，固定細胞，染色，計數(shù)侵襲細胞。

1.2.8流式細胞術測定細胞凋亡率 將1.2.5分組的各組H1299細胞收集并進行消化，取2×104個細胞置于離心管內(nèi)，根據(jù)凋亡試劑盒的說明用200 μl結合緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光10～20 min，上流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1COMMD8基因在人正常肺上皮細胞株和肺癌細胞中的表達 肺癌H446、SPC-A-1和H1299細胞中COMMD8 mRNA和蛋白水平均顯著高于BEAS-2B組(均P<0.05)，見圖1和表1。選取表達差異較大的H1299細胞進行后續(xù)實驗。

表1 檢測人正常肺上皮細胞株和肺癌細胞中COMMD8 mRNA和蛋白的表達

2.2沉默COMMD8基因抑制細胞存活和細胞遷移侵襲 NC組和si-con組COMMD8、Ki-67、MMP-2、細胞存活率、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與si-con組和NC組相比，si-COMMD8組COMMD8、Ki-67和MMP-2蛋白含量均

顯著降低(P<0.05)，細胞存活率顯著降低，遷移和侵襲細胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)，見圖2和表2。說明沉默COMMD8可抑制Ki-67和MMP-2蛋白表達，抑制H1299細胞存活、遷移和侵襲。

1～4：BEAS-2B組，SPC-A-1組，SPC-A-1組，H1299組圖1 Western印跡檢測人正常肺上皮細胞株和肺癌細胞中COMMD8蛋白的表達

表2 沉默COMMD8基因抑制細胞存活和細胞遷移侵襲及Ki-67、MMP-2蛋白的表達

2.3沉默COMMD8基因誘導增加DDP敏感性 NC組和si-con組酶切caspase-3、MDR1、DDP及凋亡率差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與si-con組和NC組相比，si-COMMD8組酶切caspase-3含量顯著升高(P<0.05)，MDR1蛋白含量顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，DDP對H1299的IC50值顯著降低(P<0.05)，見圖3，圖4，表3。說明沉默COMMD8可誘導H1299細胞凋亡并增加細胞的DDP敏感性。

1～3：NC組，si-con組,si-COMMD8組圖3 Western印跡檢測酶切caspase-3和MDR1蛋白的表達

表3 沉默COMMD8基因對凋亡、DDP敏感性及酶切caspase-3、MDR1蛋白表達的影響

2.4沉默COMMD8基因影響PI3K/AKT信號通路 NC組和si-con組p-PI3K和p-Akt蛋白差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與si-con組和NC組相比，si-COMMD8組p-PI3K和p-AKT蛋白含量均顯著降低(P<0.05)，見圖5和表4。說明沉默COMMD8可抑制H1299細胞中的PI3K/AKT信號通路。

圖5 Western印跡檢測p-PI3K和p-AKT蛋白的表達

表4 沉默COMMD8基因抑制PI3K/AKT信號通路

2.5IGF-1部分逆轉沉默COMMD8基因對肺癌細胞P13K/Akt信號通路、增殖和遷移侵襲的影響 與si-COMMD8+PBS組相比，si-COMMD8+IGF-1組，p-PI3K和p-AKT含量均顯著升高(P<0.05)，COMMD8、Ki-67和MMP-2蛋白的表達量均顯著升高(P<0.05)，細胞存活率、遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著升高(P<0.05)，見圖6和表5。說明IGF-1可逆轉沉默COMMD8對H1299細胞PI3K/AKT信號通路、增殖和遷移侵襲的影響。

1，2：si-COMMD8+PBS組,si-COMMD8+IGF-1組圖6 Western印跡檢測COMMD8、Ki-67、MMP-2、p-PI3K和p-AKT蛋白的表達

表5 IGF-1可逆轉沉默COMMD8基因對肺癌細胞PI3K/AKT信號通路及增殖和遷移侵襲的影響

2.6IGF-1部分逆轉沉默COMMD8基因對P13K/Akt信號通路、增殖和遷移侵襲的影響 與si-COMMD8+PBS組相比，si-COMMD8+IGF-1組酶切caspase-3含量顯著降低(P<0.05)，MDR1蛋白含量顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，DDP對H1299的IC50值顯著升高(P<0.05)，見圖7，圖8，表6。說明IGF-1可逆轉沉默COMMD8對H1299細胞凋亡和DDP敏感性的影響。

表6 IGF-1可逆轉沉默COMMD8基因對凋亡和DDP敏感性的影響

圖8 流式細胞術檢測同時沉默IGF-1和COMMD8后肺癌細胞凋亡

1，2：si-COMMD8+PBS組，si-COMMD8+IGF-1組圖7 Western印跡檢測酶切caspase-3和MDR1蛋白的表達

3 討 論

COMMD8是COMMD家族成員之一，COMMD家族的10個成員(COMMD1～COMMD10)在細胞內(nèi)轉運和轉錄調(diào)控中發(fā)揮關鍵作用，含有一個70～80個氨基酸的高度保守的C末端序列，稱為COMM結構域；COMMD家族成員在人多種組織中廣泛表達，可能參與銅的代謝，它們彼此形成低聚物復合物，該復合物定位于體內(nèi)隔室并介導幾個跨膜貨物的運輸〔5〕，COMMD蛋白可能通過促進核因子(NF)-κB亞基與連接酶的結合參與泛素化途徑，在細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮更廣泛的作用〔6〕。COMMD蛋白在血漿脂蛋白水平和動脈粥樣硬化的形成中也發(fā)揮重要作用〔7〕，而其表達失調(diào)也與多種疾病和癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關。研究表明，COMMD8在NSCLC中表達上調(diào)，LncRNA LINC00657通過靶向miR-26b-5p/COMMD8 促進肺癌的進展〔3〕，說明COMMD8在肺癌的發(fā)展中具有重要作用，可能是肺癌的潛在分子靶點。

NSCLC患者通常發(fā)生基因突變和癌基因的過度表達，利用突變基因和癌基因的siRNA進行靶向治療是近年來出現(xiàn)的一種新的腫瘤治療策略，它通過特異性靶向抑制與腫瘤發(fā)生和轉移相關的基因來實現(xiàn)對癌癥的抑制作用〔8〕。Mao等〔9〕研究表明，在肺癌A549和H460細胞中轉染siRNA-TMEM98能有效抑制A549和H460細胞的增殖、侵襲和遷移，細胞中MMP-2、MMP-9、RhoC和MTA1均受到顯著調(diào)節(jié)。He等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)6在人肺癌細胞中表達上調(diào)，siRNA誘導的人肺癌SPC-A1細胞中TRAF6基因敲除可抑制癌細胞侵襲，促進細胞凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)，動粒相關蛋白(KNTC)2在腫瘤中表達上調(diào)，包裹在脂質(zhì)納米粒(KNTC2-LNP)中KNTC2 siRNA在原位肝細胞癌異種移植小鼠模型體內(nèi)具有抗腫瘤活性，在肺癌異種移植瘤皮下模型中也具有抗腫瘤活性，抑制腫瘤生長〔11〕。本研究結果說明在肺癌H1299細胞中RNA干擾COMMD8具有抑制肺癌提高DDP敏感性的作用。

PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)多種細胞功能，包括細胞生長、分化、增殖、存活、運動、侵襲和細胞內(nèi)轉運等，此通路調(diào)控的失調(diào)與多種癌癥的發(fā)生和進展有關，也與NSCLC患者對EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療的抵抗和較低的生存率有關〔12〕。PI3K/AKT/mTOR通路在癌癥中通常是異常激活狀態(tài)，是攜帶EGFR激活突變的肺腺癌患者獲得性抵抗EGFR-TK抑制劑的機制之一，PI3K通路的幾種抑制劑正在臨床前和臨床研究中進行評估〔13〕。PI3K抑制劑的早期臨床研究已經(jīng)證明了初步的抗腫瘤活性和可接受的安全性〔14〕；靶向AKT也是腫瘤靶向治療的一個有效途徑〔15〕。本研究結果說明轉染si-COMMD8 可抑制PI3K/AKT信號通路；進一步研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路激動劑IGF-1處理可逆轉沉默COMMD8對H1299細胞PI3K/AKT信號通路、增殖、遷移、侵襲、凋亡及DDP敏感性的影響。